1、DNA的损伤与修复的损伤与修复The damage and repair of DNAn单个碱基的改变单个碱基的改变n双螺旋结构的异常扭曲双螺旋结构的异常扭曲DNA损伤的概念：损伤的概念：n修复修复DNA损伤的能力是生物能保持遗传稳定性损伤的能力是生物能保持遗传稳定性所在；所在；nDNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样分子的变化并不是全部都能被修复成原样的，因此生物才会有变异、有进化。的，因此生物才会有变异、有进化。DNA损伤修复的重要性损伤修复的重要性5.1 DNA损伤的原因损伤的原因5.1.1 DNA分子自发性损伤分子自发性损伤1.DNA复制中的错误复制中的错误 碱基配对的错误概率约为
2、碱基配对的错误概率约为10-1_10-2；在；在DNA聚合酶聚合酶的校对作用下，错配概率降到的校对作用下，错配概率降到10-5_10-6；再经过再经过DNA结合蛋白和其他因素作用下，结合蛋白和其他因素作用下，错配率仍错配率仍在在10-10。（1）碱基的异构互变）碱基的异构互变 DNA每种碱基有几种形式，称互变异构体，每种碱基有几种形式，称互变异构体，异构体中原子的位置及原子之间的键有所不同。异构体中原子的位置及原子之间的键有所不同。碱基各自的异构体间可以自发发生变化（烯碱基各自的异构体间可以自发发生变化（烯醇式与酮基间互变）醇式与酮基间互变）;A=C T=G 上述配对发生在上述配对发生在DNA
3、复制时，会造成子代复制时，会造成子代DNA序列与亲代序列与亲代DNA不同的错误损伤不同的错误损伤.同型异构体转换同型异构体转换=O -OH同型异构体转换同型异构体转换-NH2 -NH异构互变造成的复制损伤异构互变造成的复制损伤（2）碱基的脱氨基作用）碱基的脱氨基作用 碱基的环外氨基自发脱落，碱基的环外氨基自发脱落，C变为变为U，A变为次黄变为次黄嘌呤（嘌呤（H），），G变为黄嘌呤（变为黄嘌呤（X）。复制时，复制时，U与与A配对、配对、H和和X都与都与C配对会导致子代配对会导致子代DNA序列的错误变化。序列的错误变化。（3）脱嘌呤与脱嘧啶脱嘌呤与脱嘧啶(碱基丢失碱基丢失)自发水解使嘌呤和嘧啶从自
4、发水解使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落。链的核糖磷酸骨架上脱落。哺乳类动物细胞，在哺乳类动物细胞，在30C下，下，20h内内DNA链自发脱落嘌呤链自发脱落嘌呤约约1000个，嘧啶约个，嘧啶约500个。个。（4）活性氧引起的碱基修饰与链断裂）活性氧引起的碱基修饰与链断裂 细胞呼吸的副产物细胞呼吸的副产物O2-,H2O2造成造成DNA损伤，产损伤，产生一些碱基修饰物（胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧生一些碱基修饰物（胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等），还可引起啶等），还可引起DNA单链断裂等损伤单链断裂等损伤;这些损失这些损失的积累可导致老化。的积累可导致老化。2.物理因素引起的物理因素引起的D
5、NA损伤损伤（1）紫外线（）紫外线（UV）引起的）引起的DNA损伤损伤 DNA受到大剂量紫外线（受到大剂量紫外线（260nm）照射时，同一条链照射时，同一条链上相邻的上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体嘧啶以共价键连成二聚体；TT,CC,CT之间都之间都可形成二聚体。可形成二聚体。复制时，此处产生复制时，此处产生空耗过程，空耗过程，DNA不不能复制，细胞不能能复制，细胞不能分裂，导致凋亡。分裂，导致凋亡。紫外线引起的紫外线引起的DNA损伤损伤最易形成胸腺嘧啶二聚体（最易形成胸腺嘧啶二聚体（TT）（2）电辐射引起的）电辐射引起的DNA损伤损伤 碱基变化碱基变化 细胞中的水经辐射解离后产生大量细胞中的水
6、经辐射解离后产生大量OH-自由基，自由基，使使DNA链上的链上的碱碱基氧化修饰、形成过氧化物的、基氧化修饰、形成过氧化物的、导致导致碱碱基环的破坏和脱落等。基环的破坏和脱落等。脱氧核糖变化脱氧核糖变化 脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH-反应，导致脱氧核糖分解，最后会引起反应，导致脱氧核糖分解，最后会引起DNA链链断裂。断裂。DNA链断裂链断裂 脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而导致脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开而导致DNA链断裂。链断裂。一条链断裂称单链断裂（一条链断裂称单链断裂（single strand broken）；DNA双链在同一处或相近
7、处断裂称为双链断裂（双链在同一处或相近处断裂称为双链断裂（double strand broken）胶联胶联（binding）同一条同一条DNA链上或两条链上或两条DNA链上的链上的碱碱基间以共价键基间以共价键结合；结合；DNA与蛋白质之间也以共价键相连；组蛋白、染与蛋白质之间也以共价键相连；组蛋白、染色质中的非组蛋白、调控蛋白、与复制和转录有关的酶色质中的非组蛋白、调控蛋白、与复制和转录有关的酶都会与都会与DNA以共价键连接。以共价键连接。胶联胶联是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体是细胞受电离辐射后在显微镜下看到的染色体畸变的分子基础，会影响细胞的功能和畸变的分子基础，会影响细胞的功能
8、和DNA复制。复制。辐射引起辐射引起DNADNA分子结构的多种变化分子结构的多种变化（2）烷基剂对）烷基剂对DNA的损伤的损伤（1）碱基类似物、修饰剂对）碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤的损伤（3）嵌合剂对）嵌合剂对DNA的损伤。的损伤。3.化学因素引起的化学因素引起的DNA损伤损伤(1)碱基类似物对碱基类似物对DNA的损伤的损伤 某些化学物质和正常的碱基在结构上类似，有时会替代某些化学物质和正常的碱基在结构上类似，有时会替代正常碱基而掺入正常碱基而掺入DNA分子，一旦这些碱基类似物进人分子，一旦这些碱基类似物进人DNA后，由于它们的配对能力不同于正常碱基，便引起后，由于它们的配对能力不同于正
9、常碱基，便引起DNA复制复制过程中其对应位置上插入不正确碱基。过程中其对应位置上插入不正确碱基。例如例如 5-5-溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（BUBU）和和 5-5-溴脱氧尿嘧啶（溴脱氧尿嘧啶（BrdUBrdU）是）是T T结结构类似物。细菌在含构类似物。细菌在含BUBU的培养基中培养时，部分的培养基中培养时，部分DNADNA中的中的T T被被BUBU取代，取代，BUBU有两种互变异构体，一种是酮式结构（第有两种互变异构体，一种是酮式结构（第6 6位上有一个位上有一个酮基），它可以代替酮基），它可以代替T T而掺入而掺入DNADNA，并与并与A A配对；当配对；当BUBU发生互变异发生互变异构成为烯醇
10、式（第构成为烯醇式（第6 6位上是一个羟基）后，就容易和位上是一个羟基）后，就容易和G G配对。配对。通常以酮式存在，有时也以烯醇式存在。当通常以酮式存在，有时也以烯醇式存在。当BUBU先以酮式掺先以酮式掺入入DNADNA，继而又变成烯醇式时，进一步复制使继而又变成烯醇式时，进一步复制使DNADNA中中 A-TA-T对变成对变成 G-CG-C对。同样道理也引起对。同样道理也引起 G-CG-C向向 A-TA-T的转换，的转换，BUBU可以使细菌可以使细菌的突变率提高近万倍。的突变率提高近万倍。除除BU外，还有外，还有5-溴脱氧尿苷、溴脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、5-氯尿嘧氯尿嘧啶及它们的脱
11、氧核苷。啶及它们的脱氧核苷。另一种被广泛应用的碱基类似物是另一种被广泛应用的碱基类似物是2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-AP），），是一种腺嘌呤是一种腺嘌呤A类似物，可和胸腺嘧啶类似物，可和胸腺嘧啶T配对。可配对。可再和胞嘧啶再和胞嘧啶C 配对，配对，产生产生A-T、G-C的转换的转换，或，或2-AP以和以和胞嘧啶胞嘧啶C 配对形式进入配对形式进入DNA后再和胸腺嘧啶后再和胸腺嘧啶T 配对后产生配对后产生G-C、A-T的转换。的转换。(2)烷化剂引起的烷化剂引起的DNA损伤（特异性错配）损伤（特异性错配）某些诱变剂不掺入某些诱变剂不掺入DNA，而通过改变碱基的结构从而引起而通过改变碱基的结构从而引
12、起特异性错配，如烷化剂（是一类亲电子的化合物，具有一个或特异性错配，如烷化剂（是一类亲电子的化合物，具有一个或多个活性烷基）。它们的诱变作用是使多个活性烷基）。它们的诱变作用是使DNA中的碱基烷化。中的碱基烷化。活性烷基不稳定，能转移到其他分子的电子密度较高的位活性烷基不稳定，能转移到其他分子的电子密度较高的位置上，并置换其中的氢原子，使其成为不稳定的物质。置上，并置换其中的氢原子，使其成为不稳定的物质。烷化剂的种类很多，常见的有甲磺酸乙酯（烷化剂的种类很多，常见的有甲磺酸乙酯（EMS）、）、亚硝亚硝基胍（基胍（NG）和芥子气等。和芥子气等。EMS能使鸟嘌呤的能使鸟嘌呤的 N位置上有乙基，成为
13、位置上有乙基，成为7一乙基鸟嘌一乙基鸟嘌呤。与胸腺嘧啶配对，故呤。与胸腺嘧啶配对，故能使能使G-C转换成转换成A-T。烷化剂的另一作用是烷化剂的另一作用是脱嘌呤脱嘌呤。例如烷基在鸟嘌呤。例如烷基在鸟嘌呤N位上位上活化糖苷键引起断裂，使嘌呤从活化糖苷键引起断裂，使嘌呤从DNA链上脱掉，产生缺口。链上脱掉，产生缺口。复制时，与缺口对应的位点上可能配上任一碱基，从而引复制时，与缺口对应的位点上可能配上任一碱基，从而引起转换或颠换；而且去嘌呤后的起转换或颠换；而且去嘌呤后的DNA容易发生断裂，引起容易发生断裂，引起缺失或其他突变。缺失或其他突变。(3)嵌合剂的致突变作用。嵌合剂的致突变作用。嵌合染料是
14、另一类重要的嵌合染料是另一类重要的DNA修饰剂。包括丫啶橙修饰剂。包括丫啶橙（acridine orange）、）、原黄素（原黄素（proflavin）、）、叮黄素叮黄素（acriflavine）等染料。等染料。这些试剂为平面分子，其分子大小与碱基对大小差不这些试剂为平面分子，其分子大小与碱基对大小差不多，可以嵌入到多，可以嵌入到DNA双链碱基对之间，在嵌入位置上引起双链碱基对之间，在嵌入位置上引起单个碱基对的插入或缺失突变。嵌合染料也能嵌入单链单个碱基对的插入或缺失突变。嵌合染料也能嵌入单链DNA的碱基之间，这些突变都会引起阅读框的改变，造成的碱基之间，这些突变都会引起阅读框的改变，造成移码
15、突变。移码突变。概念：概念：由各种诱变剂诱发的由各种诱变剂诱发的DNA的突变。每一种诱变剂有其对的突变。每一种诱变剂有其对应的特异性（如对应的特异性（如对G-C，A-T转换）和对特定的突变位点的转换）和对特定的突变位点的偏好，例如：甲磺酸乙酯（偏好，例如：甲磺酸乙酯（EMS）和紫外线（）和紫外线（UV）“偏好偏好”G-C，A-T转换，黄曲霉素转换，黄曲霉素B1（AFB1）则偏好于则偏好于C-G，A-T颠换。颠换。诱变机制：诱变机制：诱变剂通过诱变剂通过3种机制诱发突变：取代种机制诱发突变：取代DNA中的一个碱基；中的一个碱基；改变一个碱基使之发生错配；破坏一个碱基使之在正常情况改变一个碱基使之
16、发生错配；破坏一个碱基使之在正常情况下无法配对。下无法配对。4.诱发突变诱发突变诱发突变与人类的癌症诱发突变与人类的癌症 黄曲霉素（黄曲霉素（AFB）引起肝癌，紫外线（）引起肝癌，紫外线（UV）照射）照射会导致皮肤癌。会导致皮肤癌。肿瘤抑制基因是一种编码抑制肿瘤形成的蛋白质肿瘤抑制基因是一种编码抑制肿瘤形成的蛋白质基因。如果发生突变则会致癌。对南非和东亚肝癌病基因。如果发生突变则会致癌。对南非和东亚肝癌病人的人的P53基因的分析发现，基因的分析发现，AFB特异性诱导特异性诱导GT颠换，颠换，引起引起P53发生突变，而在同一地区的肺癌、肠癌和乳发生突变，而在同一地区的肺癌、肠癌和乳腺癌的病人中未
17、发现此现象。腺癌的病人中未发现此现象。黄曲霉素黄曲霉素B1（aflatoxin B1，AFB1）一种很强的致癌剂。一种很强的致癌剂。在鸟嘌呤在鸟嘌呤 N7位置上形成一加成复合物后产生无嘌呤位位置上形成一加成复合物后产生无嘌呤位点。修复要求点。修复要求SOS系统参与。系统参与。SOS越过无嘌呤位点并在这些位越过无嘌呤位点并在这些位点对应处选择性插入腺嘌呤，使鸟嘌呤残基脱嘌呤的试剂偏向点对应处选择性插入腺嘌呤，使鸟嘌呤残基脱嘌呤的试剂偏向于产生于产生G-C T-A颠换。颠换。现代生活环境使人可能接触各种各样药品、化妆品、食物现代生活环境使人可能接触各种各样药品、化妆品、食物防腐剂、杀虫剂、工业用试
18、剂、污染物等，其中很多化合物已防腐剂、杀虫剂、工业用试剂、污染物等，其中很多化合物已被证明具有致癌性质。被证明具有致癌性质。研究表明在研究表明在175种已知的致癌剂中，有种已知的致癌剂中，有157种是诱变剂。这种是诱变剂。这些物质是通过诱导体细胞突变而致癌的。例如食物防腐剂些物质是通过诱导体细胞突变而致癌的。例如食物防腐剂AF-2。食物熏蒸剂二溴乙烯、抗血吸虫药物、多种染发添加剂以及工食物熏蒸剂二溴乙烯、抗血吸虫药物、多种染发添加剂以及工业化合物氯乙烯等都具致癌性。业化合物氯乙烯等都具致癌性。因而要靠科学治理环境，保护环境就是保护人类自身。因而要靠科学治理环境，保护环境就是保护人类自身。5.1
19、.2 DNA损伤的后果损伤的后果导致导致DNA分子结构变化（亦即发生突变）分子结构变化（亦即发生突变）生物体在表型上突变生物体在表型上突变1.突变类型突变类型(1)点突变（点突变（point mutation）DNA单一碱基的变异单一碱基的变异转换（转换（transition）：）：嘌呤与嘌呤、嘧啶与嘧啶之间替换嘌呤与嘌呤、嘧啶与嘧啶之间替换颠换（颠换（transvertion）：）：嘌呤与嘧啶之间的替代嘌呤与嘧啶之间的替代突变的多方向性和复等位基因突变的多方向性和复等位基因 一个基因内有很多突变位点，所以，一个基因的突变也有一个基因内有很多突变位点，所以，一个基因的突变也有多方向性，从而导致
20、一个基因可以有两个以上的等位形式多方向性，从而导致一个基因可以有两个以上的等位形式复等位基因。复等位基因。(2)缺失（缺失（deletion）/插入插入（insertion）DNA链上一个或一段核苷酸的消失或加入。链上一个或一段核苷酸的消失或加入。移码突变（移码突变（frame-shift mutation）：例如在例如在 E.coli的的lacl基因中发现一种基因中发现一种 4个碱基序列个碱基序列(CTGG)在野生型中连续重复了在野生型中连续重复了 3次。次。J.Miller等人研究了这个基因突变等人研究了这个基因突变热点（热点（hot Spots）产生的原因。发现某些热点是由重复序列引）产
21、生的原因。发现某些热点是由重复序列引起的。所谓热点即一个基因中比其他位点更容易发生突变的位起的。所谓热点即一个基因中比其他位点更容易发生突变的位点。点。由于插入或缺失突变引起由于插入或缺失突变引起DNA的阅读框（的阅读框（ORF）发生改）发生改变，从而产生不同蛋白质的过程。变，从而产生不同蛋白质的过程。(3)倒位倒位(inversion)或转位（或转位（translocation）DNA重组使其中一段核苷酸倒置，或从一处迁移到另一处。重组使其中一段核苷酸倒置，或从一处迁移到另一处。(4)双链断裂双链断裂2.突变后果突变后果（1）致死性）致死性:突变发生在对生命至关重要的基因上，突变发生在对生命
22、至关重要的基因上，可导致个体或细胞的死亡。可导致个体或细胞的死亡。致死突变：严重影响生物体生活力，导致个致死突变：严重影响生物体生活力，导致个体死亡的突变。体死亡的突变。可分为显性致死突变（杂合态即可致死）和可分为显性致死突变（杂合态即可致死）和隐性致死突变（纯合态才致死）。隐性致死突变（纯合态才致死）。（2）基因功能的改变）基因功能的改变 突变是某些疾病的发病基础突变是某些疾病的发病基础 包括遗传病、肿瘤及有遗传倾向的病。包括遗传病、肿瘤及有遗传倾向的病。有些已知其遗传缺陷所在。有些已知其遗传缺陷所在。但大多数尚在研究中。但大多数尚在研究中。突变影响生物的代谢过程，导致一个特定生突变影响生物
23、的代谢过程，导致一个特定生化功能的改变或丧失。如微生物的营养缺陷型。化功能的改变或丧失。如微生物的营养缺陷型。突变导致生物体外观上可见的形态结突变导致生物体外观上可见的形态结构的改变。例如果蝇的红眼构的改变。例如果蝇的红眼白眼突变：白眼突变：（3）突变导致基因型改变）突变导致基因型改变:这种突变只有基因型的改变，而没有可察觉的表这种突变只有基因型的改变，而没有可察觉的表型改变。型改变。多态性多态性(polymorphism)：是用来描述个体之间的基因型差别现象。利用是用来描述个体之间的基因型差别现象。利用DNA多态性分析技术，可识别个体差异和种、株间差多态性分析技术，可识别个体差异和种、株间差
24、异。异。控制一些次要性状基因即使发生突变，也不会影控制一些次要性状基因即使发生突变，也不会影响生物的正常生理活动，仍能保持其正常的生活力和响生物的正常生理活动，仍能保持其正常的生活力和繁殖力，为自然选择保留下来。繁殖力，为自然选择保留下来。突变是进化、分化的分子基础突变是进化、分化的分子基础:进化过程是突变的不断发生所造成的。没进化过程是突变的不断发生所造成的。没有突变就没有今天的五彩缤纷的世界。有突变就没有今天的五彩缤纷的世界。遗传学家认为：没有突变就不会有遗传学。遗传学家认为：没有突变就不会有遗传学。大量的突变都属于由遗传过程自然发生的，大量的突变都属于由遗传过程自然发生的，叫自发突变或自
25、然突变（叫自发突变或自然突变（spontaneous mutation）。）。5.2 DNA突变修复机制突变修复机制1.尿嘧啶糖基酶系统（复制错误的修复）尿嘧啶糖基酶系统（复制错误的修复）现象：现象：U和和A在复制中配对在复制中配对 C自发脱氨基氧化而生成自发脱氨基氧化而生成U修复机制：尿嘧啶修复机制：尿嘧啶N糖基酶系统糖基酶系统参与的酶：参与的酶：尿嘧啶尿嘧啶N糖基酶糖基酶 AP内切核酸酶内切核酸酶(AP endonucleases)DNA聚合酶聚合酶 II DNA连接酶连接酶脱嘌呤脱嘌呤/嘧啶位点（嘧啶位点（AP 位点位点)修复机制：修复机制：尿嘧啶尿嘧啶N糖基酶系统糖基酶系统2.错配修复
26、系统（错配修复系统（mismatch repair system）现象：复制中的错配；现象：复制中的错配；A的甲基化是错配修复系统的识别标记的甲基化是错配修复系统的识别标记 GA*TC；沿着新生沿着新生DNA链，有一个甲基化梯度，靠近复制叉程度链，有一个甲基化梯度，靠近复制叉程度最小，亲本链甲基化程度高且均一最小，亲本链甲基化程度高且均一修复机制：修复机制：错配修复系统错配修复系统参与的酶：参与的酶：错配矫正酶错配矫正酶 DNA聚合酶聚合酶 DNA连接酶连接酶修复机制：错配修复系统修复机制：错配修复系统修复机制：修复机制：错配修复系统错配修复系统DNA的半甲基化的半甲基化3.光修复（光修复（p
27、hotoreactivation）4.（主要对胸腺嘧啶二聚体而言）（主要对胸腺嘧啶二聚体而言）修复机制：在修复机制：在可见光可见光（300 600nm）活化之下，由光复活酶活化之下，由光复活酶（photo reactivating enzyme，PR）催化胸腺嘧啶二聚体分解为催化胸腺嘧啶二聚体分解为单体。单体。参与的酶：光复活酶（参与的酶：光复活酶（PR）光复活酶修复：波长光复活酶修复：波长400400nmnm可见光激活可见光激活 光复活是针对紫外线引起光复活是针对紫外线引起DNA损伤而形成的胸损伤而形成的胸腺嘧啶二聚体，在损伤部位进行修复的修复途径。腺嘧啶二聚体，在损伤部位进行修复的修复途径
28、。光复活作用在可见光的活化下，由光复活酶，又称光复活作用在可见光的活化下，由光复活酶，又称光解酶催化胸腺嘧啶二聚体分解成为单体。光解酶催化胸腺嘧啶二聚体分解成为单体。PR酶先与酶先与DNA链上的胸腺嘧啶二聚体结合成链上的胸腺嘧啶二聚体结合成复合物；复合物以某种方式吸收可见光，并利用光复合物；复合物以某种方式吸收可见光，并利用光能切断二聚体之间的两个能切断二聚体之间的两个C-C键，使胸腺嘧啶二聚键，使胸腺嘧啶二聚体变为两个单体，恢复正常，而后体变为两个单体，恢复正常，而后PR酶就从酶就从DNA上解离下来。上解离下来。过去认为，光复活酶存在于细菌和低等真核生物体内。研过去认为，光复活酶存在于细菌和
29、低等真核生物体内。研究发现在鸟类和有袋类中也有存在。究发现在鸟类和有袋类中也有存在。BMSutherland（1974）报道，在人类白细胞中发现光）报道，在人类白细胞中发现光复活酶。随后发现存在于人类的成纤维细胞和淋巴细胞中。说复活酶。随后发现存在于人类的成纤维细胞和淋巴细胞中。说明这种酶在生物界分布广泛，这一修复机制在哺乳动物中也起明这种酶在生物界分布广泛，这一修复机制在哺乳动物中也起重要作用。重要作用。在在Ecoli中，光复活酶（中，光复活酶（471aa）是由）是由Phr基因编码，酶基因编码，酶在暗处不能起作用，还需要其他的酶来修复在暗处不能起作用，还需要其他的酶来修复 UV损伤。在植物和
30、损伤。在植物和果蝇中也发现能逆转果蝇中也发现能逆转6-4光生成物的光解酶。光复活的修复功能光生成物的光解酶。光复活的修复功能虽然普遍存在，但主要是原核生物中的一种修复方式。虽然普遍存在，但主要是原核生物中的一种修复方式。4.切除修复切除修复(excision repair)“切补切封切补切封”一种一种修复内切酶修复内切酶识别胸腺嘧啶二聚体，并在二聚体识别胸腺嘧啶二聚体，并在二聚体前的糖磷酸骨架上作一切口；前的糖磷酸骨架上作一切口；Pol II 在在3OH末端聚合一条新的末端聚合一条新的DNA链，并同时链，并同时置换掉大约置换掉大约20个核苷酸的个核苷酸的DNA片段；片段；DNA连接酶封合新合成
31、的连接酶封合新合成的DNA片段和原有片段和原有DNA链间链间的切割。的切割。修复机制：修复机制：“切补切封切补切封”切除修复（切除修复（excision repair）也称核苷酸外切修）也称核苷酸外切修复，此系统在几种酶的协同作用下，先在损伤的任复，此系统在几种酶的协同作用下，先在损伤的任一端打开磷酸二酯键，然后外切掉一段寡核苷酸；一端打开磷酸二酯键，然后外切掉一段寡核苷酸；留下的缺口由修复性合成来填补，再由连接酶连接。留下的缺口由修复性合成来填补，再由连接酶连接。由于这些酶的作用不需可见光激活，也叫由于这些酶的作用不需可见光激活，也叫暗修暗修复复。切除修复不仅能消除由紫外线引起的损伤，也。切
32、除修复不仅能消除由紫外线引起的损伤，也能消除由电离辐射和化学诱变剂引起的其他损伤。能消除由电离辐射和化学诱变剂引起的其他损伤。切除修复一般发生在下一轮切除修复一般发生在下一轮DNA复制之前，又称复制之前，又称复复制前复制制前复制。5.重组修复（重组修复（recombination repair)这是一种越过损伤部位进行修复的途径。重组修复这是一种越过损伤部位进行修复的途径。重组修复（recombinational repair）是对尚未修复的损伤）是对尚未修复的损伤 DNA先复先复制再修复，又称制再修复，又称复制后修复复制后修复。以胸腺嘧啶二聚体为例，含有二聚体的以胸腺嘧啶二聚体为例，含有二聚
33、体的DNA仍可进行复仍可进行复制，但复制到二聚体时要暂停一下，然后越过此处障碍，制，但复制到二聚体时要暂停一下，然后越过此处障碍，在二聚体的后面又以未知的机制开始复制，这种起始复制在二聚体的后面又以未知的机制开始复制，这种起始复制可能不需引发。可能不需引发。这样在合成的子链上留下一个大缺口，而其互补链则复这样在合成的子链上留下一个大缺口，而其互补链则复制成完整的双链。然后由完整双链中的母链与带缺口的子制成完整的双链。然后由完整双链中的母链与带缺口的子链发生重组。链发生重组。重组修复重组修复 重组修复中最重要的一步是重组。重组修复中最重要的一步是重组。大肠杆菌中，当大肠杆菌中，当DNA受到损伤（
34、形成嘧啶二受到损伤（形成嘧啶二聚体时）能诱导产生一种重组蛋白，重组修复中聚体时）能诱导产生一种重组蛋白，重组修复中的重组是在这种蛋白的参与下进行的。的重组是在这种蛋白的参与下进行的。它的精确性较低，所以重组修复易产生差错，它的精确性较低，所以重组修复易产生差错，从而引起突变从而引起突变,所以又叫所以又叫突变型修复突变型修复。前面所说的光复活修复和切除修复则被认为前面所说的光复活修复和切除修复则被认为是是无误差的修复过程无误差的修复过程。6.SOS修复（应急反应）修复（应急反应）特点：一种旁路系统，允许新生特点：一种旁路系统，允许新生DNA链越过胸腺嘧啶链越过胸腺嘧啶 二聚体而生长；二聚体而生长
35、；保真度降低；保真度降低；“好死不如赖活着好死不如赖活着”SOS系统只在细胞受到严重损伤或复制系统受到抑制系统只在细胞受到严重损伤或复制系统受到抑制时才出现时才出现 参与的酶：参与的酶：recA酶酶 LexA酶酶 这个系统是在这个系统是在DNA分子受到大范围的损伤情况下分子受到大范围的损伤情况下防止细胞死亡而诱导出的一种应急措施，是使细胞通防止细胞死亡而诱导出的一种应急措施，是使细胞通过一定水平的变异来换取最后幸存手段。过一定水平的变异来换取最后幸存手段。借用国际通用的紧急呼救信号（借用国际通用的紧急呼救信号（save our souls）“SOS”命名，表示细胞受到危急状态时的修复方式。命名
36、，表示细胞受到危急状态时的修复方式。SOS反应的起始：反应的起始：v是通过是通过RecA的活化而引起。的活化而引起。v诱导信号诱导信号:可能由可能由DNA释放出的小分子组成的，或者是释放出的小分子组成的，或者是DNA本身某些结构变化。本身某些结构变化。vLexA是一种小分子蛋白（是一种小分子蛋白（22KDa），具有蛋白酶活性，），具有蛋白酶活性，是很多操纵子的阻遏物。是很多操纵子的阻遏物。vRecA的激活导致的激活导致LexA的基因产物的剪切。的基因产物的剪切。vLexA被被RecA激活后又可导致激活后又可导致LexA自我催化引起自身的裂自我催化引起自身的裂解，这样解，这样LexA的阻遏功能失
37、去了活性，并且同时诱导了的阻遏功能失去了活性，并且同时诱导了它所结合的操纵子。它所结合的操纵子。和和SOSSOS反应有关的基因，包括反应有关的基因，包括RecARecA，lexAlexA,UvrAUvrA,UvrBUvrB,umuCumuC 和和 himAhimA。RecARecA也触发细胞中其它靶物质的剪切，包括各种原噬菌体的阻遏蛋白。也触发细胞中其它靶物质的剪切，包括各种原噬菌体的阻遏蛋白。NoImage图图 SOS修复修复 由于由于SOS修复是一种错误修复，修复是一种错误修复，SOS系统可造成系统可造成很高的突变率，在哺乳动物中也有类似机制，可能与很高的突变率，在哺乳动物中也有类似机制，
38、可能与癌变有关，因此受到高度重视，对于其修复的机制还癌变有关，因此受到高度重视，对于其修复的机制还有许多问题有待于进一步研究。有许多问题有待于进一步研究。5.3 限制与修饰（限制与修饰（restriction and modification）50年代初发现细菌能将外来年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制修饰而得以保护，这种现象叫做限制修饰。实实 验：验：从从3种不同菌株繁殖
39、出来的噬菌体后代，接种到种不同菌株繁殖出来的噬菌体后代，接种到同样菌株，接种率达同样菌株，接种率达100；如接种到不同菌株上，情况便不同；如接种到不同菌株上，情况便不同；k在在B株株上接种效率只有上接种效率只有10-4，B在在 k株上也只有株上也只有10-4；如将生存下来的噬菌体接种到第一轮同样的菌如将生存下来的噬菌体接种到第一轮同样的菌株中，如株中，如k B B,则接种效率为则接种效率为100。本世纪本世纪50年代初年代初，以，以Arber等人对等人对噬菌体在大肠杆菌不噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体
40、内存在着寄生控制的限制存在着寄生控制的限制(restriction)和修饰和修饰(modification)系统。系统。restriction and modification推论：推论：含有一种限制修复系统，限制酶能够将外来含有一种限制修复系统，限制酶能够将外来DNA切断；切断；修饰酶（甲基化酶）通过将自身腺嘌呤甲基化，或将胞嘧修饰酶（甲基化酶）通过将自身腺嘌呤甲基化，或将胞嘧啶甲基化对自身啶甲基化对自身DNA进行修饰，因此不会将自身进行修饰，因此不会将自身DNA降解降解掉；掉；当外来噬菌体进入大肠杆菌后，绝大部分被限制酶所降当外来噬菌体进入大肠杆菌后，绝大部分被限制酶所降解，极少数被甲基化
41、酶所修饰而幸存下来；修饰后的噬菌解，极少数被甲基化酶所修饰而幸存下来；修饰后的噬菌体再进入大肠杆菌，不会被降解。体再进入大肠杆菌，不会被降解。细菌为对付外来细菌为对付外来DNA和保护自己和保护自己DNA而演化来的。而演化来的。1968年年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，Hind II和和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。，为基因工程技术的诞生奠定了基础。自己自己DNA:限制模式相同的限制模式相同的DNA。包括同株系的不同个体。包括同株系的不同个体DNA、寄生于其中的质粒和噬菌体。寄生于其中的质粒和噬菌体。居民居民DN
42、A(resident DNA)：同一个细胞内的不同类型的同一个细胞内的不同类型的DNA，包括细胞包括细胞DNA，质粒质粒DNA，噬菌体噬菌体DNA等。等。三类限制性内切酶：三类限制性内切酶：按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分助因子等因素划分I类限制性内切酶的特点类限制性内切酶的特点v1）I类限制性内切酶是异源多聚体，包含三个亚基类限制性内切酶是异源多聚体，包含三个亚基R、M和和S，其功能分别为限制性内切酶、甲基化酶和其功能分别为限制性内切酶、甲基化酶和DNA特异位点识别。特异位点识别。v2）I类限制性内切酶与类限制性内切酶与DNA结合依赖结
43、合依赖M亚基与辅助因子亚基与辅助因子S-腺腺苷甲硫氨酸（苷甲硫氨酸（SAM）的相互作用。的相互作用。v3）I类限制性内切酶与类限制性内切酶与DNA分子结合后，根据该位点的甲基分子结合后，根据该位点的甲基化状态发挥相应的酶活性，或修饰或切割。切割位点与识别位化状态发挥相应的酶活性，或修饰或切割。切割位点与识别位点相隔点相隔1-5kb。切割位点的序列特异性不严格。切割位点的序列特异性不严格。v4）I类限制性内切酶的种类较少，研究较多的有大肠杆菌的类限制性内切酶的种类较少，研究较多的有大肠杆菌的EcoK和和EcoB。II类限制性内切酶特点类限制性内切酶特点v II类限制性内切酶由类限制性内切酶由H.
44、O.Smith等等1970年首先在流感嗜血年首先在流感嗜血杆菌杆菌Rd型菌株中发现。型菌株中发现。vII类限制性内切酶和甲基化酶是独立的的两个酶。目前已类限制性内切酶和甲基化酶是独立的的两个酶。目前已有有400多种多种II类限制性内切酶被分离，它是分子量较小的单类限制性内切酶被分离，它是分子量较小的单体蛋白。体蛋白。v识别和切割双链识别和切割双链DNA分子时仅需要分子时仅需要Mg2+,识别和切割位点识别和切割位点在同一位置，且识别序列有严格的特异性。在同一位置，且识别序列有严格的特异性。II类限制性内切酶类限制性内切酶v 同位酶同位酶(isoschizomers)：识别位点的序列相同，切点不一
45、：识别位点的序列相同，切点不一定相同的酶类。定相同的酶类。v同尾酶同尾酶(isocandamers)：作用后产生的：作用后产生的DNA粘性末端相同，粘性末端相同，但识别位点的序列埠不一定相同的酶类。但识别位点的序列埠不一定相同的酶类。III类限制性内切酶的特点类限制性内切酶的特点v III类限制性内切酶由类限制性内切酶由R亚基和亚基和MS亚基组成，其中亚基组成，其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。v 该类酶与该类酶与DNA识别位点的结合严格依赖识别位点的结合严格依赖ATP。修饰作修饰作用和切割作用取决于两个亚基之间的竞争。修饰作用在用和切割作用取
46、决于两个亚基之间的竞争。修饰作用在识别位点内进行。切割序列位于识别位点一侧若干碱基识别位点内进行。切割序列位于识别位点一侧若干碱基对处，无序列特异性。对处，无序列特异性。核酸内切限制酶的类型及其主要特性核酸内切限制酶的类型及其主要特性特性特性I型型II型型III型型限制和修饰活性限制和修饰活性单一多功能的酶单一多功能的酶分开的核酸内切分开的核酸内切酶和甲基化酶酶和甲基化酶 具有一种共同亚基的具有一种共同亚基的双功能的酶双功能的酶核酸内切限制酶核酸内切限制酶的蛋白质结构的蛋白质结构3种不同的亚基种不同的亚基单一的成份单一的成份 2种不同的亚基种不同的亚基 切割位点切割位点在距寄主特异性位点在距寄主特异性位点至少至少700bp的地方可的地方可能随机地切割能随机地切割位于寄主特异性位于寄主特异性位点或其附近位点或其附近 距寄主特异性位点距寄主特异性位点3，端端2426bp处处甲基化作用的位甲基化作用的位点点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位寄主特异性的位点点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的识别未甲基化的序列进行核酸内序列进行核酸内切酶切割切酶切割 能能 能能能能序列特异的切割序列特异的切割不是不是是是是是DNA克隆中的用克隆中的用处处无用无用十分有用十分有用用处不大用处不大
