1、 中山大学附属第二医院儿科中山大学附属第二医院儿科1.发病率发病率(含杂合子含杂合子)：全世界约1.5亿人携带血红蛋白病基因 全国：异常血红蛋白0.33%-地贫 2.64%-地贫 0.66%广东：-地贫 7.3%(9.64%)-地贫 1.833.36%(3.54%)广西：-地贫 14.9%继发性-地贫 2.遗传学遗传学 珠蛋白基因簇位于珠蛋白基因簇位于16号染色体上号染色体上 珠蛋白基因簇位于珠蛋白基因簇位于11号染色体上号染色体上3.IVSI IVS 16号染色体号染色体 5 3 1 31 32 99 100 1415 3 1 2 1 Kb 0 10 20 30 4.IVS IVS 11号染
2、色体号染色体 5 3 1 30 31 104 105 146 5 3 2 G A 1 kb 0 10 20 30 40 50 60 5.全世界缺失型已达31种其中4.2(左侧缺失)和3.7(右侧缺失)缺失型是遍布全世界的类型，其余突变则随地理和人群分布的不同而异。在我国，除上述二种缺失外，尚有SEA(缺失20kb)、THAI(缺失31kb)、FIL(缺失3034kb)和2.7等。6.非缺失型非缺失型-地贫地贫目前已报道目前已报道42种种包括启动子突变、剪接点突变、移码突包括启动子突变、剪接点突变、移码突变、无义突变、终止密码子突变、变、无义突变、终止密码子突变、核苷酸信号位点改变等核苷酸信号位
3、点改变等中国人非缺失型：中国人非缺失型：HbCS终止密码子突变终止密码子突变2 TAACAA HbQO 2 CD125(Lcu Pro)其他：其他：Hb Duan，Hb westmead,Hb Hekinan,HbH-CD30,HbH-CD31,HbH-CD59 7.继发于恶性血液病/MDS机制：acquired deletion of the-globin gene cluster limited to the neoplastic clone more commonly,inactivating somatic mutations of the trans-acting chromatin
4、-associated factor ATRX,which cause dramatic down-regulation of-globin gene expression.8.-地贫地贫 以点突变为主，少数为缺失所致以点突变为主，少数为缺失所致全世界报告突变类型全世界报告突变类型170，中国，中国28种种中国常见类型：中国常见类型：(9省区检测资料省区检测资料)CD41-42(41.6%)、IVS-654(21.8%)CD17(18.0%)、TATA-nt-28(8.0%)CD71/72(+A)(3.9%)、TATA-29(1.2%)CD26(HbE)9.临床表现地贫：轻型常无临床症状或轻微
5、贫血。重型患者在婴儿期出现慢性进行性贫血、轻度黄疸（间歇性）、肝脾肿大；常有发育不良和骨骼改变，出现地中海贫血面容。中间型多在幼儿期出现贫血，其症状比重型轻。10.地贫：静止型无临床症状，轻型常无临床症状或轻微贫血。中间型（HbH）多在幼儿期或以后出现贫血、黄疸、肝脾肿大；感染常使贫血加重甚至出现溶血危象。重型多出现死胎或胎儿水肿综合征。11.实验室检查实验室检查血象：贫血为小细胞低色素性，MCV80fl，MCH28pg，MCHC32%。网织红细胞正常或增高。外周血细胞涂片染色示红细胞大小不等，中央浅染色区扩大，出现异型、靶形、碎片红细胞和有核红细胞、点彩红细胞、嗜多染性红细胞、豪-周小体等。
6、12.地贫筛查：地贫筛查：地贫5项：溶血度（脆性），正常值：60%；HbF；Hb电泳：HbA2,HbH；红细胞形态（参见上）；ZPP，以排除缺铁性贫血 地贫6项：溶血度（脆性）；Hb电泳；HbF；HbA2；MHb；G6PD活性。13.-地贫的基因诊断地贫的基因诊断 缺失型：缺失型：Southern印迹杂交限制性酶谱分析法：主要用于较大片段缺失 PCR法：法：跨越断裂点的PCR扩增法(gap-PCR)：可诊断、区分地贫1纯合子和杂合子 由gap-PCR衍生的多重PCR：一次PCR扩增能 够明确缺失突变形成的各种地贫基因型 或临床类型。14.非缺失型非缺失型Southern印迹杂交诊断法PCR-酶
7、解法：扩建酶切点法：PCR-ASO其他方法：聚合酶链反应结合单链构象多态性分析（PCR-SSCP）和变性梯度凝胶电泳（DGGE）也曾用于地贫点突变的基因分析，一般多用于点突变的研究而不是基因诊断和产前诊断。15.-地中海贫血的基因诊断地中海贫血的基因诊断PCR结合ASO探针斑点杂交技术扩增不应突变系统法（ARMS法）DNA芯片技术（DNA chip）反向点杂交（Reverse dot blot,RDB）16.与小细胞低色素性贫血的鉴别与小细胞低色素性贫血的鉴别 缺铁性贫血缺铁性贫血 感染或炎症性贫血感染或炎症性贫血 肺含铁血黄素沉着症肺含铁血黄素沉着症 铁粒幼红细胞性贫血铁粒幼红细胞性贫血 铅
8、中毒铅中毒 铜缺乏铜缺乏 先天性转铁蛋白缺乏症先天性转铁蛋白缺乏症17.缺铁性贫血缺铁性贫血 多于多于6月月2岁发病，无家族史岁发病，无家族史 不当喂养史不当喂养史 无溶血证据，网织红无溶血证据，网织红N/SI、TS、SF TIBC、FEP 骨髓内、外铁减少骨髓内、外铁减少18.慢性感染性贫血慢性感染性贫血 有感染、炎症史及相应临床表现有感染、炎症史及相应临床表现 贫血有时仅为小细胞性贫血有时仅为小细胞性 无溶血，网织红无溶血，网织红N/SI、TIBC、TS，SF、FEP 铁粒幼细胞铁粒幼细胞，外铁，外铁 19.铁粒幼红细胞性贫血铁粒幼红细胞性贫血 顽固贫血，铁剂治疗无效，个别病例母顽固贫血，
9、铁剂治疗无效，个别病例母 系系 B6治疗有效治疗有效 无溶血，网织红无溶血，网织红N/BM、外铁、外铁，铁粒幼红，铁粒幼红，可见环状，可见环状 铁粒幼红细胞铁粒幼红细胞 SI、SF、FEP、TIBC N/20.肺含铁血黄素沉着症肺含铁血黄素沉着症 发作性苍白，无力，咳嗽，痰中带血发作性苍白，无力，咳嗽，痰中带血 X线胸片肺野中可见网点状阴影线胸片肺野中可见网点状阴影 痰和胃液中可找到含铁血黄素细胞痰和胃液中可找到含铁血黄素细胞 小细胞低色素性贫血，网织红小细胞低色素性贫血，网织红 SI、TS、TIBC SR21.铅中毒铅中毒 红细胞中可见嗜碱性点彩红细胞中可见嗜碱性点彩 长骨长骨X线改变线改变
10、 FEP 铜缺乏性贫血铜缺乏性贫血 脂溢性皮炎，皮肤毛发色素少脂溢性皮炎，皮肤毛发色素少 浅表静脉扩浅表静脉扩 张，自发性骨折张，自发性骨折 精神障碍精神障碍 贫血、贫血、WBC，血铜蓝蛋白，血铜蓝蛋白22.转铁蛋白缺乏症转铁蛋白缺乏症 自幼自幼 贫血，贫血，1岁时贫血严重岁时贫血严重 肝脾轻度大，铁剂治疗无效肝脾轻度大，铁剂治疗无效 网织红网织红，BM内、外铁内、外铁 SI、TIBC、TS、SF 其他：其他：Coombs 阴性自溶阴性自溶23.*地中海贫血的预防地中海贫血的预防 人群普查人群普查 遗传咨询遗传咨询 产前诊断产前诊断24.本疗法仍是最基本治疗方法本疗法仍是最基本治疗方法 高、中
11、量输血配合铁螯合剂高、中量输血配合铁螯合剂 能活到成年并达到正常人的生活能力能活到成年并达到正常人的生活能力 缺点：缺点：需终身治疗，费用昂贵需终身治疗，费用昂贵 易出现输血副反应，尤其是输血传染病等易出现输血副反应，尤其是输血传染病等25.低量输血法：目前已不用此法低量输血法：目前已不用此法 中量输血法中量输血法(moderate transfusion)维持输血之前的维持输血之前的Hb浓度浓度90105g/L 高量输血法高量输血法(hypertransfusion):维持输血前维持输血前Hb100g/L 超量输血法超量输血法(supertransfusion)：维持输血前维持输血前Hb12
12、0 g/L26.每次输浓缩红细胞每次输浓缩红细胞1020ml/kg,每每24周周1次次 使输注后使输注后Hb浓度达浓度达130135g/L 无论何种方法，每次输注之后无论何种方法，每次输注之后Hb不能超过不能超过 150g/L 浓缩红细胞输注速度应浓缩红细胞输注速度应45ml/（kgh）重度贫血者输注的速度应更慢重度贫血者输注的速度应更慢2ml/kg h）27.铁螯合剂铁螯合剂 去铁胺去铁胺(deferoxamine,DFO)过早使用（岁）可产生骨骼畸形、生长过早使用（岁）可产生骨骼畸形、生长抑制等副作用，在规则输血年或输红细胞抑制等副作用，在规则输血年或输红细胞1020单位之后进行铁负荷的评
13、估单位之后进行铁负荷的评估28.测定血清铁蛋白测定血清铁蛋白(SF),简便可行，但影响因简便可行，但影响因 素素 较多；较多；肝穿刺后测定肝组织的铁含量，此法较准确肝穿刺后测定肝组织的铁含量，此法较准确,但属损伤性检查，一般医院难于实行；但属损伤性检查，一般医院难于实行；影像学方法如影像学方法如MRI，此法虽简便但准确度，此法虽简便但准确度 不够且费用高不够且费用高 如有铁超负荷，则开始使用铁螯合剂如有铁超负荷，则开始使用铁螯合剂(3.2mg/g干肝组织或血清铁蛋白干肝组织或血清铁蛋白29.2060mg/kg.d，每周应用，每周应用56天天长期应用以控制铁蛋白在长期应用以控制铁蛋白在10002
14、000g/L 之间为之间为 理想，采用连续皮下注射理想，采用连续皮下注射12小时，小时，或持续静脉滴注或持续静脉滴注812小时等方法小时等方法 缺点是使用较麻烦缺点是使用较麻烦,病儿依从性差，如使用病儿依从性差，如使用 不当不当(铁负荷轻而用大剂量铁负荷轻而用大剂量DFO）,可致白可致白 内障、听力丧失、长骨生长障碍等副内障、听力丧失、长骨生长障碍等副 作用作用30.deferiprone(L1)化学名羟基吡啶化学名羟基吡啶1，二齿状分子结构，二齿状分子结构 以以3:1与与Fe3+结合，结合效率差些结合，结合效率差些 吸收快，迅速转化成活性形式，排泄快吸收快，迅速转化成活性形式，排泄快 198
15、4年临床实验，年临床实验，1995年上市年上市(卬度卬度)常用量常用量75mg/kg.d 短期疗效较差，长期疗效仍有争议短期疗效较差，长期疗效仍有争议 副作用：关节痛、副作用：关节痛、(常见常见)粒细胞减少粒细胞减少(严重严重)、锌缺乏、胃肠反应、肝功能异常锌缺乏、胃肠反应、肝功能异常31.ICL670 三齿状分子结构三氮唑化合物三齿状分子结构三氮唑化合物 以以2:1与与Fe 3+结合结合 吸收快，在血循环中存活几小时吸收快，在血循环中存活几小时 效果为效果为DFO的的5倍，倍，L1的的10倍倍 剂量剂量20mg/kg.d 副作用：胃肠反应，皮疹。肝肾功能无影副作用：胃肠反应，皮疹。肝肾功能无
16、影响。动物实验肾小管上皮细胞有改变响。动物实验肾小管上皮细胞有改变(非铁非铁超负荷超负荷)32.造血干细胞移植（造血干细胞移植（HSCT）是目前能够根治重型是目前能够根治重型地贫的一种治疗方地贫的一种治疗方法法 HSCT分为骨髓移植分为骨髓移植(BMT)、脐血移植、脐血移植(UCBT)和外周血干细胞移植（和外周血干细胞移植（PBSCT）胎儿期予胎儿期予HSCT:宫内造血干细胞移植宫内造血干细胞移植(IUSCT)33.1982年首例成功年首例成功 至今全世界应用已达至今全世界应用已达1000余例余例 长期生存率达长期生存率达80 供体来源困难，费用昂贵血供体来源困难，费用昂贵血34.1989年首
17、例年首例UCBT治疗范可尼贫血成功治疗范可尼贫血成功1995年泰国治疗年泰国治疗HbE地贫获得成功地贫获得成功 1998年年1月中山二院在内地开展首例月中山二院在内地开展首例不少医院开展，总数已超过不少医院开展，总数已超过100例例 由血缘相关发展至无血缘相关由血缘相关发展至无血缘相关HLA位点由全相合发展至位点由全相合发展至13个位点不合个位点不合35.1989年治疗年治疗1例慢性白血病取得成功，例慢性白血病取得成功，血细胞分离机从外周血可采到足够的造血细胞分离机从外周血可采到足够的造血干细胞供者无需麻醉，安全血干细胞供者无需麻醉，安全 PBSCT治疗地贫国外从治疗地贫国外从1996年开始，
18、香年开始，香港港1998报告例，内地报告例，内地1999年中山二院年中山二院首例，各地陆续开展首例，各地陆续开展36.国外于国外于1996年开始报告，但至目前仅数例年开始报告，但至目前仅数例国内尚未开展国内尚未开展37.根治性基因治疗根治性基因治疗（基因矫正治疗）（基因矫正治疗）基因矫正治疗是把正常的目的基因导入体基因矫正治疗是把正常的目的基因导入体内，并达到适当、有效、持久的表达，以完内，并达到适当、有效、持久的表达，以完全取代原来的病态基因全取代原来的病态基因 地贫是地贫是珠蛋白基因的单基因缺陷遗传病，珠蛋白基因的单基因缺陷遗传病，理论上是基因治疗最理想的模型理论上是基因治疗最理想的模型
19、1984年开始基因治疗的研究，进展缓慢，其年开始基因治疗的研究，进展缓慢，其原因之一是载体问题，二是转导的原因之一是载体问题，二是转导的珠珠蛋白蛋白基因片段的大小。基因片段的大小。38.珠蛋白基因族珠蛋白基因族非常庞大，调控也非常复杂珠蛋白基因组上游基因调节元件即位点调控区(locus control region,LCR)的DNase敏感（hypersensitive,HS）片段（包括HS2、HS3、HS4）对转导后的基因表达非 常重要。39.逆转录病毒载体逆转录病毒载体常用癌瘤逆转录病毒（onco-retroviral vector）携带珠蛋白基因及其调节元件将人珠蛋白基因导入小鼠红白血病
20、(MEL)细胞进行培养,可成功表达珠蛋白在小鼠动物模型上将基因通过逆转录病毒载体转染鼠造血干细胞,在受体红细胞中获得表达。将人珠蛋白基因导入地中海贫血小鼠体内,其症状可获得部分改善40.l逆转录病毒载体有如下缺点：逆转录病毒载体有如下缺点：载体的容量有限（仅7kb左右），无法完全包含珠蛋白基因组及其上游LCR片段，因而表达效价低和不稳定；不能转染静止期细胞；病毒随机插入靶细胞的基因组中可使插入点附近的基因表达失控，插入的基因也有可能不恰当的表达；病毒可能感染宿主；致癌作用，动物实验已发现淋巴瘤发生。41.优点是：载体容量大，能包含大片段的珠蛋白基因组及其上游调节元件，保证珠蛋白基因的高效、稳定
21、表达；可以转染静止期细胞,并能永久表达。常用的是HIV-1为基础的慢病毒载体。42.l2000年May C等首次应用携带有大片段的调节序列的人的珠蛋白基因慢病毒载体转染小鼠骨髓细胞，人的珠蛋白基因有效、准确的整合到宿主DNA中，并能高效表达，合成正常血红蛋白可达17-24%，达到治疗地中海贫血小鼠的目的。文章发表在Nature43.lPawlin等（2001）、Imrens等（2002）、Persons等（2003）、Levasceur等（2003）、Rivella等（2003）报告采用同样载体，在中间型地贫鼠（Hbbth3/+）模型中显示每拷贝载体可使Hb增加1.12.3g/dl，血液参数明
22、显纠正,红细胞形态明显好转。44.以上用的Hbbth3/+鼠为中间型鼠为了更接近人重型地贫，Rivella等建立了重型地贫鼠模型。这种鼠如不治疗将在68周内死于严重贫血（Hb23g/dl）用上述载体基因转导后则转变为中间型地贫鼠。由此提示治疗人重型地贫时，采用这些载体转导或珠蛋白基因还需要更高的表达。45.l位点独立性表达（position independent expression）：在鼠的研究中还发现一个特征，尽管包含了或珠蛋白基因的调节元件，但或珠蛋白的表达在不同的鼠之间差异很大l鸡HS4(cHS4)具染色质隔离成分（chromatin insulator element），在癌瘤逆转
23、录病毒载体中已发现可减少位点作用差异（position effect variegation,PEV）lcHS4元件具有阻断增强子活性作用，可能有较好的载体生物安全性，对克服载体的致癌作用很重要。46.lPuthenveetil 等报告采用慢病毒载体，所包含的珠蛋白基因族中加入cHS4染色质隔离成分,修正后的人地贫CD34细胞在细胞培养中得到一致的红系分化和纠正异常的地贫特征，移植入免疫缺陷鼠后，34个月后仍是红系正常分化。47.是广义的基因治疗是广义的基因治疗 机理是根据机理是根据地贫的病理生理基础是地贫的病理生理基础是链和非链和非链合成速率的不平衡，药物来激活非链合成速率的不平衡，药物来激
24、活非链珠蛋链珠蛋白基因的功能，增加非白基因的功能，增加非链珠蛋白的合成速率；链珠蛋白的合成速率；或抑制或抑制珠蛋白基因功能，降低珠蛋白基因功能，降低珠蛋白的成速珠蛋白的成速率的合成速率；率的合成速率；减轻减轻和非和非珠蛋白的失衡程珠蛋白的失衡程度减轻临床症状度减轻临床症状48.药物基因调控治疗；药物基因调控治疗；反义核酸性基因调控治疗；反义核酸性基因调控治疗；造血生长因子治疗。造血生长因子治疗。中药治疗中药治疗49.l药物基因调控治疗药物基因调控治疗 l1982年首先报告应用年首先报告应用-氮胞核苷氮胞核苷l许多药物，如羟基脲、丁酸盐、阿糖胞许多药物，如羟基脲、丁酸盐、阿糖胞苷、马利兰、雷米封
25、等都有研究报告苷、马利兰、雷米封等都有研究报告l羟基脲（羟基脲（HU）的研究报告最多，效果也）的研究报告最多，效果也较好较好50.是抑制二磷酸核糖核苷还原酶的是抑制二磷酸核糖核苷还原酶的S 期特异性细胞期特异性细胞毒药物，一种相对低毒、有效的毒药物，一种相对低毒、有效的珠蛋白基因珠蛋白基因激活剂，激活剂，动物实验和临床应用中被证实确有诱发动物实验和临床应用中被证实确有诱发HbF合成增加，合成增加，长期应用于长期应用于SCA和部分和部分地贫病人中取得地贫病人中取得良好疗效。良好疗效。HU能增加能增加、珠蛋白链的合成珠蛋白链的合成 HU治疗中间型治疗中间型 地贫效果明显地贫效果明显51.l丁酸类药
26、物丁酸类药物l 主要包括丁酸钠、正丁酸、主要包括丁酸钠、正丁酸、-氨基酸丁氨基酸丁l在正常人体、地贫、和在正常人体、地贫、和SCA病人的造血病人的造血干细胞干细胞l 培养中可大量产生培养中可大量产生HbFl 具有低毒性，但半衰期极短具有低毒性，但半衰期极短l 探索更稳定的丁酸衍生物。探索更稳定的丁酸衍生物。52.是能抑制基因表达的是能抑制基因表达的RNA，一段与靶基因互补的，一段与靶基因互补的序列与靶基因的序列与靶基因的mRNA结合形成反义结合形成反义 NA-靶靶RNA聚合体从而影响靶聚合体从而影响靶RNA的功能的功能 部分部分地贫病人是由于转录过程中错误剪切地贫病人是由于转录过程中错误剪切造
27、成造成 利用反义核酸技术可封闭前利用反义核酸技术可封闭前mRNA上的错误上的错误剪切位点剪切位点 从而产生正常的从而产生正常的mRNA和和珠蛋白链珠蛋白链53.是一种多肽骨架的核酸模拟物，具有与天然是一种多肽骨架的核酸模拟物，具有与天然DNA分子相似的结构，与靶基因形成二聚体和三螺分子相似的结构，与靶基因形成二聚体和三螺旋结构旋结构 PNAs与与DNA/RNA结合的亲和力强，特异性结合的亲和力强，特异性和化学稳定性高，不易被核酸酶和蛋白酶降解，和化学稳定性高，不易被核酸酶和蛋白酶降解，且合成简单且合成简单54.重新激活重新激活HbF的作用仍有争议的作用仍有争议 能刺激能刺激Hb生成，但反应程度差异很大。生成，但反应程度差异很大。目前单独应用疗效不明显，且价格昂贵目前单独应用疗效不明显，且价格昂贵,常与常与HU等联合应用等联合应用 利用基因转导技术通过诱导利用基因转导技术通过诱导地贫鼠分泌地贫鼠分泌EPO 取得良好效果取得良好效果55.l中药中药“益髓生血灵益髓生血灵”治疗治疗地贫，地贫，Hb、HbF、网织红细胞升高，减少输血网织红细胞升高，减少输血l 能促进红细胞生成素和造血生长因子的释放，能促进红细胞生成素和造血生长因子的释放，l 提高珠蛋白链提高珠蛋白链/+比值，比值，56.57.
