1、临床微生物检查,南方医科大学南方医院 芮勇宇,某年9月某日晚上，某院急诊科一病人。 突然起病，寒战、剧烈头痛、恶心呕吐。 面色潮红、眼结膜充血、咳嗽。 左耳红肿热痛，体温40。,案例分析,医生及时抽血进行血液培养，血常规白细胞增高及核左移。 初步诊断败血症，收入院，使用泰能。 但是使用泰能3天，病人症状没有改善，血液培养阴性，给家属下病危通知书。,案例分析,请南方医院专家会诊，详细询问病史和仔细体查，得到重要线索。 病人一周前爬过白云山，躺在草地上休息。 病人左耳有似被蚊虫叮咬后形成焦痂。,案例分析,怀疑恙虫病，外裴试验阳性。 -内酰胺类药物对恙虫病无效，首选四环素类抗生素，1天后退热，继续用
2、药1周，病人康复出院。 “临床微生物检查”重要性：明确临床诊断和指导临床合理用药。,案例分析,“临床免疫学检验”实验室：酶链免疫吸附试验（ELISA）、胶体金层析试纸条、化学发光或电化学发光、乳胶凝集方法。 检测肝炎病毒、性病、呼吸系统病原体抗原或抗体。,检验科三个实验室合作“临床微生物检查”,“临床分子生物学检验”实验室：荧光定量PCR方法，定量检测病原体基因。 “临床微生物学检验”实验室（重点）：细菌真菌涂片检查、培养鉴定、耐药性检查。,检验科三个实验室合作“临床微生物检查”,第一部分 细菌真菌涂片检查 第二部分 细菌真菌培养鉴定 第三部分 细菌真菌耐药性检查,Part 1 Morphol
3、ogical examinations of bacteria and fungi,1 non-stained. 2 gram stain, bacteria and fungi. 3 acid-fast stain, acid-fast bacillus. 4 Indian ink stain, cryptococcus.,single-celled, budding forms called yeast (spore). multicellular, filamentous forms called mold (spore and hypha). dimorphic fungi, exis
4、t in two distinct morphologic forms.,1 Non-stained,Skin scraping, nail scraping, hairs. Employing a drop of potassium hydroxide (15%) on a glass slide over the surface of the specimen.,hairs,Skin scraping,Routine urine examination,Basic principle ? Peptidoglycan. Procedure ? crystal violet, iodine,
5、alcohol. carbofuchsin red.,2 Gram-stained,Results, G+ or G- bacteria, cocci or bacilli bacteria, bacteria or fungi, in oil immersion field.,2 Gram-stained,fungi in urine,positive cultured blood,positive cultured blood,positive cultured blood,positive cultured blood,positive cultured blood,positive c
6、ultured blood,positive cultured blood,sputum,sputum,sputum,sputum,sputum WBC25/LP 上皮细胞10/LP 提示炎症 培养结果意义大,Fungi in leukorrhea, vaginitis,Diplococcus Neisseria gonorrhoeae,Basic principle? Lipid. Procedure? carbolfuchsin red, hydrochloric acid 3% alcohol, methylene blue.,3 acid-fast stain,Results, aci
7、d-fast bacteria red, other bacteria and background blue.,3 acid-fast stain,The result report mode Negative, acid-fast bacilli not found, Positive (1 or 2), 1 or 2 whole visual field, Positive （+）, 3 to 9 whole visual field, Positive （+）, 10 to 99 whole visual field, Positive （+）, 1 to 9 every visual
8、 field, Positive （+）, 10 every visual field.,acid-fast bacilli from sputum（+）,Cryptococcus in cerebrospinal fluid. Basic principle ? capsule. Procedure ? sediment.,4 the Indian ink stain,Cryptococcus neoformans,germinative,Advantages. cheap, rapid, diagnose primarily. Disadvantages. Not accurate.,Pa
9、rt 1 Morphological examinations of bacteria and fungi,第一部分 细菌真菌涂片检查 第二部分 细菌真菌培养鉴定 第三部分 细菌真菌耐药性检查,第二部分 细菌真菌培养鉴定,一、血液 二、尿液 三、粪便 四、呼吸道 五、穿刺液 六、分泌物,一、血液的细菌真菌培养鉴定 Etiologic Examination of Blood and Bone Marrow,目的和意义； 采血指征； 采血注意事项; 结果报告形式。,目前我国社会老龄化日趋严重，慢性病及恶性肿瘤、器官移植、爱滋病和结核病病人不断增多，侵袭性诊疗技术广泛应用，败血症发病率不断增加。
10、败血症病死率30%以上；早期病原学诊断和合理抗生素治疗，明显降低败血症病死率。,血液培养的送检指征：,发热38，或低温10109/L，“核左移”白细胞增多； 粒细胞减少，成熟的多核白细胞90次/分；呼吸频率20次/分； 二氧化碳分压32mmHg；昏迷；多器官衰竭； 血清降钙素原和C反应蛋白升高； 严重局部感染（如严重肺炎同时采痰液和血液）。,最好在抗生素使用前采集， 若已用抗菌药须，则尽量避开血药浓度的高峰期，最好在下次用药前。,血液标本采集时间,血液标本采集时间,建议第一次可在病人发热初期或高峰期采集， 根据病人发热情况，在24h内再取2-3次标本， 最好每次“双套”“双瓶”， “双套”指不
11、同采血部位， “双瓶”指需氧瓶和厌氧瓶。,血液标本采集时间,需氧瓶，中和抗生素的树脂瓶 厌氧瓶，营养丰富，提高兼性厌氧菌检出率 血液量3-10ml，8-10ml最佳。,儿童瓶，中和抗生素的树脂瓶 血液量1-3ml。,注射器采血后，将血培养瓶帽子揭下，橡皮由金属皮（围脖）固定于瓶上； 将橡皮塞用70%酒精消毒，注射器针头刺穿橡皮塞将血注入培养瓶内； 橡皮塞裸露即可。,已采集血液的培养瓶尽快送检。 立即放入自动血液培养及检测仪器。,阳性初步结果报告： 仪器阳性报警，90%以上阳性标本24h内检出； 取出阳性瓶，对血液涂片及革兰染色； 立即将涂片结果（G+、G-细菌，球菌或杆菌，或真菌）作为危急值报
12、告电话通知相应科室，或在网上发出。,结果报告形式,阳性最终结果报告： 将阳性血液接种血平板培养细菌； 第二天将血平板上生长的细菌鉴定及MIC法药敏试验； 第三天发鉴定及MIC法药敏结果的正式报告。,结果报告形式,血液中分离750株菌主要种类及构成比%,阴性结果报告： 自动化仪器培养5天仍为阴性，发阴性报告。,结果报告形式,二、尿液的细菌真菌培养鉴定 Etiologic Examination of Urine,目的和意义； 采集方法; 结果报告形式。,检测泌尿系统感染； 细菌和真菌培养、菌落计数和药敏； 也可离心后对沉渣进行涂片检查，革兰染色或抗酸染色。,目的和意义,常采集中段尿，晨起第一次尿
13、送检最佳； 肥皂水或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗女性外阴部及尿道口或男性尿道口，再用灭菌水清洗，最后用灭菌纱布檫拭； 排尿弃去前段尿，留取中段尿约10ml于无菌容器内加盖送检。,采集方法,尿道病原菌可在温暖尿液中繁殖，中段尿标本采集后应尽快送检，否则将影响病原菌计数的准确性； 排尿困难者可导尿，避免多次导尿所致尿路感染，导尿包必须为无菌的合格产品。,采集方法,“培养出3种以上细菌，疑采集污染，重留标本”： 如培养出3种或以上细菌，且无优势菌；约10%的标本不合格，采集时污染，采集中段尿（尤其女性）最好由专门医护人员指导采集，以减少污染。,结果报告形式,“培养出少量某种细菌、菌落计数结果”：
14、如菌量较少 103ml，但为单一菌种， 可能为采集时污染， 可能是尿液在膀胱中存储时间过短， 也可能是真正的感染。,结果报告形式,“培养出某种细菌、菌落计数结果、药敏结果”： 一般认为细菌或真菌105ml ，且必须有优势，才可以确定为感染，对优势菌进行鉴定和药敏。 104ml至105ml，也有意义。,结果报告形式,尿液中分离1014株菌主要种类及构成比%,三、粪便的细菌真菌培养鉴定 Etiologic Examination of Stool,目的和意义：对肠道疾病进行病原学诊断； 涂片染色：查真菌、弧菌、球菌/杆菌比； 培养病原菌和药敏： 培养沙门氏和志贺菌；培养弧菌；培养真菌； 菌群失调病
15、人，对占优势细菌进行鉴定药敏。,标本采集： 挑取含脓、血或粘液粪便约2-3g； 置于清洁容器或置于保存液中送检； 排便困难者或婴幼儿可用直肠拭子采集。,检查上下呼吸道感染 痰液（下呼吸道）和咽拭子（咽喉部）； 可进行涂片查细菌、真菌或抗酸杆菌； 可进行细菌、真菌或结核杆菌培养； 上述检查只要一口痰即可，在一张检查申请单上选上述多个项目。,四、呼吸道标本的细菌真菌培养鉴定,采集深部痰（sputum），不是唾液和口水； 自然咳痰法(Expectorated sputum)； 最好为清晨第一口痰，用清水反复漱口用力咳出第一口痰于无菌容器内； 支气管镜采集法（Bronchoscopy）。,采集方法,报
16、“正常菌群”： 培养出的均为不致病的细菌； 培养出的细菌种类较多且无优势菌。,结果报告形式,报“无菌生长”： 病人抗生素使用过度导致； 可能病毒、支原体、衣原体等血平板无法培养。,结果报告形式,报“分离出某种细菌或真菌，比例，药敏”： 分离出致病菌，而不是常见的正常菌群，且具有优势，约占血平板菌群总数的百分比%； 同一病人如痰中连续分离出同一种菌，3天内如果已经做过药敏试验，则不再做药敏； 同一病人痰中细菌的种类和比例，会随着治疗情况变化，也受留取痰标本的质量影响。,结果报告形式,痰液中分离1882株菌主要种类及构成比%,五、穿刺液的细菌真菌培养鉴定 Etiologic Examination
17、 of Cerebrospinal Fluid,目的和意义：判断是否为感染性疾病 脑脊液采集：通过腰椎穿刺术（Lumber puncture）以无菌操作采集脑脊液3-5ml于无菌小瓶或无菌试管中，一般第一管用于微生物学检查；,引起脑膜炎的病原体脑膜炎奈瑟菌等抵抗力弱，不耐冷，故采集的脑脊液应立即保温送检或床边接种; 可查一般细菌真菌、隐球菌、抗酸杆菌。,其它穿刺液：胸腹水、关节腔液等，将注射器直接送检，或床旁接种血培养瓶； 如为多管穿刺液或相关组织，请在申请单上注明是否都做培养鉴定； 注意无菌操作；如培养出类白喉杆菌，常为采集时污染所致。,六、伤口分泌物的细菌真菌培养鉴定,开放性化脓灶：应先用
18、灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，再用棉拭子蘸取或注射器吸取脓性分泌物； 瘘管内脓液：先用灭菌棉拭子挤压瘘管弃去前端脓液，再收集脓汁；,封闭性脓肿：可用注射器穿刺抽取。 疑为厌氧菌感染者：取脓液后立即排净注射器内空气，针头插入无菌橡皮塞送检； 如为液体，最好床旁接种厌氧血培养瓶； 外界相通部位标本，如痰不能厌氧菌培养。,伤口分泌物中分离1208株菌主要种类及构成比%,六、生殖道分泌物的细菌真菌培养鉴定 Etiologic Examination of STDs,性传播疾病，简称性病，是一组通过性行为传播的，侵犯皮肤、性器官和全身多脏器损害的感染性疾病； 标本采集：常取生殖道分泌物，男性取尿道口分泌物
19、或前列腺液，女性取外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物等。,淋病（gonorrhea） 涂片染色镜检： 急性淋菌性尿道炎敏感度和特异度高达90%以上；对慢性无症状淋病的女性患者涂片检查漏诊率达40%，故必须同时进行培养。 培养鉴定及药敏结果准确，诊断金标准。,解脲/人型支原体： 细菌室开展了培养鉴定及药敏方法； 需注意的是标本采集后应尽快送检。 诊断试剂和方法要符合卫生部相关规定； 注意保护病人的隐私。,第一部分 细菌真菌涂片检查 第二部分 细菌真菌培养鉴定 第三部分 细菌真菌耐药性检查,第三部分 细菌真菌耐药性检查,一、常用药敏试验方法 二、常用抗生素种类 三、药敏试验结果解读,一、常
20、用药敏试验方法 (1)MIC稀释法 (2)K-B纸片扩散法 (3)E-test法,MIC稀释法一般在琼脂或肉汤中将抗菌药物系列对倍稀释，定量接种待检菌， 35培养18至24小时后观察结果； 抑制检测菌肉眼可见生长的最低药物浓度，即最小抑菌浓度； MIC稀释法结果以MIC（g/ml）数值报告，数值越小越敏感，与K-B法相反；,(1)MIC稀释法,细菌自动鉴定及药敏分析仪,MIC稀释法药物浓度主要包括折点浓度，可以判断敏感、中介、耐药， 少数药物如亚胺培南、美罗培南、头孢他啶，万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺等在判断敏感的基础上，又增加了一些低浓度，以利于合理选用药量， 不同抗生素判断的折点浓度不同，
21、故不同抗生素之间的MIC值没有可比性。,(2)K-B纸片扩散法,补充药敏板没有的抗生素，如头孢哌酮/舒巴坦。 含有定量抗菌药物的纸片，贴在已接种待检菌的MH平板上， 纸片中所含的药物，吸取琼脂中的水分溶解后，不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的药物梯度浓度。,在纸片周围抑菌浓度范围内，细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。 抑菌圈大小，反映待检菌对测定药物敏感程度。 不同抗生素有不同的判断标准，不同抗生素的抑菌圈大小没有可比性。,(3)E-test法,结合K-B法和稀释法的优点； 原理同稀释法检测，操作同K-B法简单； 试纸条上含干化、稳定、浓度由高到低呈指数梯度分布的某种抗菌药物。 补充鉴定药
22、敏板没有的抗生素，如替加环素（老虎素）。,二、常用抗生素种类 临床和实验室标准化委员会（clinical and laboratory standards of institute, CLSI）系列指南，每年更新。,多烯类：两性霉素B、制霉菌素。 唑类：克霉唑、咪康唑、益康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、伏立康唑。 核苷类：氟胞嘧啶。 棘球白素类：卡泊芬净。,真菌药敏试验常用药物,三、药敏试验结果解读 临床和实验室标准化委员会（clinical and laboratory standards of institute, CLSI）系列指南，每年更新。,敏感（Susceptible，S） 是指菌
23、株能被使用推荐剂量治疗感染部位可达到的抗菌药物浓度所抑制，推荐使用。,中介（Intermediate，I） 指抗菌药物MIC接近血液和组织中通常可达到的浓度，疗效低于敏感菌株。 还表示药物在生理浓集的部位具有临床效力（如尿液中的喹诺酮类和-内酰胺类），或者可用高于正常剂量的药物进行治疗（如-内酰胺类）。 另外，中介还作为缓冲区，以防止微小的、未受控制的技术因素导致较大的错误结果，特别是对那些药物毒性范围窄的药物。,耐药（Resistant，R） 指菌株不能被常规剂量抗菌药物达到的浓度所抑制， 和/或证明MIC或抑菌圈直径落在某些特殊的微生物耐药机制范围（如-内酰胺酶）， 在治疗研究中表现抗菌药
24、物对菌株的临床疗效不可靠。,产超广谱-内酰胺酶G-杆菌(extended spectrum-lactamase G- bacillus，ESBLs) 该酶是指由质粒介导的能水解所有青霉素类、头孢菌素类及单环-内酰胺类氨曲南的一类酶，主要见于肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。,耐碳青霉烯类抗生素的G-杆菌 指对碳青霉烯类抗生素亚胺培南、美罗培南等耐药的G-杆菌，主要为不动杆菌属（鲍曼和非鲍曼不动杆菌）、铜绿假单胞菌，近几年出现耐碳青霉烯类抗生素的肠杆菌科，需引起重视。,耐甲氧西林葡萄球菌（methecillin resistance staphylococcus，MRS） CLSI规定，葡萄球菌如对苯唑
25、西林（或甲氧西林）耐药：对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和含酶抑制剂的复方制剂均应报告耐药，而不考虑体外药敏结果。,耐高浓度庆大霉素肠球菌（High level aminoglycosides resistance in Enterococcus） CLSI规定，肠球菌引起的全身性严重感染，常联合应用-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素，如果肠球菌对高浓度庆大霉素耐药，则联合用药无效。 耐万古霉素肠球菌（VRE），用E-test法验证。,上述多重耐药菌、泛耐药菌，要求每天在检验单审核结束后，及时向临床科室和医院感染控制科报告，以及时采取相应的防控措施，避免多重耐药菌、泛耐药菌的扩散、流行或暴发。,第一部分 细菌真菌涂片检查 第二部分 细菌真菌培养鉴定 第三部分 细菌真菌耐药性检查,
