1、全身用药的毒性研究全身用药的毒性研究o全身用药是指药物经过不同给药途径吸收入血后所引起的全身各组织和器官的毒性反应。o全身用药的毒性研究o急性毒性研究o长期毒性研究o概念 指机体(实验动物)一日内一次或多次接触药物产生毒性反应，甚至引起死亡。急性毒性试验急性毒性试验o目的o了解新药急性毒性的强弱 o以半数致死量LD50为例，化合物的LD50越小毒性越强。o相对毒性：指产生毒性所需剂量与产生疗效所需剂量间的比值，比值越大，安全范围就越大。o治疗指数和安全系数。o治疗指数是指LD50与半数有效量ED50间的比值。至少大于10，才具有进一步作其他新药临床前研究的价值。o安全系数是指基本无害剂量LD5
2、与基本有效剂量oED50之间的比值，比值越大越安全。o为长期毒性和特殊毒性试验的剂量设置提供依据 o一般而言，长期毒性和特殊毒性试验的高剂量，都是根据急性毒性资料为依据而设置的。o获取新药毒性反应信息 o在新药临床前急性试验中获得尽可能多的毒理学信息，可为该药物进一步安全性评价和临床上尽早识别和处理人体不良反应提供参考。o通过LD50值的比较，观察生物效应的显著差异，以明确试验产品的质量。o 急性毒性试验的设计，应根据化合物的结构特点、理化性质、适应证特点和试验目的等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并结合其他药理毒理研究信息对试验结果进行全面的评价。o急性毒性试验应符合一般动物试验的基
3、本原则，即随机、对照和重复。基本内容基本内容o实验动物的选择o种类：小鼠、大鼠、犬或猴，通常首选啮齿类的大鼠或小鼠，尤其是小鼠。o小鼠具有繁殖周期短、产仔多、生长速度快、体型小、饲料消耗少、以及毒理学研究背景资料较多、便于比较温顺易捉、操作方便、实验的准确性和一致性高等优点。o大鼠在代谢和毒性反应上与人类较为接近。o家兔也可用于急性毒性试验，尤其用于经皮肤接触的毒性试验。但由于家兔的盲肠较长，故不用家兔做经口给药的急性毒性试验。但在下列情况时可以考虑用一种非啮齿类动物，一般选用家犬或猴：大、小鼠的LD50值有明显的差别；已知药物的生物转化形式和速率在啮齿类与非啮齿类之间存在着明显差异时为了得到
4、明确的毒效应表现，在条件许可的情况下可考虑选用其它敏感动物，如鸟类、灵长类o健康状况：o健康的大、小鼠应为肌肉丰满，被毛富有光泽，紧贴身体，性情活泼，行为活动有力，眼红明亮，对外界刺激反应敏捷，透过尾部皮肤可以清楚地见到血管(未成年鼠尤为明显)。o体重与年龄：o 同一批实验中，动物的年龄、体重应尽可能一致。o幼年动物一般较成年动物对毒物敏感，急性毒性试验原则上选用年轻的成年动物，啮齿类动物的年龄一般为79周龄，非啮齿类动物起始为68月龄。o同一批试验中，动物的初始体重变异要求不超过平均体重的20。o试验前、后(包括实验中死亡的动物)应各称取体重一次，以观察给药后引起的变一般认为在保持正常的食耗
5、及环境条件下，出现体重下降应看作是毒效应的一种表现o性别o动物性别不同对毒物的敏感性也不同，这与性激素有关，也随药物而异。o急性毒性试验中应考虑雌雄动物数目相等，一般不应做单性别动物的LD50剂量与分组剂量与分组预试：找出0及100接近致死剂量正式试验：小鼠一般分46个剂量组，各剂量组距一般为065-085为宜，每组10只。雌雄分开单独进行，也可雌雄各半来进行试验。试验动物的分组，必须严格遵守随机分组原则，以减少偏差。最好用随机分组表来进行分组。给药途径和给药容积给药途径和给药容积o受试物：制备工艺稳定、符合临床试验用质量标准规定的样品 o用两种以上给药途径，其中一种必须推荐临床用药的途径。o
6、对溶于水的药物必须测定静脉注射的LD50。o主要的给药途径有经口给药，经皮给药，注射给药(肌肉，皮下，皮内，腹腔，静脉)。o静脉注射给药推进速度不能太快，一般在1020秒注射完毕。o经口或灌胃给药应在空腹状态下进行，一般给药前禁食12小时左右，这样可以避免胃内容物影响药物的吸收。o给药容积，各组动物一般用不同浓度同体积给药。o常规给药体积小鼠为02-04ml10g，大鼠 1-2ml100go药物的LD50测定应注明给药时间。试验时限与量限试验时限与量限o急性毒性试验的观察时间取决于症状出现的时间、毒性强弱、致死速度、恢复速率以及药物本身的代谢特征等。o 我国新药审批办法规定：急性毒性试验必须观
7、察7-14天，但一般不必超过两周 o试验的限度，口服急性毒性是5gkg，注射是2gkg，在此剂量下如无死亡出现，通常可不必做更高的剂量。o在实际工作中，对于毒性低的药物可用最大给药浓度和最大给药容量单次或24小时内分次给药，一般使用20只啮齿类动物，连续观察7-14天，如无死亡出现，则该剂量即为药物的最大耐受剂量。观察指标观察指标o笼边观察 o一般给药后持续观察30分钟，第1-4小时再观察1次，以后每天观察1次。o笼边观察内容包括动物的被毛、眼睛、粘膜、循环系统、神经系统、呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统及行为活动等。o死亡过程与死亡时间o 观察死亡过程，有助于探讨中毒的机制或动物中毒的死亡原
8、因。o死亡时间可间接地得到药物毒作用性质的信息。o体重o体重的变化要在全面观察的基础上仔细地加以分析o尸体解剖及病理组织学检查o对于早期死亡较多，继之有所减少，然后又出现大批死亡，则应进行病理组织学检查，以便为死因的确认提供依据。o 总之，观察记录应尽量准确、具体、完整。不单纯记录死亡出现的时间，还应详细记录具体的中毒表现，并应能表明出现的时间及持续的时间。LD50计算方法（孙氏改进寇氏法）计算方法（孙氏改进寇氏法）o基本要求o反应情况应符合或接近对数正态分布；o相邻两剂量的比值应相等；o各组动物数相等或相近，一般为10只；o不要求死亡率一定包括0与100，但二者之和最好在80120范围内。o
9、计算公式o当最小剂量组的死亡率为0，最大剂量组的死亡率100%时oLD50=lg-1Xmi(p0.5)Xm为最大剂量的对数p为各组动物的死亡率(以小数表示)p为各组动物死亡率的总和i为组间距(相邻两组对数剂量的差值)当最小剂量组的死亡率大于0而小于30%，或最大剂量组的死亡率小于100而又大于70时，按下列校正公式计算LD50=lg-1Xmi(p3PmPn/4)Pm为最大剂量组的死亡率 Pn为最小剂量组的死亡率 oLD50的标准误差按下式计算oSx50=i(p-p2)/(n1)oSx50为lg LD50的标准误差oX50即lg LD50,n为每组动物数oLD50的95可信限按下式计算o95可信
10、限=lg-1(X50 1.96Sx50)o例题 取体重1822g小鼠50只，雌雄各半，随机分成5组，每组10只，按表中剂量腹腔注射某溶液，组间剂量比为1：0.8，死亡率见表，用改良寇氏法计算其半数致死量组别小鼠数（N）剂量（mg/kg）对数剂量(X)死亡动物数死亡率(P)P21234510101010103002401921541232.482.382.282.182.0810853010.80.50.30p=2.610.640.250.090p2=1.98o解：oLD50=lg-1Xmi(p0.5)Xm=2.48 i=0.1 p=2.6 LD50=lg-12.480.1(2.60.5)=lg
11、-1 2.27=186.21mg/kgSx50=i(p-p2)/(n1)i=0.1 p=2.6 p2=1.98 n=10 Sx50=0.1(2.61.98)/(101)=0.006995可信限=lg-1(X50 1.96Sx50)X50即lg LD50 Sx50=0.006995可信限=lg-1(2.27 1.960.0069)=lg-1(2.25652.2835)=180.51192.09mg/kg 长期毒性试验长期毒性试验o概念：指动物反复多次接触药物所引起的毒性反应o目的：通过重复给药的动物试验表征受试物的毒性作用，预测其可能对人体产生的不良反应，降低临床受试者和药品上市后使用人群的用药
12、风险。试验内容o实验动物o至少在两种动物以上，包括啮齿类和非啮齿类，啮齿类主要是大鼠，非啮齿类为犬。o大鼠体重要求在68周龄，试验周期3个月以上则选56周龄。每组试验体重差异不应超过平均体重的20。o大鼠每笼不超过5只。雌雄分笼饲养。o犬，如beagle犬一般用4-9月龄，性别要求为雌雄各半。o试验前至少观察一周，记录进食量和体重。犬单笼饲养，试验前驯养至少一周。标准饲料喂养，犬要预先检疫，驱虫。o受试药物和给药途径o对受试药物应注明药名，批号，来源，规格，纯度，理化性质，保存条件及配制方法。o理想的受试药物应与药效试验，一般药理，急毒，致突变，生殖，药代有相同质量标准，对所用溶剂应注明规格，
13、来源，批号。o 给药途径原则上与临床用药途径一致，口服给药大鼠一般常用灌胃，灌胃的容量为每天12ml100g，o静脉注射大鼠时可采用腹腔代替，各剂量组采用等容量不等浓度给药。o分组，给药剂量及给药周期o 分组，一般设三个剂量组和一个对照组，o高剂量组原则上要求使动物产生明显或严重毒性反应，甚至个别动物死亡，但死亡动物数不应超过20。o中剂量组要求动物产生轻微的或中等的毒性反应，一般应高于药效学试验的高剂量组，o低剂量组应当略高于动物有效剂量而不出现毒性反应.o长期毒性给药周期：o临床用药13天的药物，动物试验给药周期为1个月；o临床用药1周的药物，动物试验给药周期为1个月；o临床用药4周的药物
14、，动物试验给药周期为3个月，临床用药3月的药物，动物试验给药周期为至少半年以上。对于临床3个月内长期毒性试验必须每天给药一次，但对于3个月以上的毒性试验，每周可给药6次。每天给药最好是固定时间。限度试验，如小鼠急性毒性试验毒性很低，测不出LD50或口服给药剂量大于5g/kg，注射给药剂量大于2g/kg，也未见明显毒性反应，可设大鼠高剂量组为拟用于临床剂量的50倍，犬的高剂量组为拟临床用量的50倍。o观察指标o一般观察 o进食量、体重、外观体征和行为活动、粪便性状等，发现有中毒反应的动物应取出单笼饲养，重点观察以避免被其他动物吃掉。o发现死亡或濒死动物应及时尸检。o动物体重的变化是反应机体整个情
15、况最灵敏的指标，所以必须认真称体重和计进食。o检测项目o血液学指标：红细胞计数、网织红细胞计数、血红蛋白、白细胞计数及其分类、血小板计数、凝血时间、平均红细胞血红蛋白浓度，平均红细胞血红蛋白、平均红细胞容积。o血液生化学指标：天门冬氨酸氨基转换酶(AST)、丙氨酸氨基转换酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、总蛋白(W)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、总胆红素(T-BIL)、肌酐(Grea)、总胆固醇(T-CHO)、肌酸磷酸激酶、甘油三酯o系统尸解和病理组织学检查o系统尸解：应全面细致，发现异常器官应重点进行病理组织学检查。o脏器称重合脏器系数：剖解后取出脑、心、肝、肾、脾
16、、肺、肾上腺、甲状腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫、胸腺。o病理组织学检查：o在高剂量组发现有异常病变时才进行检查。o检查内容：心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、垂体、前列腺、胸腺、睾丸(连附睾)、卵巢、子宫、胃、十二指肠、回肠、胰腺、膀胱、食管、气管、主动脉、乳腺、脑(大脑、小脑、脑干)、脊髓(颈、胸、腰段)、骨髓、视神经、坐骨神经、淋巴结(包括给药局部淋巴结、肠系膜淋巴结)、给药局部。非啮齿类动物还需进行唾液腺、胆囊、乳腺等组织病理学检查。o对于病理的检查应分层次进行。先从宏观的一般肉眼观察，然后用光镜详细检查，必要时用电镜观察，并结合生理生化指标，进行结合分析。为毒性靶器官的确定奠
17、定基础。o指标观察时间 o一般状况和症状的观察，每天观察一次。每周记录饲料消耗和体重一次。o试验周期在三个月内的，一般在最后一次给药24小时和恢复期结束时各进行一次各项指标的全面检测。必要时，在试验中间检测指标一次。o试验周期在三个月以上的，可在试验中期活杀少量动物(高剂量组和对照组)全面检测各项指标。o对濒死或死亡动物应及时检查。p结果处理长期毒性试验中的数据均用XSD表示，要进行统计处理。在分析长期毒性研究结果时应综合考虑数据的统讫学意义和生物学意义。静脉注射制剂的全身毒性试验静脉注射制剂的全身毒性试验o血管刺激试验o目的：观察受试静脉注射剂经多次静脉给予后对血管刺激的情况。o体外溶血试验o目的：观察静脉注射剂是否发生溶血现象。o过敏性试验o目的：观察受试药物经注射给药后有无变态反应o热原试验o目的：将一定剂量的受试药物静脉注射给予家兔，观察家兔体温升高情况，以判定受试物是否有致热原作用。
