1、食品微生物学检验技术刘晓庆刘晓庆1微生物试验方法微生物试验方法 取样 培养基制备 灭菌和消毒 无菌操作 培养、计数 饮料微生物检测方法 国标：菌落总数、霉菌和酵母菌、大肠菌群、致病菌 企标要求 常见问题处理2取样取样准备工作取样工具：消毒，灭菌消毒，灭菌样品存放容器：清洁、干燥清洁、干燥取样标签取样注意问题采样均匀避免污染标记准确、牢固及时保存若不及时检测应保存在4冰箱，最长不超过24h。3培养基制备培养基制备玻璃器皿的清洗 新购的玻璃器皿 将器皿放入盐酸溶液中浸泡数小时，以除去游离的碱性物质，最后用流水冲净。常用旧玻璃器皿的洗涤 确实无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用前后，可按常规用洗涤剂
2、进行刷洗；带菌玻璃器皿的洗涤 凡实验室用过的菌种以及带有活菌的各种玻璃器皿，必须经过高温灭菌或消毒后才能进行刷洗。4培养基制备培养基制备为满足微生物生长和代谢的需要，培养基必须包含碳源、氮源、水、无机盐、能源和生长因子碳源、氮源、水、无机盐、能源和生长因子六大类营养物质。购买：选择质量好的培养基，注意保质期，记录收货期。贮存：30以下，避光避光保存于阴凉干燥阴凉干燥处，使用后，拧紧瓶盖，避免吸潮、氧化或污染。保质期：一般未开封的培养基可保质年，已开封的可保质半年。建议在瓶体注明开封日期在瓶体注明开封日期。对于个别极易变质的品种，建议冷藏冷藏保存，可延长保质期。5培养基制备培养基制备培养基分类根
3、据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分：区分：a)a)天然培养基天然培养基 是利用各种动、植物或微生物的原料，成分难以确切知道。主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。b)b)合成培养基合成培养基 是用已知化学成分的化学药品配制而成。化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。c)c)半合成培养基半合成培养基 在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种
4、已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。6培养基制备培养基制备培养基分类根据培养基的物理状态来区分：根据培养基的物理状态来区分：a)a)液体培养基液体培养基 所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。b)b)固体培养基固体培养基 在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。c)c)半固体培养基半固体培养基 如果把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。
5、以琼脂为例，它的用量在0.2-1%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。7培养基分类根据培养基的用途来区分：根据培养基的用途来区分：a)a)选择培养基：选择培养基：在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基。如链霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生长；而制霉菌素、灰黄霉素等能抑制真核微生物的生长；结晶紫能抑制革兰氏阳性细菌的生长等。b)b)增殖培养基：增殖培养基：常用于菌种筛选和选择增菌中。在某种程度上在某种程度上讲，增殖培养基也是一种选择培养基。讲，增殖培养基也是一种选择培养基。培养基制备培养基制备8培养基分类根据培养基的用途来区分：根据培养基的用途来区分
6、：鉴别培养基：鉴别培养基：在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助于快速鉴别某种微生物。例如用以检查饮水和乳品中是否含有肠道致病菌的伊红美蓝培养基伊红美蓝培养基。有些培养基是具有选择和鉴别双重作用。例如食品检验中常用的麦康凯培养基是一例。它含有胆盐、乳糖和中性红。胆盐具有抑制肠道菌以外的细菌的作用（选择性），乳糖和中性红（指示剂）能帮助区别乳糖发酵肠道菌（如大肠杆菌）和不能发酵乳糖的肠道致病菌（如沙门氏菌和志贺氏菌）。培养基制备培养基制备9培养基制备培养基制备影响因素洗涤剂中含有表面活性剂，会影响微生物生长，注意冲洗干净。一般不采用自来水配制培养基，
7、因为自来水相对杂质较多，有些含有较多的Ca2+、Mg2+离子，可与蛋白胨、肉浸汁中的磷酸盐生成磷酸钙、磷酸镁，一旦高压灭菌后，就会析出沉淀，从而影响到培养基的透明度，不利于微生物的培养与观察。蒸馏水或纯净水中所含的杂质较少，所制成的培养基透明度高，有利于观察。10培养基制备培养基制备制备：准确称取各组分，一次完成，不要中断；混合后，煮沸或者热水溶化，充分溶解；分装，装量2/3容积 灭菌，高压灭菌的温度与时间随培养基的种类不同而有所差别。含糖类物质培养基（如乳糖胆盐发酵培养基）则灭菌温度不能过高，以免糖类物质被破坏，影响培养微生物的观察效果。灭菌后用不完的培养基4以下存放 含琼脂培养基：含琼脂培
8、养基：控制水浴温度，水浴时间不宜超过4h；若在4h内不能及时使用，应迅速冷却，使其凝固，使用前再进行复溶。但不可多次复溶，否则会影响培养基的pH值，并导致凝胶强度下降。加水时避免干粉挂壁粘底，加热时避免烧糊。加水时避免干粉挂壁粘底，加热时避免烧糊。除个别特殊品种含有不溶成分外，应澄清，无絮状物，无沉淀。除个别特殊品种含有不溶成分外，应澄清，无絮状物，无沉淀。11培养基制备培养基制备注意事项培养基所用化学药品均应是化学纯。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长;因培养基在加热消毒过程中、pH会有所变化，培养基各成分完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸
9、液约可降pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。培养基的分装，应选择适当容器:液体分装至试管1/4左右为宜；如固体则分装量为管高的1/5；半固体培养基，则分装至试管的1/2-1/3为宜；锥形瓶分装培养基时，容量应不超过容积的2/3为宜；9cm的培养皿一般可倒入15ml培养基。一般培养基可采用121高压蒸汽灭菌20分钟的方法。在各种培养基制备方法中，如无特殊规定，即可用此法灭菌。某些畏热成分，如糖类、明胶培养基应采用较低温度灭菌。血液、体液和抗生素等则应以无菌操作技术抽取和加入经冷却约50C左右的培养基中。含糖培养基：含糖培养基：115115灭菌灭菌10min10min或或113113灭菌灭菌
10、15min15min无糖培养基：无糖培养基：121121灭菌灭菌20min20min12灭菌和消毒灭菌和消毒紫外线照射：用于空气、物体表面消毒。紫外线的波长范围是136400nm，波长200300nm的紫外线对微生物有致死效应。紫外线最强杀菌作用的波长为265266nm，这是核酸的最大吸收波长。实验室用的紫外线杀菌灯的波长为253.7nm。注意：注意：穿透能力极差，不能穿透一张厚纸。故不能用于液体饮料的消毒。75%酒精：乙醇的杀菌力受浓度影响，并不是浓度越高杀菌力越好，75%的乙醇杀菌力最强，超过此浓度至无水乙醇的效果差，因为高浓度时可使菌体迅速脱水，表面蛋白凝固，形成了保护膜，阻止了乙醇分子
11、进入菌体，会影响杀菌作用。13灭菌和消毒灭菌和消毒温度：利用温度进行灭菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高温可使微生物细胞内的蛋白质和酶类发生变性而失活，从而起灭菌作用，低温通常起抑菌作用。灼烧灭菌法：灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品等的灭菌。干热空气灭菌法：干热空气灭菌法：实验室常用方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160-170，恒温1-2h即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。14灭菌和消毒灭菌和消毒湿热灭菌法:在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这
12、是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。煮沸消毒法：煮沸消毒法：10023h,芽孢死亡。1001020min，营养体死亡。在清水中加入1%碳酸钠或2%的石炭酸，效果更好。此法适用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。间歇灭菌法：间歇灭菌法：常压蒸汽灭菌，1003060min，连续3次，间隔培养（2837）24h。适合于不宜高压蒸汽灭菌的物品，可杀灭芽孢。此法不需加压灭菌锅，适于推广，但操作麻烦，所需时间长。高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌：利用压力的增加，达到温度升高的目的。12120min，效果最好。用于液体培养基，无菌水等灭菌
13、。体积大，传热性差的物品，灭菌时间应适当延长。适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。15灭菌和消毒灭菌和消毒要灭菌后的器皿仍保持无菌状态，需在灭菌前进行包扎。培养皿：培养皿：洗净的培养皿烘干后每10套（或根据需要而定）叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，或装入特制的铁桶中，然后进行灭菌。吸管：吸管：每根独立包好后，再放进去高压锅灭菌；如果是放在不锈钢的筒子里面的话，可以不用独立包，但是取的时候一定要注意不要污染其他的移液管；试管和三角瓶：试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。过紧易
14、挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/3塞进管口。玻璃器皿：玻璃器皿：包好后摆入电热烘箱进行干灭时，相互间要留有一定的空隙，以便空气流通。灭好后待烘箱内温度自然降温到60以下后，再开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。16灭菌和消毒灭菌和消毒高压蒸汽灭菌操作流程高压蒸汽灭菌操作流程关好排水阀门，放入纯净水或蒸馏水至标度。关好排水阀门，放入纯净水或蒸馏水至标度。注意水量一定要加足，否则容易造成事故。将须要灭菌的器材、培养基等装入灭菌锅中，加盖密封。将须要灭菌的器材、培养基等装入灭菌锅中，加盖密封。同时旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否
15、则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。通电加温，打开排气活门，排尽锅内的空气。通电加温，打开排气活门，排尽锅内的空气。通常当压力表指针升至5 5磅或磅或0.05MPa0.05MPa时，打开排气活门放气时，打开排气活门放气，待压力表指针降至零点一小段时间后，再关闭活门。即活门冲出的全部是蒸汽时则表示彻底。恒温灭菌恒温灭菌:0.1MPa:0.1MPa 或或1515磅压力保持磅压力保持20203030分钟。分钟。降温：自然降温或打开活门排汽降温。注意勿使排气过快，一般从排气到降温：自然降温或打开活门排汽降温。注意勿使排气过快，一般从排气到打开锅盖以打开锅盖以1010分钟左右为好。分钟左右为好。当锅内蒸
16、汽完全排尽时即压力表指针降到零时，要立即打开锅盖。当锅内蒸汽完全排尽时即压力表指针降到零时，要立即打开锅盖。取出灭菌物品：当锅内温度下降到取出灭菌物品：当锅内温度下降到6060左右时取器材或培养基。左右时取器材或培养基。长时间不用时，应将高压灭菌器内的剩余水排出。长时间不用时，应将高压灭菌器内的剩余水排出。验证灭菌效果验证灭菌效果。把灭菌培养基放入。把灭菌培养基放入2525温箱中，培养温箱中，培养4848小时观察灭菌效果。小时观察灭菌效果。48小时后不见杂菌生出，便证明培养基已达到灭菌目的，可以使用。17高压蒸汽灭菌注意事项高压蒸汽灭菌注意事项 灭菌时要排净高压锅中的空气。空气不排净，压力达到
17、预定值时，温度仍为100。为了避免培养基营养成分受到破坏，在灭菌的过程中应严格把握灭菌的温度与时间，不能随意地提高灭菌的温度或延长灭菌时间。由于高压灭菌会导致培养基的体积和浓度有所变化，在配制培养基时，每100mL培养基可适量增加5mL左右的蒸馏水。预防培养基在加热溶解、灭菌煮沸等过程中导致水分挥发、损失而使培养基的浓度过大或体积减少。18无菌操作无菌操作 GLP（良好实验室规范）工作区域缓冲间不是储藏室；无菌操作室、超净台禁止存放堆积杂物；缓冲间和无菌室的门错开开启，减少外界空气侵入；紫外灯消毒台面、地面，不能同时开启鼓风；门窗关闭，避免扬尘；用75%乙醇消毒台面；使用霉菌的操作台最好是专用
18、，防止污染的操作。超净工作台要满足的条件：每周一次做空气沉降菌实验，应满足细菌2个/平皿/30min，霉菌、酵母菌：0个/平皿/30min。19无菌操作无菌操作 人员进入无菌室换专用的实验服、帽、鞋，戴好口罩热水皂液洗手；75%乙醇消毒手和手臂操作靠近火焰上半球操作所有器具接触培养物的部分必须无菌注意避免微生物污染20培培 养养倒置培养适当的温度 细菌：36 霉菌、酵母：28 大肠菌群：36注意：培养箱的温度校正保持一定的湿度 培养箱中置一杯水定时查看，并做记录21计计 数数 计数场所洁净，明亮保持培养皿的底部清洁可借助放大镜观察有霉菌生长的平皿不可打开皿盖每块平皿上最佳数量为30300若无菌
19、生长，则记录为300，则可估读数22饮料微生物检测方法饮料微生物检测方法 膜过滤法 标准平板计数法 棉拭法 显微直接计数法 食品卫生微生物检验国标 嗜酸耐热菌检测 致病菌检测 企标要求23膜过滤法膜过滤法 使用范围：可以过滤的样品样品含菌量相对较少，一般300cfu/ml优点：可富集微生物，更灵敏。过滤设备消毒灭菌：121，15min一次性无菌滤膜（直径47mm）0.45m：细菌总数和大肠杆菌0.8m：霉菌和酵母24膜过滤法膜过滤法 抽滤系统真空泵缓冲瓶集液瓶三联（六联）抽滤器抽滤液体抽完后，空抽时间不超过30秒可用20ml水冲洗，不可用洗瓶冲。培养在吸收垫上培养在琼脂平板上 计数直接显微计数
20、培养后计数25标准平板计数法标准平板计数法适用范围：难过滤的样品，滤过体积2ml，如含果肉的果汁和果汁饮料空白对照每一系列的测试至少需1个对照培养基准备在沸水中融化，置472 水浴中步骤在无菌培养皿中加1ml样品在培养皿中倒入15-20ml培养基，注意：瓶口不要触及皿盖小心混匀样品和培养基水平放置凝固后，倒置培养计数26显微直接计数法显微直接计数法无需培养，最快的分析方法用于糖的微生物评估计数结果偏高不分死活细胞，均被计数食品颗粒与细胞不易区分步骤确定膜过滤面积和视野面积样品溶液准备过滤样品染色镜检计数27棉棉 拭拭 法法无法使用平板接触法的表面柔软、不平整、不规则的表面材料无菌棉签无菌水不平
21、整步骤选择采样点，并作记录在试管上作相应的记录取出无菌棉签，在无菌水中浸湿在待检表面擦拭，并注意擦拭孔缝擦拭完毕放回无菌管中，盖好塞子采用膜过滤法或平板法分析，在一小时内完成。28快速微生物检测法快速微生物检测法ATP分析系统ATP生物荧光检测计数法直接荧光膜技术29关于饮料的检验关于饮料的检验 GB/T4789.21-2003 冷冻饮品、饮料检验采样：果蔬汁饮料、碳酸饮料、茶饮料和固体饮料：应采取原瓶、袋和盒装样品。样品采取后应立即送检，如不能立即检验，应置冰箱保存。处理：对于瓶装饮料，用点燃的酒精棉球烧灼瓶口灭菌，用石碳酸纱布盖好；塑料瓶口可用75%酒精棉球擦拭灭菌，用灭菌开瓶器将盖启开；
22、含有二氧化碳的饮料可倒入另一灭菌容器内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻振荡，待气体全部逸出后，进行检验。检测：菌落总数、大肠菌群、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母计数，均按照GB/T 4789 执行；乳酸菌检验按照GB/T16347执行。30食品卫生微生物检验国标食品卫生微生物检验国标 GB 4789-2010 菌落总数测定 霉菌和酵母菌计数 大肠菌群计数31菌落总数测定菌落总数测定 GB 4789.2-2010磷酸盐缓冲液或生理盐水吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液。吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。进行稀
23、释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。混匀时可先顺时针旋转，再逆时针旋转，旋转中应防止混合物溅到平皿壁和皿盖上。检样过程中应用稀释液做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿和吸管是否被污染。检样过程中应在工作台内打开一块空白PCA（其暴露时间应与检样时间相当），以了解样品在检验操作过程中有无受到来自环境的污染。检样从开始稀释到倾注最后一个平皿，所用时间不宜超过20min。如果把不能立即计数，要将平板放入04冰箱中，但不能超过24 h。32菌落总数计数方法菌落总数计数方法若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的
24、平均值。若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数。若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则对稀释度最低的平均菌落数进行计数。若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。33菌落总数计数方法菌落总数计数方法若所有稀释度的平板菌落数均不在30-300CFU之间，则以最接近30或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。当有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围之内时，计算公式为：N样品中菌落数；C平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；N1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；N2第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。3
25、4霉菌和酵母菌计数霉菌和酵母菌计数 GB 4789.15-2010稀释液为稀释液为无菌水无菌水35霉菌和酵母菌的计数霉菌和酵母菌的计数选取菌落数在10-150CFU的平板进行计数。计算两个平板菌落数的平均值，再乘以相应稀释倍数计算。若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数。若所有平板上菌落数均小于10CFU，则对稀释度最低的平板计数。若所有稀释度平板均无生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。若为原液，则以小于1计数。报告时以CFU/g或CFU/mL为单位分别报告霉菌和酵母菌数。36注意：注意：霉菌次生菌对检验结果的影响霉菌次生菌对检验结果的影响霉菌是丝状真菌的俗称，意
26、即“发霉的真菌”，霉菌有着极强的繁殖能力，霉菌主要依靠产生形形色色的无性或有性孢子进行繁殖。孢子有点像植物的种子，不过数量特别多，特别小。霉菌孢子多聚积成团。在吸取各稀释度的样液时，需要充分振摇或用吸管反复吹打，使孢子团分散开，并均匀混悬。霉菌在适宜条件下生长迅速，先成熟的孢子落在培养皿上又可萌发长成新菌落，因此在培养的过程中观察，不要反复翻转平板，以免有次生菌形成而影响菌落计数的准确性。37大肠菌群计数大肠菌群计数 GB 4789.3-2010大肠菌群指一群37、24h能发酵乳糖，产酸，产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生
27、质量。大肠菌群不是细菌学上分类命名，而是根据卫生学方面的需要设定的一类与粪便污染有关的一组细菌。大肠菌群中以埃希氏菌属为主，称为典型大肠杆菌，是革兰阴性无芽孢杆菌，能在选择性培养基上产生典型菌落。38大肠菌群大肠菌群MPN法法 GB 4789.3-201039MPN法注意事项法注意事项初发酵和证实试验：初发酵和证实试验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“分解乳糖产酸产气”。初发酵阳性管，并不确定就是大肠菌群阳性，经证实试验后可能成为阴性。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。产气量与倒管：在乳糖发酵试验中，有时小倒管内会有极微小的气泡，有时可以看到经初发酵培养后
28、沿管壁有缓缓上浮的小气泡。可轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生。在实际工作中，有时遇到初发酵时产酸，但导管内无气泡产生，复发酵却证实为大肠菌群阳性。有时导管内无气体，但在液面及管壁却可看到小气泡。导管管口的完整情况与导管外有无沉渣存在均可影响产气反应的观察，管口不完整性有利于气体进入导管，管口周围有沉渣能阻碍或延缓气体进入。MPN检索表只给了三个稀释度，如改用其他稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。40灭菌后小导管内留有气泡的原因分析及其解决办法灭菌后小导管内留有气泡的原因分析及其解决办法*原因一：过早打开灭菌锅分析：分析：当灭菌锅压力表示数为0，而温度还高于室温时
29、，不要打开灭菌锅。因为打开锅盖瞬间，锅内大量热量散出，温度突然降低，试管内温度也随着降低，导致管内气减小，沸点降低，部分水会汽化留在小导管内。解决办法：解决办法：等灭菌锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大时再打开灭菌锅。*原因二：试管塞塞得太紧（使用硅胶塞的时候）分析：分析：试管塞塞得太紧在灭菌时会导致试管内与灭菌锅内压力不一致。在灭菌锅升温升压时，锅内压力会大于管内压力；灭菌锅降温降压时，锅内压力小于管内压力。锅内压力会大于管内压力时，试管内压力不够，不能将小导管内气体排尽，就留有气泡；锅内压力小于管内压力时，可能会使试管塞和培养基崩出，培养基报废。解决办法：解决办法：改用透气性好的棉花
30、塞，或使用质量好些的橡皮塞，切勿塞太紧。41灭菌后小导管内留有气泡的原因分析及其解决办法灭菌后小导管内留有气泡的原因分析及其解决办法原因三：小导管口太小 分析：分析：小导管在加压后一方面水要进去，另外里面的空气要出来，如果口太小的话，空气不容易出去，水也不容易进来，就会导致气泡留在里面了。解决办法：解决办法：改用内空较大的导管，尽量使用V型管，不要使用锥型管。原因四：培养基质量引起分析：分析：由培养基质量引起的气体不能排尽或培养基含有高温高压分解产气的成分。灭菌时用水做培养基组的对照试验，若培养基组有气泡，而对照组没有气泡，可确定是有此原因引起。解决办法：解决办法：改用其它培养基。原因五：灭菌
31、锅工作压力不够，使气体不能排尽分析：分析：灭菌锅最大压力不够不能使管内液体强行把气体挤出，最后还留有小气泡，还会使温度上升缓慢，或达不到灭菌温度。此原因的可能性较小，我们可以在排除原因一、二、三、四的情况下，用不加试管塞、大口导管做试验，若还仍不能达到效果，就要检查灭菌锅了。解决办法：解决办法：修理灭菌锅。42大肠菌群大肠菌群平板计数法平板计数法 GB 4789.3-201043平板计数法注意问题平板计数法注意问题全称：结晶紫中性红胆盐琼脂，煮沸灭菌，临用前制备。覆盖培养基的作用：防止菌落蔓延生长计数范围：15-150证实试验：从VRBA上挑取10个不同类型典型和可疑菌落接入BGLB肉汤中，培
32、养2448h，观察产气情况，凡产气管者即报大肠菌群阳性。结果报告：如10-4稀释液1mL，在VRBA上长出100个典型和可疑菌落，挑取的10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则大肠菌群数为1006/10104=6.0105CFU/g（mL）44注意：大肠菌群的注意：大肠菌群的假阴性现象假阴性现象在接种发酵管时注意，要沿管壁缓慢加入，防止培养基中倒置的小管里冲入气泡，造成产气的假象。从平板上菌落特征不典型时应多挑几个可疑菌落进行染色，以避免出现假阴性现象。大肠埃希氏菌典型菌落是呈紫红色、圆形、边缘整齐、表面光滑、湿润、常具有金属光泽，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
33、45嗜酸耐热菌检测嗜酸耐热菌检测在pH值较低时，嗜酸耐热菌可以形成具有耐热性的芽胞，果汁生产中常用的巴氏杀菌难以将其杀灭。芽胞以休眠的形式存活果汁中，当果汁复水后，适宜的条件会使芽胞萌发，生长，从而导致果汁产品香气损失、口感变差、浊度升高、形成沉淀。值得注意的是，嗜酸耐热菌存在并不一定使产品变质，未变质的果汁中也能检测到该菌，变质只在适当条件下发生，一般会引起果汁香味损失及轻微浑浊。46嗜酸耐热菌检测嗜酸耐热菌检测培养基：酵母粉或酵母浸膏1.25g，蛋白胨2.50g，琼脂粉6.50g，葡萄糖0.5g，吐温80 0.5mL，500mL去离子水，121灭菌20min；10%苹果酸溶液，0.45m滤
34、膜过滤后，121灭菌5min，用于调节培养基的pH值；当培养基冷却到50时，调节培养基的pH值到3.70.1。倾倒培养基，每瓶15-20mL；将样品（浓缩汁10mL，果汁产品100mL）放在801水浴锅中保温，当样品温度达到80时，开始计时，10min，以杀灭样品中其它不耐热菌。冷却后，将样品加入到90mL无菌生理盐水中，混匀后用0.45m滤膜过滤，将滤膜贴在提前倒好的培养基上；43-45倒置培养4天以CFU/10mL或CFU/100mL形式报告。47致病菌检测致病菌检测沙门氏菌 GB/T 4789.5-2003金黄色葡萄球菌 GB 4789.10-2010 志贺氏菌 GB 4789.3-20
35、10 48企标要求企标要求成品控制手册（HY/B3.PB0013-2009）表表1 水微生物指标及检验要求水微生物指标及检验要求产品产品项目项目指标指标检验频次检验频次原水、原水、RORO水水菌落总数，cfu/mL100每周1次霉菌酵母，cfu/mL5每周1次大肠菌群，MPN/100mL3每周1次瓶（桶）装瓶（桶）装纯净水纯净水菌落总数，cfu/mL20每小时1次霉菌酵母，cfu/mL不得检出每小时1次大肠菌群，MPN/100mL3每班1次49企标要求企标要求成品控制手册（HY/B3.PB0013-2009）表表2 饮料类成品微生物指标及检验要求饮料类成品微生物指标及检验要求产品产品项目项目指
36、标指标检验频次检验频次检验方法检验方法料液料液*菌落总数，cfu/mL50001次/周期GB 4789.2-2010霉菌酵母，cfu/mL301次/周期GB 4789.15-2010饮料类饮料类 成品成品菌落总数，cfu/mL51次/小时GB 4789.2-2010霉菌酵母，cfu/mL11次/小时GB 4789.15-2010大肠菌群，MPN/100mL31次/班GB 4789.3-2010注：料液取每周期最后一罐料液进行检测50企标要求企标要求成品控制手册（HY/B3.PB0013-2009）表表3 环境卫生控制指标环境卫生控制指标控制项目控制项目 控制点控制点检测项目检测项目指标指标检验
37、频次检验频次卫生控制卫生控制人员卫生大肠杆菌阴性1次/周车间环境菌落总数，cfu/平皿501次/周霉酵总数，cfu/平皿301次/周正压房菌落总数，cfu/平皿31次/周霉酵总数，cfu/平皿31次/周饮料类成饮料类成品品无菌盖菌落总数01次/周期霉酵总数01次/周期无菌瓶菌落总数01次/周期霉酵总数01次/周期无菌水菌落总数01次/周期霉酵总数01次/周期51微生物检验操作需要微生物检验操作需要注意的几个问题注意的几个问题 微生物检测操作注意事项防腐剂对微生物检验结果的影响TTC溶液对微生物检验结果的影响52微生物检测操作注意事项微生物检测操作注意事项检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管
38、等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留抑菌物质。不得残留抑菌物质。在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面不能低于液面2.5cm2.5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁缓慢释放液体玻璃瓶或试管的内壁缓慢释放液体；当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在2020分钟内分钟内向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀向皿内倾入琼脂，并立即
39、使其与琼脂混和均匀。样品打开后应准确、迅速完成所有微生物指标的检测，这样既可以节约时间，又能减少空气污染的机会；样品多时应注意提高效率，实验结果的准确度，更要避免交叉感染；53防腐剂对微生物检验结果的影响防腐剂对微生物检验结果的影响防腐剂主要作用于产品加工和制造过程中防止微生物的生长。假阴性现象：假阴性现象：如果被污染的微生物处于受抑制状态，微生物检验不注意稀释，往往会检不出微生物，出现假阴性现象。抑菌现象抑菌现象：低稀释度的平皿生长的菌落少，高稀释度的平皿生长的菌落反而多。54TTC溶液对微生物检验结果的影响溶液对微生物检验结果的影响为了便于区别产品中不溶解的颗粒与菌落，可在每100mL培养
40、基中加入0.5%的TTC溶液1mL，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而其他的杂质颗粒颜色无变化。TTC分子式 C19H16N4 TTC分子结构如下 由于绝大多数细菌均含有脱氢酶，能使相应的底物脱氢，用TTC可作为受氢体，使TTC接受氢后还原成红色非溶解性的三苯甲臢，而颗粒杂物和气泡则不显色。利用这一原理即可区别菌落、杂物和气泡。55TTC溶液对微生物检验结果的影响溶液对微生物检验结果的影响使用TTC溶液时注意：TTC溶液要放在低温及暗处保存，以免受到光与热而分解，在使用前应在水浴中煮沸30min，待冷却后方能加入已熔化的培养基中。TTC也是一种抑菌剂，经抑菌试验证实，浓度小于0.2%时对细菌生长繁殖无抑制作用，当浓度大于0.2%时对细菌生长繁殖有抑制作用。使用TTC时一定要注意它的剂量，不能随意地增加用量。56综上所述综上所述规范配制培养基规范灭菌规范操作注意避免：假阴性现象、抑菌现象和次生菌现象等。这样检验得出的结果才比较准确。这样检验得出的结果才比较准确。5758
