1、生物技术在园林植物 遗传改良上的应用,现代生物技术及其基本概念,（一）生物技术概念 生物技术（Biotechnology)，有时也称生物工程（Bioengineering）, 是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类产出所需产品。生物技术是一门综合性学科。现代生物技术已成功地应用于植物育种中。,（二）生物技术的种类,基因工程（Gene Engineering） 细胞工程（Cell Engineering ） 酶工程（Enzyme Engineering ） 发酵工程（Fermentation Engineering
2、 ） 蛋白质工程（Protein Engineering ）,（三）细胞工程,细胞工程就是在细胞水平研究开发、利用各类细胞的工程。亦即人们根据科学设计改变细胞的遗传基础，通过无菌操作，大量培养细胞、组织乃至完整个体的技术。,（四）克隆概念,分离基因的技术； 扩增基因的技术； 将单一细胞扩增成细胞群体的技术； 将一个生命体复制成一个与之完全相同的新个体的过程； 将单一个体扩增成一个遗传上完全相同的群体。 一个遗传上来源完全相同的生物群体。,第一节 组织培养,一、组织培养的相关概念,植物组织培养（tissue culture）是指用无菌方法使植物体的离体器官、组织和细胞在人为提供的条件下生长和发育
3、的所有培养技术的总称，也称之为离体培养（in vitro culture）。,植物细胞的全能性（cell totipotency） 一个植物细胞能产生一个完整植株 的固有能力称之为细胞的全能性。,外植体（ explant ） 用于培养的离体材料。,继代培养（ subculture ） 由最初培养新增殖的组织，继续转入新的培养基上培养的过程。,愈伤组织（ callus ） 在培养过程中，从植物各种器官、组 织的外植体增殖而形成的一种无特定结构 和功能的细胞团。,胚状体（ embryoid ） 由外植体或愈伤组织产生的，与正常受精卵发育方式类似的胚胎结构体。,二、植物组织培养的类型,愈伤组织培养
4、细 胞 培 养 器 官 培 养 原生质体培养,最为常见的组织培养,悬浮细胞培养 单细胞培养,胚、胚乳、珠心、子房、根、茎、叶、花和幼果的部分组织的培养,按材料的类别分,愈伤组织,按培养方法分为 固体培养 液体培养 看护培养 微室培养 包埋培养 按培养过程分为 初代培养 继代培养,二、植物组织培养的类型,三、植物组织培养在园林植物育种中的应用,快速繁殖植物品种、珍稀植物,三、植物组织培养在园林植物育种中的应用,脱除病毒，培养无病毒苗木,三、植物组织培养在园林植物育种中的应用, 离体诱发和筛选突变体 进行种质资源的长期保存和远距离运输 获得倍性不同的植株 克服种子发育和萌发中的障碍 克服远缘杂交困
5、难 提供育种中间材料,四、植物组织培养的基本操作,无菌操作技术 细胞培养技术 原生质体融合技术,接种用具的灭菌 接种前，必须把用具放入接种室或箱内，初用接种室或箱时要用甲醛（一般市售分析纯的有效成份为 36-38% 熏蒸5小时以上再开紫外光灯照射40-60分钟，以后在每次接种之前，把要接种的试管或三角瓶放入接种室（箱）内，用5%的煤酚瓶皂溶液即来苏尔（一般市售的有效成份为47-53%）或 5% 的石灰炭酸液喷雾消毒，再打开紫外光灯照20-40分钟，这样消毒后，再经30-40分钟便可进行接种。,接种材料的表面灭菌 接种前花蕾或穗的彻底灭菌是杜绝污染的主要关键，先用70-75%的酒精浸泡10-15
6、秒钟或用酒精棉球擦两遍，初步杀死表面所带的微生物，放在10%的漂白粉液或饱和漂白粉液中浸泡15-30分钟杀菌，然后用无菌水冲洗2-3次。 消毒过的穗子或花蕾用消毒纱布包好，待取花药接种，注意，穗子或花蕾的操作要在无菌条件下进行。,植物组织培养所需营养与环境条件 （1）无机营养 大量元素： 一般是指浓度大于0.5mmol/L.氮(N) 、磷(P) 、钾(K) 、钙(Ca) 、镁(Mg) 、硫(S) 。 微量元素： 包括铁(Fe) 、铜(Cu) 、钼(Mo) 、锌(Zn) 、钠(Na) 、锰(Mn) 、钴(Co) 、硼(B) 、碘(I)。 （2）有机营养 维生素、肌醇、氨基酸、有机添加物。 （3）
7、生长调节物 生长素：2，4 - D、奈乙酸(NAA)、吲哚丁酸（IBA）、吲哚乙酸(IAA) 。 细胞分裂素：激动素（KT）、6-苄基氨基嘌呤（6BA） 、玉米素（ZT）。 赤霉素（GA） ：脱落酸（ABA） 、乙烯利（CEDP）。,（4）琼脂 （5）能源和渗透压 （6）其他成分 （7）温度 （8）光照（光强、光质）,培养基的配制： 培养基母液的配制 ； 配制培养基的步骤； 培养基的分装及灭菌。,植物组织培养经历的五个阶段： （1）预备阶段 外植体的获得； 接种材料的消毒处理； 配制适宜的培养基； （2）诱导去分化阶段 （3）继代增殖阶段 （4）生根成芽阶段 （5）移栽成活阶段,第二节 原生质
8、体培养与 细胞融合,原生质体的概念 植物细胞原生质体是指那些以去除全部细胞壁的细胞。 此时，细胞外仅由细胞膜包裹， 呈圆形只有在高渗溶液中才能相对稳定。 原生质体经适当处理，可与其他细胞融合成新的体细胞。,细 胞,微 丝,叶绿体,线粒体,质 膜,液 泡,细胞核,内质网,微 管,细胞壁,高尔基体,植物细胞模式图,细胞壁由三种主要成分构成 纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%,一、原生质体培养发展简史及其意义,1、发展简史,1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体； 1960年： 1960年英国诺丁汉大学Cocking 教授率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的
9、番茄幼根细胞原生质体； 1968年：纤维素酶和果胶酶投入市场； 1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法。,1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首次获得再生植株。 1993年有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主要是农作物和经济植物，从一年生扩展到多年生，从草本到木本、从高等植物到低等植物，食用菌、藻类、大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、猕猴桃、桃、苹果、马铃薯、胡萝卜、黄瓜、杨树、云杉等； 1986年：Spangenberg单个原生质体培养成功；,2、原生质体培养的意义,（1）为细胞融合奠定基础
10、。 有性杂交不能进行细胞质交流,（2）是遗传工程的理想受体。 能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。,Isolated protoplast are capable of ingesting “foreign“ material into the cytoplasm. This material includes the introduction of nuclei, chloroplasts, mitochondria, DNA, plasmids, bacteria and viruses.,原生质体也具有全能性,原生质体是分子水平和细胞水平上研究遗传信息动态的结合点,（3）理论研究,
11、细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染。,因为细胞壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动。 但是必须指出：原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育。,二、原生质体分离及培养,（一） 分离方法 机械法：利刃机械切割 酶解法：果胶酶和纤维素酶处理,1、Machanical isolation,Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell.,In practice this
12、 technique is difficult and the yield of viable protoplasts is meager. One advantage, however, is that the deleterious effects of the wall-degrading enzymes on the metabolism of the protoplasts are eliminated.,从高度液泡化的细胞,2、Enzymatic isolation,双子叶外植体/培养细胞。,单子叶植物胚性细胞。,2-1 材料 获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。
13、叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此 常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。,2-2 酶的种类和浓度,纤维素酶（Cellulase） Onozuka R-10 果胶酶（Pectolyase）Y-23 半纤维素酶（Hemicellulase） 对幼叶来说，酶浓度较低：0.5-1纤维素酶，果胶酶(0.2-0.5); 酶量少 对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1或2。酶量大,酶液PH值：5.4-5.8 因为PH高，酶活性低 PH低，原生质体损坏多,2-3 酶液渗透压,裸露的原
14、生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作用。 常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8 mol/L。而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用。,2-4 材料预处理 (暗处理，预培养和低温处理) 在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶液处理。 原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原生质体内
15、电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。,2-6 其它,酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类,保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力,2-5 酶解处理的条件 光：一般黑暗下静止进行； 温度：25，兼顾原生质体及酶活性； 时间：几小时到几十小时，太长不利于原生质体的活性，一般24小时。如烟草叶片酶处理2小时后叶肉细胞解离完毕。,2-7 原生质体分离过程：一步法（以烟草叶片为例）,第一步：预处理即对烟草植株限制供水 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外表皮切成4cm的小块 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2
16、%和果胶酶0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6 第四步：将小块烟叶放入混合酶液25 处理810小时 第五步：过滤、离心、洗涤（ 0.7 mol甘露醇液含0.1 m mol CaCl2 ）。如此23次、得原生质体,图示原生质体分离过程（以叶片为例）,（二） 原生质体纯化,酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。 原生质体纯化方法有：离心沉淀法，漂浮法，接口法三种,1、 离心沉淀法,原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心
17、（5001000r/min离心56min）。 第三步吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新悬浮，再离心沉淀。如此23次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。,洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇， 10mmol/LCaCl2 H2O, 0.7mmolK H2PO4, 洗涤液pH： 5.6,2 、 接口法,以柑桔为例,原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。,2、 漂浮法,原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 洗涤液：3%蔗糖 + 0.4mol/L甘露醇+ 1480mg/L
18、CaCl2 2 H2O 。或11%23%的蔗糖溶液。,原生质体分离纯化流程图,（三） 原生质体活力测定,孢质环流法 FDA测原生质体活力的原理,（四）原生质体培养,固体包埋培养 液体浅层培养 固液培养,1、固体包埋培养,原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖（37C左右）混合，培养于培养皿中。,1-1、饲养层培养,方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.6%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。,方法二：X-射线杀死原生质体，与0.6%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.6%琼脂混合，培养于饲养层上
19、。,1-2、共培养法,将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合,前者为后者提供生长因素或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质,2、液体浅层培养,3、固、液培养,培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。,固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收。,（五）原生质体再生（Regeneration）,再生细胞壁,荧光增白剂（卡氏白，Calcafluor White),细胞由圆形变为椭圆形,第二次分裂,第一次分裂,第二次分裂,第三次分裂,多细胞团,肉眼可见细胞团,愈伤组织,愈伤组织,三、原生质体融合 原生质体融合也叫做体细胞杂交，是以原生
20、质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善的一门新型生物技术。 不同原生质体之间互相融合，发生胞质基因重组和/或核基因重组。,技术体系的3个环节： 原生质体融合；选择融合体； 杂种植株的再生和鉴定,1、原生质体融合意义,克服杂交不亲合 克服生殖器官败育 克服柑桔多胚,2、成 就,1972年 Carlson 建立第一株烟草体细胞杂种。 1975年柑桔原生质体培养成功； 现有苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功； 木本植物中柑桔最为成功。,番茄+马铃薯,3、融合方法,自发融合 (Spontaneous fusion) 诱发融合 (induced fusion
21、) 物理和化学方法,NaNO3 高pH-高Ca离子 PEG 电场融合,3.1 NaNO3法,1909年：Kuster证实引起亚原生质体融合 1970年：Power报道可重复控制原生质体融合 1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。,NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原 生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高。,3.2 高pH-高Ca离子法,1973年：Keller和Melchers用pH10.5的50 mMCaCl2溶液在37时，诱发烟草叶肉原生质体融合。,优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。,3.3 PE
22、G法,PEG：Polyethylene Glycol（聚乙二醇）,1974年： Kao KN和Michayluk采用此法大大提高融合频率。 1976年： Kao发现用高pH和高Ca结合融合频率更高。 用高钙强碱溶液代替培养基清洗PEG。,PEG法特点：,融合频率高 可重复性强,植物+植物 植物+动物 动物+酵母,诱发融合无特异性,毒性较低,PEG法原理,PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而
23、导致融合。,桥梁,示意图,3.4 电融合法,Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合,电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极，一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。,电融合仪,电融合法原理,交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。,施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。,原生质体的融合过程包括3个主要阶段： 1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合； 3)融合完成，形成球形
24、的异核体或同核体。,原生质体融合后的培养同原生质体培养,供体-受体式细胞融合包括非对称杂交和细胞质杂交两种方式。 非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一亲本的少量核物质(12条染色体)和全部细胞质融合； 细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。,4、体细胞杂种细胞筛选,1互补选择法（两次不同培养条件的培养） 第一次培养条件只适合于甲亲本而不适合乙亲本，一段时间后，生存下来的是：1)未经融合的甲亲本；2)甲甲融合的产物；3)有甲亲本基因存在的甲乙融合产物。 转入第二个培养条件，
25、只适合乙亲本原生质体生长，甲原生质体死亡。 两次培养之后，能存活下来的只有具甲乙亲本基因并得到互补的杂种细胞。,异硫氰酸荧光素（FITC）和 异硫氰酸罗丹明（RITC） 分别发出绿色和红色,2. 荧光染料法 两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料进行染色。 细胞分类器辨别和收集发两种荧光的异核体。 但仪器价格昂贵，不常用。,5、体细胞杂种的鉴定,形态学 细胞学 遗传标记,5-1、形态学,比较再生植株与融合亲本在形态上的异同株高、株型、叶片大小、形状、气孔的大小与多少，花的形状、大小及颜色。,5-2、细胞学,染色体形态和数目的比较,18条染色体,36条染色体,5-3、遗传标记,SS
26、R RFLP 同工酶 RAPD AFLP,分析所鉴定植株是否具有融合亲本的遗传物质,再生植株同时具有亲本的带； 再生植株在一种情况下具有一个亲本的带，在另一种情况下具有另一个亲本的带。,RAPD带型,RAPD带型,6、体细胞杂种的应用,培养抗病的新品种 野生种的抗逆性转移到栽培种（马铃薯，烟草） 果树上，砧木，接穗 合成新材料 远缘杂交，科间/属间，个体的育性问题。 转移细胞质基因控制的性状。,作砧木应用,果树砧木是处于嫁接口以下的地下部分，砧木本身的果实性状对于地上部分的果实无什么影响，砧木要求抗性好，与地上部分亲和。,生产无籽柚,柚为我国特色水果，栽培面积已达100万亩，其中50%为沙田柚
27、 沙田柚品质佳，但不足在于种子多，最多可达120粒 能能否生产无籽或少籽柚？,沙田柚，我国的柚子良种，种子多,沙田柚授以柑橘异源四倍体体细胞杂种花粉后结果状。 （2000, 江西赣州）,横切面,纵切面,对照果实,处理果实,对照种子,处理种子,筛选商用品种,NOVA + SUCCARI SOMATIC HYBRID FRUIT,pink marsh grapefruit + murcott tangor somatic hybrid fruit,Succari + Minneola somatic hybrid fruits,第三节 植物基因工程,一、植物基因工程的概念,植物基因工程（ plan
28、t genetic engineering ）是指按照人们的意志，通过一定的程序，将具有遗传信息的 DNA 片段，在离体条件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因，引入适当的植物受体中进行复制和表达的技术。,二、基因工程的基本步骤,目的基因的获取,基因载体的选择与构建,目的基因与载体的拼接,重组子导入受体分子,外源基因的表达和产物的分离,重组子的检测,4. 观赏植物基因工程的目的基因,1、观赏性 开花、花色、花型、花径相关基因。 2、抗逆性 抗虫、抗旱、耐盐碱、抗寒相关基因 3、切花寿命 4、花期调控,二、基本技术及原理,（一）DNA重组技术 将外源DNA片段与载体分子连接，形成
29、重组DNA分子，再将重组子导入寄主细胞内。这一技术体系称为DNA重组技术。,DNA 重 组 技 术,（二）基因工程的基本概念,1. 转化（Transformation)： 是指将外源DNA导入受体细胞的过程。 2. 复制子（Replicon)： 具有一个复制起点 (ori) 的DNA分子称为一个复制子。 3. 载体（Vector）： 能与外源DNA连接并实现转化的复制子。 4. 重组子（Recombinant）： 连接了外源DNA分子的复制子。,（三）基因工程的工具酶,限制性内切酶（restriction endonuclease) DNA连接酶（ligase) 末端修饰酶,（五）基因工程的载
30、体系统,1、质粒载体 2、噬菌体载体 3、病毒载体,质粒图谱及质粒构建 启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子 （标记基因） 目的片段 选择标记 载体,(六) 植物基因工程的报告基因,定义 特点 在选择培养基上生长 报告基因与目的基因嵌和表达 研究调控区,报告基因的种类 新霉素磷酸转移酶（ Neomycine phosphotransferase II, NPT II)基因 氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicol acetyltransferase, CAT）基因 潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase, Hpt）基因 葡萄糖酸苷酶
31、（ Glucuronidase, GUS）基因 荧光素酶（Luceferase, Luc）基因 抗除草剂（Basta, Bar）基因,三、转基因操作的方法,(一)外源DNA导入植物细胞的方法,载体介导的转化方法 DNA直接导入法 种质系统法,外源DNA导入植物细胞的方法,1、致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 2、病毒介导的基因转移 3、基因枪介导的基因转化 4、PEG诱导的基因转化 5、脂质体介导 6、电激法介导 7、超声波介导 8、显微注射 9、激光微束 10、种质系统介导基因转化法,1、致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法,含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细胞接触后，Ti质粒的一部分（
32、T-DNA）可以导入植物细胞，整和到植物基因组DNA随其复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载体， 与含目的片段的DNA片段重组，导入致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入植物细胞。,根瘤农杆菌及Ti质粒,Ti质粒 根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为共价闭合环状的DNA分子。,Ti质粒的功能 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； 参与寄主细胞合成激素的能力； 诱发植物产生冠瘿瘤； 赋予寄主分解冠瘿碱的能力； 决定寄主范围。,Ti质粒的结构 T-DNA区 Vir 区 Con 区 Ori 区,Vir 区,E,Ti Plasmid,T-DNA区,Ori 区,Co
33、n 区,Vir 区操纵子的基因结构与功能 Vir区是一段长度为35KB操纵子 包含六个基因： VirA、VirB 、 VirC 、 VirD 、 VirE 、 VirG。,T-DNA的结构与功能,植物遗传转化的载体系统,一元载体（顺势载体）,双元载体（反式载体）,农杆菌介导的转化质粒的构建,P G2 T NOS,Ampr P G1 T,Vir区,农杆菌导入方法,共培养法 叶盘转化法 整株感染法 原生质体共培养法,2、基因枪介导的转基因操作,基本原理 操作步骤 优点 影响转化效率的因素,Bio-Rad Biolistic DS-1000/He and Hepta System,Bio-Rad B
34、iolistic DS-1000/He and Hepta System,操作步骤 预培养 转基因操作 转基因植株筛选和培养 转基因植株的鉴定 田间释放,影响转化效率的因素 金属微粒 DNA沉淀辅助剂 DNA纯度和浓度 微弹速度 植物材料,基因枪法的优点 无宿主限制； 靶受体类型广泛； 可控度高； 操作简便。,问题： 转化效率低； 嵌合体多； 稳定性差，瞬时表达； 外源基因沉默； 整合机理不详。,3、PEG诱导的基因转化,聚乙二醇（PEG）、多聚鸟苷酸、磷酸钙在高PH值条件下诱导原生质体扑获DNA分子。,步骤： 共保温； 稀释PEG； 非选择培养； 选择培养。,优点： 转化顺利，对细胞伤害小；
35、 避免嵌合体的生成； 易于选择； 便于进行理论研究； 受体广泛。,4、脂质体介导,用化学物质将DNA包裹成球体，通过植物原生质体的吞噬作用，把DNA导入细胞。,5、电激法介导,利用高压脉冲作用，在原生质体上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。,6、超声波介导 7、显微注射 8、激光微束,9、种质系统介导法,生物媒体转化系统,(二) 转基因操作的受体系统,1、高频再生体系的建立 愈伤组织再生系统 直接分化再生系统 原生质体再生系统 胚状体再生系统 生殖细胞再生系统,2、抗生素敏感实验 抑制细菌生长 杀死非转化细胞 3、农杆菌敏感实验,(三) 转化细胞的培养和转基因植株的再生,恢复生长
36、筛选培养 植株再生,四、转基因植物的鉴定,遗传鉴定 表达鉴定 表型分析鉴定,利用报告基因 Northern 杂交 Western 杂交,直接鉴定DNA分子是否整合到基因组上。 1）扩增目的片段； 2）杂交信号鉴定。 （Southern 杂交）,鉴定步骤： 筛选鉴定（利用质粒上的选择标记） 报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因） 遗传鉴定 生长试验,Southern DNA印迹杂交,植物遗传转化流程,适宜外植体的选择及再生体系的建立,抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择,遗传转化操作,载体介导的 转化方法 DNA直接导入法 种质系统法,选择培养,转基因植株鉴定,获得再生植株,转化质粒的构建,转基因
37、植株的繁殖与应用,利用报告基因 Southern 杂交 Northern 杂交 Western 杂交,五、基因工程的安全性,（一）安全问题的考虑 工程菌株的处理 转基因植物的释放 转基因产品的安全,1.转基因作物本身成为杂草； 2.转基因作物使其亲缘野生种成为杂草或超级杂草； 3.转基因作物可能产生新的病毒或疾病； 4.转基因作物对非目标生物的危险； 5.转基因作物作为外来种对新生境的入侵，使生物多样性受到威胁； 6.转基因作物对生态系统及生态过程的影响； 7. 其它一些不可预计的风险。,（二）转基因植物的风险,（三）生物安全的管理,法国为对遗传修饰生物体(GMO)的评价和立法成立了两个专门委
38、员会。 第一个是遗传工程委员会，成立于1975年，任务集中于实验室的重组DNA的研究； 1986年又成立了生物分子工程委员会，它的任务是评价遗传修饰生物体的大田试验、释放以及商品化过程的安全问题。,进入90年代特别是1992年联合国环境与发展大会的召开，更加促进了国际上对生物安全立法工作的重视，特别是大会由许多国家签署的两个纲领性文件21世纪议程和生物多样性公约均在有关条款中提到了生物技术安全问题。,1993年，在原国家科学技术委员会领导下成立了国家生物遗传工程安全委员会，由来自卫生部、农业部、轻工业部的专家组成，负责医药、农业和轻工业部门的生物安全。 目前，在中国负责生物安全的部门有国家环保
39、总局、科技部、农业部、卫生部、国家医药管理局、中国科学院和教育部等。,1996年7月10日农业部颁布的农业生物基因工程安全管理实施办法是一部较完善、较好的“实施办法”。,农业转基因生物安全管理条例 中华人民共和国国务院令 第304号 农业转基因生物安全管理条例已经2001年5月9日国务院第38次常务会议通过，现予公布，自公布之日起施行。 总 理 朱镕基 2001年5月23日,基因,基因克隆,基因转化,DNA重组技术,植物遗传转化技术,植物组织培养技术,分子标记技术在育种中的应用,1. DNA遗传标记的特点： 数量极多； 遗传上稳定； 排除了环境差异.,2. DNA遗传标记的应用,构建遗传图谱； 分析亲缘关系； 定位农艺性状； 分子标记辅助选择； 种质资源及杂种后代的鉴定。,3. 分子标记技术,RFLP Restriction fragment length polymorphisms RAPD AFLP SSR SSLP,
