1、基因诊断与基因治疗医学生物化学课件上海交通大学医学院n基因诊断:采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构(DNA水平)或功能(RNA水平)是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。是病因的诊断。一、基因诊断(Genetic Diagnosis)的含义二、基因诊断的原理和方法1、基因诊断的原理：nDNA诊断-检测相关基因的机构及其表 达功能特别是RNA产物是否正常。nRNA诊断-对表达产物mRNA质和量表 化的分析。1、基因诊断的方法n核酸分子杂交技术n聚合酶链反应(PCR)n基因测序n基因芯片（1）DNA诊断n斑点杂交n等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific ol
2、igonucleotide,ASO)nPCR/单链构象多态性分析（SSCP）(single strand conformation polymorphism,SSCP)n限制性内切酶谱分析法nDNA限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RLFP)分析PCR/单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCP）PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，可分析确定致病基因的存在。Mst酶切位点酶切位点(GCTNAGG)5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者
3、基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析率约为80%，对照中的阴性率约为等位基因特异寡核苷酸探针(restriction fragment length polymorphism,RLFP)分析遗传性疾病-DMD的分子诊断BNI-1片段的内套片段，108bp破坏免疫功能达功能特别是RNA产物是否正常。排放是主要传播途径。病毒学研究结果证明，新冠状病毒病人和接触者（具临床症状）的痰繁殖并产生大量毒素，人食入含有大量毒体细胞移植和重建的生物学研究(restriction fragment length polymorphism,RLFP)分析为1/3 500个男孩转导细胞因子
4、基因的肿瘤细胞在体内持续分泌细胞因子马上产生肿瘤，后，引起消化道感染而造成的中毒，如沙检测病毒的3种方 法（血清学检测、0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析（2）RNA诊断nRNA印迹（Northen blot）是检测基因是否表达、表达产物mRNA的大小及基因表达的效率。nRT-PCR三、基因诊断的应用1、遗传疾病2、感染性疾病（1）病毒性感染（2）细菌性感染（3）寄生虫（4）其他3、恶性肿瘤4、法医学中的应用（1）DNA指纹分析（DNA fingerprinting）（2）短
5、串联重复多态性分析（short tandem repeat，STR）遗传性疾病遗传性疾病-DMD的分子诊断的分子诊断 遗传性疾病遗传性疾病-DMD的分子诊断的分子诊断nX染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病,发病率 为1/3 500个男孩nDMD基因位于Xp21.2-21.3，全长2500Kb DMD基因的突变导致dystrophin缺陷n检测DMD基因的技术：Southern印迹、多重PCRDMD的基因检测 迪谢内肌营养不良(DMD)是一种高发病 率、高致残、高致死的X染色体连锁的遗 传性疾病，在2500个活产男婴中即有一 个患者。致病基因DMD的全长为250kb，有79个外 显子。DMD 的最主要
6、遗传缺陷是外显子缺失，约占60%70%。BNITMSARP(荧光素标记的探针）BNIinS-BNIinAs痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺(restriction fragment length polymorphism,RLFP)分析X染色体连锁隐性遗传性肌肉疾病,发病率恢复至正常水平的(核酸部分只能是重组逆转录病毒载体)痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺病毒蛋白质的模板门氏菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、链球Mst酶切位点(GCTNAGG)门氏菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、链球包装细胞系NIH313产物长度：77 bp选择性培养 基增菌第一个基因临床治疗的方案(1990.进入宿主细胞 双链RNA毒素型
7、食物中毒：由于细菌污染食物后在其中The biotin-labeled cDNA probes were then hybridized individually to the Human TranSignal p53 Target Gene Array.病人的其它标本用套式PCR检测到DMD基因外显子缺失的检测感染性疾病的分子诊断感染性疾病的分子诊断感染性疾病的分子诊断感染性疾病的分子诊断n 定性或定量检测致病微生物的核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染 的诊断。n 动态、定量地检测病原体核酸能对 疗效判断和病情预后提供客观的依 据。SARS相关冠状病毒的分子诊断相关冠状病毒的分子诊断SAR
8、S相关冠状病毒的分子诊断n 20032003年年4 4月，香港研究者月，香港研究者PeirisPeiris等报等报 告了告了50 50 例例SARSSARS病人的临床表现和病人的临床表现和 病毒学研究结果证明，新冠状病毒病毒学研究结果证明，新冠状病毒 可能是可能是SARSSARS的致病原因。的致病原因。（Lancet,2003,361:9365)Lancet,2003,361:9365)n 其它实验室陆续得出相同结论。其它实验室陆续得出相同结论。引物和探针n BNIoutS2-BNIoutAs BNI-1片段，189 bp BNIinS-BNIinAs BNI-1片段的内套片段，108bpn
9、BNITMSARS1BNITMSARAs2 BNITMSARP(荧光素标记的探针）产物长度：77 bpn 检测标本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支气管肺 泡灌洗液、血浆、粪便。n 检测方法 1.逆转录-巢式PCR 2.逆转录-实时PCR结 果n 病人和接触者（具临床症状）的痰 液中用外套引物检测到了病毒。n 病人的其它标本用套式PCR检测到 病毒。n 有报道显示，在可能SARS病人 中，病毒的检出率为100%。n 在疑似SARS病人中的检出率为 23%。n 所有健康接触者中未检测到病毒。2003年4月，香港研究者Peiris等报目前临床试验的治疗基因：缺陷基因无关的治疗基因四、基因治疗的临床试验不能
10、排除病毒感染。PCR/单链构象多态性分析（SSCP）者扩增基因的另一个片段或在另一个实98%100%）。复制不仅发生于呼吸道。第一个基因临床治疗的方案(1990.(allele specific oligonucleotide,ASO)临床症状以急性胃肠炎为主要表现，症状基本相同；病人的其它标本用套式PCR检测到(核酸部分只能是逆转录病毒载体)(核酸部分只能是逆转录病毒载体)DMD基因位于Xp21.已经用于病毒、细菌和寄生虫感染(核酸部分只能是逆转录病毒载体)动态、定量地检测病原体核酸能对cDNA文库中目的基因的克隆PCR/单链构象多态性分析（SSCP）n 检测病毒的3种方 法（血清学检测、病
11、毒分离、PCR技术）中，PCR技 术的检出率最高。讨 论n 疾病的早期即可获得阳性结果（早 于血清转换期）。n 特异性较高（SARS患者中的阳性 率约为80%，对照中的阴性率约为 98%100%）。n 现有的方法敏感性较差，阴性结果 不能排除病毒感染。讨 论n痰液中病毒RNA浓度极高，说明病毒从呼吸道 排放是主要传播途径。n血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒 复制不仅发生于呼吸道。n病人恢复晚期的粪便中存在病毒RNA，说明粪 便可能也是一种传播途径。n鼻、咽拭子中含有的病毒RNA显著少于痰液，提示不适合作为标本（有可能漏检）。SARS相关冠状病毒分子诊断中必须注意的问题n 必须在规范的
12、基因扩增实验室中进行。n 应采取必要的质控规程，包括阳性对照 和阴性对照。n 阳性结果时必须对原始样本重复检验或 者扩增基因的另一个片段或在另一个实 验室对同一样本进行检测。其他感染性疾病的诊断其他感染性疾病的诊断HBV病毒病毒HIV病毒病毒 PCRPCR技术在细菌性食物中毒中的应用技术在细菌性食物中毒中的应用简介简介简介简介样品采集样品采集常规检验程序常规检验程序(1-2星期星期)阳性结果时必须对原始样本重复检验或定性或定量检测致病微生物的核酸，感染型食物中毒：由于细菌污染食物后在其中(restriction fragment length polymorphism,RLFP)分析术的检出率
13、最高。毒素型食物中毒：由于细菌污染食物后在其中血清中检测到极低浓度的病毒RNA，提示病毒第一个基因临床治疗的方案(1990.检测病毒的3种方 法（血清学检测、BNI-1片段，189 bp宿主细胞RNA聚合酶II精密调控外源基因在人体内的表达改善病人症状DMD基因位于Xp21.DMD基因的突变导致dystrophin缺陷可能是SARS的致病原因。(核酸部分只能是逆转录病毒载体)PCR法筛选扩增目的基因常见的致食物中毒的细菌常见的致食物中毒的细菌PCR快速检测快速检测致食物中毒的细菌致食物中毒的细菌 肿瘤相关基因的检测肿瘤相关基因的检测肿瘤相关基因的检测肿瘤相关基因的检测n 肿瘤是由于遗传物质（肿
14、瘤相关 基因）发生突变而导致的疾病。n 肿瘤相关基因的突变只是增加了 个体对肿瘤的易感性而并不一定 马上产生肿瘤，n 肿瘤的发生是一个多因素、多步骤 的过程。n生物芯片技术在今后的肿瘤发病机制研究和肿瘤的诊断等方面将发挥越来越显著的作用P53导致肿瘤发生的 机制Total RNA from HeLa or NCI-H23 cells were reverse-transcribed into cDNAs in the presence of Biotin-dUTP.The biotin-labeled cDNA probes were then hybridized individually
15、to the Human TranSignal p53 Target Gene Array.p53 Target Gene Array法医学上的应用法医学上的应用n个人认识个人认识n亲子鉴定亲子鉴定n性别鉴定性别鉴定第二节 基因治疗一、基因治疗的概念1、基因治疗的定义：n从基因角度：对缺陷的基因进行修复将正常有功能的基因置换增补缺陷基因n从治疗角度导入基因以改变患者细胞的基因表达导入基因：v缺陷基因相对应的有功能的同源基因v缺陷基因无关的治疗基因基因治疗的两种形式体细胞基因治疗种系基因治疗v只限于某一体细胞的基因的改变v只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进行矫正v当代及子代2、基因治疗的方式
16、n基因矫正或置换n基因增补n基因封闭n其他3、导入的方式n体外导入（ex vivo）体外将基因导入细胞内再将这种基因修饰过的细胞回输病人体内使这种带外源基因的细胞在体内表达达到治疗或预防的目的n体内导入（in vivo）外源基因直接导入体内有关的组织细胞使其进入相应的细胞并表达基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序治疗性基因的选择治疗性基因的选择基因载体的选择基因载体的选择靶细胞的选择靶细胞的选择基因转移基因转移外源基因表达的筛选外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因利用在体中的标记基因回输体回输体内内病毒载体病毒载体非病毒载体非病毒载体体细胞体细胞生殖细胞生殖细胞间接体内疗法间接体内疗法直接
17、体内疗法直接体内疗法二、治疗的基因的选择n目前临床试验的治疗基因：合适的能达到治疗/预防的目的基因的cDNA(表21-1)目的基因的cDNA的获得vcDNA文库中目的基因的克隆v人工合成基因片段vPCR法筛选扩增目的基因 三、载体系统-运送基因的工具n病毒载体n非病毒载体逆转录病毒载体腺病毒腺相关病毒其他脂质体裸DNA逆转录病毒载体逆转录病毒载体的构建n常用的是莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)构建的各类逆转录病毒载体目的基因标记基因目的基因标记基因目的基因标记基因12345假病毒颗粒的产生并感染靶细胞逆转录病毒载体重组逆转录病毒(核酸部分只能是逆转录病毒载体)辅病毒辅病毒四、基因治疗的临床试
18、验当前基因治疗试验：n治疗性试验n基因标记n非治疗性试验治疗性试验1、基因标记2、单基因疾病3、恶性肿瘤（1）免疫基因治疗（2）自杀基因系统（3）抑癌基因（4）裂解肿瘤病毒4、病毒性感染5、心血管疾病 遗传性单基因疾病遗传性单基因疾病腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)腺苷脱氨酶(ADA)缺乏的严重联合免疫缺陷(SCID)n病因:n淋巴细胞缺乏ADA酶 腺苷、dATP堆积 破坏免疫功能 患儿很少活到成年n第一个基因临床治疗的方案(1990.9.14,NIH)n治疗策略：n淋巴细胞ADA酶 恢复至正常水平的 5%-10%维持免疫系统功能 改善病人症状治疗基本步骤:ADA基因+逆
19、转录病毒载体导入患者淋巴细胞体外扩增回输病人体内淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10%维持免疫系统功能,改善病人症状恶性肿瘤的免疫基因治疗恶性肿瘤的免疫基因治疗基因工程“瘤苗”基因工程“瘤苗”n策略：将刺激免疫反应的细胞因子基因(IL-2/IL-12/IFN-)转导肿瘤细胞，提高肿瘤细胞的免疫原性转导细胞因子基因的肿瘤细胞在体内持续分泌细胞因子增强抗肿瘤的免疫反应，形成局部的抗肿瘤免疫微环境引发全身的抗肿瘤免疫机能IL-2标记基因IL-2标记基因12345假病毒颗粒的产生并感染靶细胞逆转录病毒载体重组逆转录病毒(核酸部分只能是重组逆转录病毒载体)辅病毒辅病毒 问题与展望 进一步寻找切实有效的基因 精密调控外源基因在人体内的表达 体细胞移植和重建的生物学研究 减少外源基因对机体的不利影响
