1、第三章第三章 基因工程载体基因工程载体生物科学与技术学院基因工程载体的概念基因工程载体的概念把一个有用的基因（目的基因研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫载体。作为基因工程载体，质粒至少应该具备复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点等部分。复制的起始区：复制的起始区：能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制。选择标记基因区：选择标记基因区：可以筛选重组体。多克隆位点：多克隆位点：方便外源基因的插入。第一节第一节 质粒载体质粒载体质粒（质粒（plasmidplasmid）：）：是独立于染色体以外的能自主复制的
2、双链闭合环状是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。分子。广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。广泛存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。质粒质粒染色体染色体质粒的一般生物学特性：质粒的一般生物学特性：u分子大小差异大：分子大小差异大：u编码基因少：编码基因少：u形状：形状：u 质粒的空间构型：质粒的空间构型：u 质粒空间构型与电泳速率：质粒空间构型与电泳速率：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同，scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。1.共价闭合环状DNA（Covalent close circular DNA，cccDNA)，呈超螺旋（SC）（sup
3、er coil）2.开环DNA（open circular，ocDNA），一条链上有一至数个缺口3.线形DNA（linear，lDNA）u 质粒的类型：质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可以分为：在大肠杆菌中的质粒，可以分为：1、接合型质粒（能自我转移）：除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带、接合型质粒（能自我转移）：除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：如：F质粒（性质粒、或质粒（性质粒、或F因子）。因子）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道
4、转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不不符合基因工程的安全要求。符合基因工程的安全要求。2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。个细胞。如如R质粒（抗生素抗性质粒）和质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素质粒（大肠杆菌素colicin）。）。符合符合基因工程的安全要求。基因工程的安全要求。大肠杆菌素是大肠杆菌分泌的一类细菌素（大肠杆菌素是大肠杆菌分泌
5、的一类细菌素（bacteriocin），对于其他不能分泌特异性大肠），对于其他不能分泌特异性大肠杆菌素免疫蛋白（杆菌素免疫蛋白（Immunity protein）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数）的细菌具有杀灭作用，现在一般认为有调节菌群数量的作用。量的作用。大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于大部分大肠杆菌素由质粒编码，其中最著名的没过于pColE1。u 质粒的复制类型质粒的复制类型严紧型质粒（严紧型质粒（stringent plasmid）：）：松弛型质粒（松弛型质粒（relaxed plasmid）：）：u 质粒的不相容性质粒的不相容性又称质粒的不亲和性，在没有选择
6、压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同又称质粒的不亲和性，在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性,又称质粒的不亲和性。又称质粒的不亲和性。u 质粒的复制过程质粒的复制过程质粒的复制主要是通过质粒的复制主要是通过型复制型复制和和滚环复制滚环复制两种方式之一进行的，其中以两种方式之一进行的，其中以型型复制为主。在复制为主。在型复制中，有单向半保留复制和双向半保留复制。型复制中，有单向半保留复制和双向半保留复制。Ori复制复制起起点点在革兰氏阳性细菌中大多数质
7、粒是以滚环方式复制。复制起点复制起点(ori)(ori)区的功能区的功能u复制起点是一段特定的复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。合成起始调控因子的结合位点。u在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于ori序列附近，因此序列附近，因此ori位点周位点周围的小范围围的小范围DNA是质粒复制所必需的。是质粒复制所必需的。u如果质粒如果质粒DNA的大部分区域被去掉，而只保留质粒的的大
8、部分区域被去掉，而只保留质粒的ori序列，而且质粒是环序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。状的，则质粒仍然能进行复制。u将将oriori区克隆到一个不能自主复制的环状双链区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNADNA分子上并引入到原核细胞后，分子上并引入到原核细胞后，该重组该重组DNADNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建的，同时用这种方法可以确定哪部分的，同时用这种方法可以确定哪部分DNADNA是是oriori区并研究区并研究oriori区的功能。区的功能。uoriori区域常决定了质粒的许多特
9、性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。质粒的命名质粒的命名用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez，322为编号。质粒载体的构建质粒载体的构建u天然质粒的局限性天然质粒的局限性1、分子量大，拷贝数低，第一个用于基因克隆的天然质粒、分子量大，拷贝数低，第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长，分子长 9.1 kb。但只但只有一个有一个
10、EcoR I切点充当克隆位点，切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。作为筛选标志。EColR I 酶切位点位于酶切位点位于Tetr 基因外基因外部，外源基因插入不会引起筛选基因失活，因此无法区别重组体和野生型质粒。部，外源基因插入不会引起筛选基因失活，因此无法区别重组体和野生型质粒。2、天然质粒、天然质粒ColE1质粒，长度为质粒，长度为6.3 kb，唯一的唯一的EcoRI酶切位点位于筛选标志基因大肠杆酶切位点位于筛选标志基因大肠杆菌素菌素E1（colicin E1）内部。）内部。colicin E1能杀死不含能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成质粒的菌，形成“噬菌斑噬菌斑”。可。可以通过
11、插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞。的细胞。u质粒载体的发展概况质粒载体的发展概况第一阶段（第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和和pBR322。第二阶段：增大载体容量第二阶段：增大载体容量(降低载体长度降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如如pUC系列载体。系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的
12、不同要求，如M13mp系列载体，含系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。理想质粒载体必须具备的基本条件：理想质粒载体必须具备的基本条件：u1、具有复制起点（ORI）u2、具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。u3、若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。u4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。质粒的选择标记及其工作原理：质粒的选择标记及其工作原理：绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记.氨苄青霉素抗性（氨苄青霉素抗性（Amp
13、r）:青霉素的衍生物。氨苄青霉素通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。卡那霉素抗性（卡那霉素抗性（Kanr）:卡那霉素通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读，从而杀死细菌。Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。四环素抗性（四环素抗性（Tetr）:四环素通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进入细菌细胞内。链霉素抗性（链霉素抗性（Strr）:链霉素通过与30S核
14、糖体亚基结合，导致mRNA错译，从而杀死细菌。Strr 编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合作用。氯霉素抗性（氯霉素抗性（Cmlr）:氯霉素通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死生长的细菌。Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉素乙酰化而失活。人工构建的质粒载体的类型人工构建的质粒载体的类型u高拷贝数的质粒载体高拷贝数的质粒载体pColE1、pMB1派生质粒具有高拷贝数的特点。在没有菌体蛋白质合成的条件下（蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在下）仍能复制，达到每个细胞的拷贝数10003000个。适合大量增殖克隆基因、或需要表达大量的
15、基因产物。u低拷贝数的质粒载体低拷贝数的质粒载体由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低，不适合大量扩增DNA用。但当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。如pLG338、pLG339、pHSG415等。u失控的质粒载体失控的质粒载体温度敏感型复制控制质粒，温度低于37度，拷贝数很少；温度增加，大于40度时，拷贝数会很快增加到1000个以上。B.E.Uhlin于1979年构建的载体如pBEU1、pBEU2等。u 插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、
16、pBR329。u 正选择的质粒载体正选择的质粒载体直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长。如pUR2、pTR262等。目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。u 表达型质粒载体表达型质粒载体主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录翻译信号控制之下。u 克隆质粒载体克隆质粒载体专用于基因和DNA片段无性繁殖的质粒载体。纯粹的获取基因和DNA片段。常用的质粒载体常用的质粒载体pBR3221、元件来源、元件来源复制起点复制起点 oripMB1
17、系列（来源于系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点）的高拷贝型复制起点Ampr基因基因pSP2124质粒的质粒的Ampr基因基因Tetr基因基因pSC101的的Tetr 基因。基因。2、长度、长度4363bp3、选择标记、选择标记氨苄青霉素和四环素抗性氨苄青霉素和四环素抗性4、克隆位点、克隆位点24个克隆位点，个克隆位点，其中其中9个会导致个会导致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind、Sal I）；）；3个会导致个会导致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。BamHI片段片段(Tcr)pBR322PstI(Apr)片段片段重组分子重组分子(A
18、ps Tcr)PstI片段片段 外源外源DNABamHI片段片段重组分子重组分子I(Apr Tcs）分别转化分别转化E.coli(ApS TcS)重组分子重组分子(Aps Tcr)影印到影印到Tc平板上平板上Apr Tcr为原载体为原载体即为非重组子即为非重组子 影印到影印到Ap平板上平板上重组分子重组分子I(Apr Tcs）涂布涂布Ap平板平板Apr转化子转化子 涂布涂布Tc平板平板Tcr转化子转化子Apr TcS为重组子为重组子ApS Tcr为重组子为重组子重组DNAAmprTcs提取DNA 电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转化 无菌落阳性菌落筛选重
19、组子2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切影印影印pBR322的优点的优点双抗菌素抗性选择标记双抗菌素抗性选择标记没有获得载体的寄主细胞没有获得载体的寄主细胞在在Amp或或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞中都死亡。获得载体的寄主细胞在在Amp或或Tet其中之一中死亡。其中之一中死亡。分子小，克隆能力大分子小，克隆能力大载体越小越好。载体越小越好。10kb的的DNA在纯化过程中容易断裂。在纯化过程中容易断裂。高拷贝数高拷贝数氯霉素扩增之后，每个细胞可达氯霉素扩增之后，每个细胞可达10003000copy。安全安全失去了转移蛋白基因失去了转移蛋白基因mob（mobiliza
20、tion）。不能通过接合转移。）。不能通过接合转移。pBR322的缺点的缺点保留了转移蛋白（保留了转移蛋白（mob）的作用位点。能够被）的作用位点。能够被pColK质粒编码的质粒编码的mob蛋白识别，蛋白识别，如果再有如果再有F质粒的参与，就有可能转移！质粒的参与，就有可能转移！pBR322的改良的改良u 删除删除mobmob识别位点识别位点如如pAT153，pBR322的改造衍生质粒的改造衍生质粒，除去了，除去了mob识别位点，同时增加质粒的识别位点，同时增加质粒的拷贝数。拷贝数。u 改造改造EcoR I 位点位点如如pBR325，使使EcoRI 也成为插入失活型位点。在也成为插入失活型位点
21、。在pBR322位点上接入一段来位点上接入一段来自噬菌体自噬菌体PICm的的HaeII酶切片断（带有氯霉素抗性基因酶切片断（带有氯霉素抗性基因cmlr）。）。cmlr上也带一个上也带一个EcoRI位点。位点。cmlr常用的质粒载体常用的质粒载体pUC系列系列1 1、元件来源、元件来源2 2、长度、长度3 3、克隆位点、克隆位点选择标记选择标记PUC系列质粒载体的选择标记是系列质粒载体的选择标记是Ampicillin 抗性和抗性和 lacZ的的a肽互补（蓝白斑）相结合。肽互补（蓝白斑）相结合。乳糖操纵子调节机制乳糖操纵子调节机制-半乳糖苷酶半乳糖苷酶-半乳糖苷酶和半乳糖苷酶和XgalXgal的显
22、色反应的显色反应-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），也叫-肽（lacZ）。Xgal是一种人工工合成的、无色的乳糖类似物；-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能.C端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aaC端大部分端大部分N端的端的11-41aa4聚体聚体大肠杆菌大肠杆菌-半乳糖基因（半乳糖基因（lacZlacZ基因）基因）-蓝白斑选择原理1、b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5
23、-溴-4-氯靛蓝；2、a-肽，也叫lacZ，是b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断，lacZ只有在a-肽形成4聚体的状态下才有功能。若受体菌lacZ突变，受体菌本身的b-半乳糖苷酶失效，不能分解Xgal。3、pUC载体上LacZ的5端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ的合成。4、IPTG的诱导作用：IPTG是乳糖的类似物。能诱导lac操纵子的启动转录，使受体菌基因组中的受体菌基因组中的lacZlacZ的C端部分和载体的载体的lacZlacZ都表达。5 5、IPTGIPTG诱导的结果：诱导的结果：MCSMCS无插入时，互补，蓝菌斑；无插入时，互
24、补，蓝菌斑；MCSMCS有插入时，不互补，白菌斑。有插入时，不互补，白菌斑。AprAprApr转化筛选重组子 白色菌落2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA重组DNA提取DNA 电泳AprAprApr1)限制酶切无质粒的无质粒的受体菌受体菌-半乳糖苷酶半乳糖苷酶部分缺失，不部分缺失，不能分解能分解XgalXgal；无抗菌素抗性无抗菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养无菌斑无菌斑生长生长质粒转化质粒转化的受体菌的受体菌-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的缺失被载体产物缺失被载体产物 互补，能分解互补，能分解XgalXgal。且有抗菌。且有抗菌素抗性素抗性在
25、含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有蓝色菌有蓝色菌斑生长斑生长带外源带外源DNADNA插插入的质粒转化入的质粒转化的受体菌的受体菌载体产物失活，载体产物失活，不能互补不能互补-半半乳糖苷酶的缺乳糖苷酶的缺失。不能分解失。不能分解XgalXgal，但有抗，但有抗菌素抗性菌素抗性在含抗菌素在含抗菌素和和XgalXgal的培的培养基上培养养基上培养有白色菌有白色菌斑生长斑生长1、更小的分子量。如、更小的分子量。如pUC18为为2682bp，pUC8为为2750bp。2、选择方便。、选择方便。Xgal显色、抗菌素双重直接选择。显色、抗菌素双重直接选择。3、克隆便利。具有
26、多克隆位点、克隆便利。具有多克隆位点4、测序方便。、测序方便。现在最常用的现在最常用的pUC载体是载体是pUC18，它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的，它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制，在正常情况下，它的拷贝数可达上千个，所以不分子标记，并且是松弛型复制，在正常情况下，它的拷贝数可达上千个，所以不需要用氯霉素进行扩增。需要用氯霉素进行扩增。pUC系列载体的优点系列载体的优点1 1pMDpMD系列载体：系列载体：Takara公司开发的公司开发的一种高效克隆一种高效克隆PCR产物产物(TA Cloning)的的专用载体。专用载体。它由它由pUC18载体载体改
27、建而成。在改建而成。在pUC18载体的多克隆位点处的载体的多克隆位点处的Xba I 和和Sal I识识别位点之间插入了别位点之间插入了EcoR V 识别位点，用识别位点，用 EcoR V进行酶切反应后，再在两进行酶切反应后，再在两侧的侧的3端添加端添加“T”而成。而成。pUC18载体载体EcoR V的酶切位点：的酶切位点：常用的质粒载体常用的质粒载体穿梭质粒载体穿梭质粒载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。复制的质粒载体。常用的穿梭质粒载体有：常用的穿梭质粒载体
28、有：大肠杆菌大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体枯草杆菌穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体酿酒酵母穿梭载体大肠杆菌大肠杆菌-动物细胞穿梭载体。动物细胞穿梭载体。穿梭载体的优点：穿梭载体的优点：利用大肠杆菌进行基因克隆、表达；利用大肠杆菌进行基因克隆、表达；也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达；也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达；可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。f1 origin是f1噬菌体基因组DNA的复制区序列，可引导单链DNA复制过程。pUC origin是大肠杆菌复制区
29、序列，可引导双链DNA复制过程。2u origin是酵母菌的复制区序列，可引导双链DNA复制过程。大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pcDNA3.1(+)质粒谱图及其用户实验手册讲解质粒谱图及其用户实验手册讲解 Important InformationMethods OverviewCloning into pcDNA3.1Multiple Cloning Site of pcDNA3.1(+)多克隆位点Multiple Cloning Site of pcDNA3.1(-)pcDNA3.1 Vectors MappcDNA3.1 Vectors MapFeat
30、ures常用的质粒载体常用的质粒载体表达载体表达载体原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。原核表达载体：适用于在原核细胞中表达外源基因的载体。1、普通载体元件、普通载体元件复制起始点复制起始点ORI 选择标记选择标记多克隆位点多克隆位点MCS2、大肠杆菌操纵子元件、大肠杆菌操纵子元件阻遏基因阻遏基因 I 操纵基因操纵基因O 启动基因启动基因P 核糖体结合位点序列（核糖体结合位点序列（SD）转录终止信号区转录终止信号区如果在大肠杆菌里表达蛋白，必须把所克隆的如果在大肠杆菌里表达蛋白，必须把所克隆的目的基因置于大肠杆菌的转录目的基因置于大肠杆菌的转录翻译信号控制翻译信号控制之下。之下
31、。1)特点特点:a.基因的启动子序列和终止子序列；基因的启动子序列和终止子序列；b.一般无检测标记基因；一般无检测标记基因；c.克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；d.重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。2)结构结构:a.转化单元转化单元-宿主细胞转化宿主细胞转化b.表达单元表达单元-外源基因表达外源基因表达3)类型类型:型：型：转录起始区（调控序列转录起始区（调控序列+启动子）启动子）+终止子终止子型：型：转录起始区转录起始区+翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）翻译起始区（核糖体结合序列和起
32、始密码子）+终止子终止子型：型：转录起始区转录起始区+翻译起始区翻译起始区+信号肽链编码区信号肽链编码区+终止子（常称之为表达分泌型载体）终止子（常称之为表达分泌型载体）表达载体（表达载体（expression vector）TAAATG I II III IV V I V I II VATG I II III VIIIIIIOri转录起始 翻译起始 信号肽 成熟蛋白质 转录终止区CSCSCSCS-cloning site显然，不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之，被表达的外显然，不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之，被表达的外源基因一旦确定，表达载体的类型也就
33、确定了。源基因一旦确定，表达载体的类型也就确定了。例子：例子：pET-43和和pPIC9K4)用途用途:a.表达外源基因以产生大量外源基因产物表达外源基因以产生大量外源基因产物b.用于构建用于构建cDNA文库文库5)注意事项注意事项:a.启动子来源启动子来源b.终止子来源终止子来源c.启动子的启动效率启动子的启动效率d.信号肽来源与结构信号肽来源与结构e.调控类型调控类型1.质粒稳定遗传必须的两个条件：质粒稳定遗传必须的两个条件：（1）每个世代、每个质粒至少要复制一次；）每个世代、每个质粒至少要复制一次；（2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细胞中。）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分
34、配到两个子细胞中。六、质粒载体的不稳定性六、质粒载体的不稳定性2.质粒分配方式：质粒分配方式：有主动分配和随机分配两种假说。有主动分配和随机分配两种假说。（1）主动分配。天然质粒具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（）主动分配。天然质粒具有一个控制质粒拷贝分配的功能区（Par），能以主动分配），能以主动分配的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。的方式确保质粒能正确分配到两个子细胞中。（2）随机分配。人工构建的质粒载体缺失了）随机分配。人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中。区，只能以随机分配方式分到子细胞中。一般情况下也能保证质粒的稳定遗传，但在一定条件下会出现质粒丢失
35、的现象。一般情况下也能保证质粒的稳定遗传，但在一定条件下会出现质粒丢失的现象。3.质粒分离的不稳定性（质粒分离的不稳定性（segregation instability）在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。势群体。4.结构的不稳定性（结构的不稳定性（structural instability）寄主基因组的寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。序列插入质粒、质粒间的同源重组等都会使质粒发生插入或缺失。ISdimer重组5.影响质粒载体稳
36、定性的主要因素影响质粒载体稳定性的主要因素（1）新陈代谢负荷：）新陈代谢负荷：a、复制负荷b、转录和翻译负荷使寄主细胞生长减缓：质粒载体使寄主的世代时间延长约15%。减缓的程度与质减缓的程度与质粒的分子量成正比。粒的分子量成正比。丢失质粒的细胞反而会成为优势群体！（2）质粒载体的拷贝数）质粒载体的拷贝数质粒载体的拷贝数质粒载体的拷贝数是产生无质粒细胞的重要原因。差度（variance）：每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。低拷贝数的质粒的差度小，遗传稳定。高拷贝数的质粒载体差度大，拥有少量拷贝数的菌体多，发生丢失的可能性大。（3）寄主菌的重组体系）寄主菌的重组体系含有大分子量插入片
37、断的质粒载体普遍能形成质粒二聚体。二聚体灾难（dimer catastrophe）：质粒在寄主的重组酶作用下会发生重组形成二聚体质粒。二聚体质粒的复制速度是单体的二倍！导致质粒失控。第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体一、噬菌体的一般特性一、噬菌体的一般特性细菌病毒（细菌病毒（Bacteriophage）噬菌体的蛋白质外壳内包裹着的噬菌体的蛋白质外壳内包裹着的DNA，DNA有双链、单链、线性有双链、单链、线性、环状等结构。、环状等结构。二、噬菌体的生活周期二、噬菌体的生活周期1.溶菌周期溶菌周期 烈性噬菌体烈性噬菌体感染细菌后，立即在菌体内复制感染细菌后，立即在菌体内复制DNA和合成外壳蛋白质，
38、重新组和合成外壳蛋白质，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。2.溶原周期溶原周期 温和噬菌体温和噬菌体感染细菌后，将自己的感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体整合到细菌的染色体DNA中中,这一过程这一过程称为溶源化。整合到细菌染色体上的噬菌体称为溶源化。整合到细菌染色体上的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。体复制而复制。噬菌斑噬菌斑三、三、载体载体的的5-突起末端（突起末端（5-GGGCGGCGACCT-3），该末端称为），该末端称为cos位点，可被位点，可
39、被编码的末端酶所识别编码的末端酶所识别 噬菌体从溶原转为裂解是一种可诱导过程。诱导的因素很多，实验室常用的是热诱导。如分离得到某些噬菌体clts857，在低温时（30）建立溶原，用高温（420C）则出现裂解。这些噬菌体的cl基因是温度敏感突变型的，称为c1ts。clts1857可作为组件插入质粒DNA内。目的基因插在clts857下游，重组体的目的基因在42表达，30不表达。这种方法称为热诱导表达热诱导表达，使用的是温敏开关。温敏开关。PL和PR是噬菌体上2个主要的启动子，都是启动能力相当强的转录构件。把启动子连同其附属成分，将pBR322的tetr基因进行替换，成为以启动子为组件的质粒。-D
40、NA载体的构建噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷：1、基因组太大（、基因组太大（49kb）；）；2、酶切点太多，它有、酶切点太多，它有5个个BamH1位点（位点（GGATCC），），6个个Bg位点（位点（AGATCT），），5个个EcoR位点（位点（GAATTC）。）。3 3、野生型只能接纳一定长度的、野生型只能接纳一定长度的DNA。噬菌体的改造：噬菌体的改造：1 1、切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）；或更大）；2 2、去掉太多的酶位点，每种酶只留去掉太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；个切口；3 3、增加标记基因；、增加标记
41、基因；4 4、引入无义突变。引入无义突变。载体类型：载体类型：1、插入型载体：、插入型载体：通过特定的酶切位点允许外源通过特定的酶切位点允许外源DNA片断插入的载体（片断插入的载体（0-11kb)。2、置换型载体：、置换型载体：允许外源允许外源DNA片断替换非必需片断替换非必需DNA片断的载体片断的载体(9-23kb)。-DNA载体的选择标记1、lacZ 基因基因：IPTG/X-gal 2、基因、基因 c 失活失活（热敏感）（热敏感）3、Spi 筛选筛选：野生型的：野生型的l噬菌体不能在噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生），这种生长抑制表型受
42、长抑制表型受-DNA上的上的red和和gam两个基因控制。若将外源两个基因控制。若将外源DNA取代取代red和和gam，重组噬菌体便拥有重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。成透明斑。代表性噬菌体载体1、插入型载体、插入型载体-gt10 载体载体2、置换型载体、置换型载体-EMBL3 基因 c被一段来自 434 噬菌体的片段 imm434替换了，其中内有一个 EcoR 位点。在填充片段两端带有对称的多克隆在填充片段两端带有对称的多克隆位点位点。四、单链噬菌体载体四、单链噬菌体载体1 M13 噬菌
43、体的生物学M13 噬菌体颗粒是丝状的，只感染革兰氏阳性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿噬菌体颗粒是丝状的，只感染革兰氏阳性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。裂。M13 噬菌体的基因组为单链噬菌体的基因组为单链 DNA（+DNA），由），由 6407 的碱基组成。基因组的碱基组成。基因组 90%以上的序列可编码蛋白质，共有以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为个编码基因，基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因几个碱基。较大的间隔
44、位于基因 和基因和基因 以及基因以及基因 和基因和基因 之间，其之间，其间有调节基因表达和间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。合成的元件。M13 噬菌体基因组可编码噬菌体基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白，形态发生蛋白，结构蛋类蛋白质，包括复制蛋白，形态发生蛋白，结构蛋白。白。M13M13没有包装限制：没有包装限制：2、单链噬菌体的特点：、单链噬菌体的特点：（1）存在两种类型，）存在两种类型，ssDNA和和RF dsDNA；（2）+DNA（ssDNA）；）；（3）复制型（）复制型（RF）是双链环状）是双链环状DNA；（4）RF dsDNA和和ssDNA都能转染感受态大肠杆菌，并产生噬
45、菌斑；都能转染感受态大肠杆菌，并产生噬菌斑；（5）不存在包装限制；）不存在包装限制；（6）可产生大量的含有外源）可产生大量的含有外源DNA插入片断的单链分子，便于作探针或测序。插入片断的单链分子，便于作探针或测序。J.Messing证明，证明，IG区存在区存在M13的复制起点，的复制起点，可以插入外源可以插入外源DNA而不影响而不影响M13噬菌体的噬菌体的活力。活力。M13的生活周期雄性细菌的雄性细菌的F性菌毛性菌毛：仅见于少数革兰阴性菌，比普通菌毛略微稍粗，一个菌体只仅见于少数革兰阴性菌，比普通菌毛略微稍粗，一个菌体只有有14根，通常由质粒编码。带有性菌毛的细菌具有致育能力，称为根，通常由质
46、粒编码。带有性菌毛的细菌具有致育能力，称为F+菌或者雄性菌。菌或者雄性菌。雄性菌的遗传物质能通过性菌毛传递给雄性菌的遗传物质能通过性菌毛传递给F-菌，这个过程称为接合。细菌可以通过这个方式菌，这个过程称为接合。细菌可以通过这个方式传递耐药性以及毒力。此外，性菌毛还是某些噬菌体感染宿主菌的受体。传递耐药性以及毒力。此外，性菌毛还是某些噬菌体感染宿主菌的受体。3.M13载体的构建载体的构建单链单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用噬菌体在用作载体时是利用其双链其双链 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象
47、质粒一样进行很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。操作，并可通过转化方法再次导入细胞。1）载体的插入位点）载体的插入位点在在 M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA。基因。基因 和基因和基因 之间的之间的 508bp 间隔区是主要的外源片段插入位点。在间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因基因 和基因和基因 之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，之间的小间隔区也可用来插入外源片段，但是在操作过程中，需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，
48、比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。需要获得感染细胞的菌落进行影印筛选，比利用可见的噬菌斑方法更慢更麻烦。2）M13 噬菌体载体组成噬菌体载体组成现在所使用的现在所使用的 M13 噬菌体载体是噬菌体载体是 Messing 及其同事建立的及其同事建立的 mp 系列载体，以基系列载体，以基因因 和基因和基因 之间的区域作为外源之间的区域作为外源 DNA 插入区。插入区。mp 载体系列都是从同一个重组载体系列都是从同一个重组 M13 噬菌体噬菌体（M13mpl）改造而来的。在改造而来的。在 M13mpl 载体中，间隔区内的载体中，间隔区内的 Hae 位点插入了一小段大肠杆菌位点插入了一小段大肠杆菌 D
49、NA，引入，引入laz的的 互补筛选。互补筛选。3）M13载体系列载体系列 M13载体系列的命名：载体系列的命名：M13mpn，n代表系列数字。代表系列数字。对对M13mp1的改进：加上常用的酶切位点。如的改进：加上常用的酶切位点。如B.Gronenborn和和J.Messing1978年把年把LacZ 5端的第端的第13个核苷酸个核苷酸G突变成突变成A，产生了一个，产生了一个EcoR I切切点，构建成点，构建成M13mp2。对对M13mp2的进一步改进产生了的进一步改进产生了M13mp系列载体。在系列载体。在M13mp2的的LacZ的的5端端加上一段人工合成的多克隆位点（加上一段人工合成的多
50、克隆位点（MCS）。如）。如M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19。4）M13mpl8 和和 M13mpl9M13mpl8 和和 M13mpl9 这两个载体含有这两个载体含有 13 个不同的酶切位点，可供插入由多种个不同的酶切位点，可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的各不相同的限制酶切割而成的 DNA 片段。片段。M13mpl8 和和 M13mpl9 DNA 的全序的全序列已经测定完成，这两种载体只是在列已经测定完成，这两种载体只是在 lacZ区内不对称的多克隆区的方向上有所区内不对称的多克隆区的方向上有所不同。不同。M13
