1、ALK靶点及其检测方法1994年ALK基因异常首次在淋巴瘤中被发现 ALK基因异常首次在间变性大细胞淋巴瘤中被发现(ALCL),并因此而得名“ALK”（anaplastic lymphoma kinase）间变性大细胞淋巴瘤激酶 ALK融合到核磷蛋白（NPM）的N-末端部分(NPM-ALK)导致ALK基因组成性激活。Science 1994;263:12814Blood 1997;89:1678852007年首次在非小细胞肺癌中发现EML4-ALK融合基因EML4EML4ALK variant 1HELP1496981WDBasic14961059110581620TMKinaseALKEML
2、4-ALKNMP-ALKNature 2007;448:56172007年首次在非小细胞肺癌中发现EML4-ALK融合类型，并证实为肺癌的驱动基因。并且越来越多的研究表明ALK融合在NSCLC当中以较为稳定的频率出现，大约5%。Permanent proliferation&inhibition of apotosisEML4-ALK fusion proteinsilenced bycrizotinibProliferation&survivalupon ligand bindingto ALK配体配体ALK受体受体细胞外细胞内正常正常ALK 信号信号细胞外永久扩增和凋亡抑制永久扩增和凋亡抑
3、制细胞外克唑替尼抑制克唑替尼抑制EML4-ALK 融合蛋白融合蛋白病理性病理性ALK信号信号克唑替尼克唑替尼作用模式作用模式 配体与配体与ALK结合后，结合后，扩增和存活扩增和存活由于与EML4融合，ALK激酶区异常激活多效蛋白?肝素结合细胞因子?随着ALK靶向抑制剂的发现，ALK基因越来越多的受到重视2007,Soda&Mano首次发现EML4-ALK基因2009,Alice T.Shaw首次出现EML4-ALK阳性非小细胞肺癌的称谓，并将其定义为NSCLC的独特亚型2010,Kwak EL:证实克唑替尼治疗有效，但仍沿用EML4-ALK阳性非小细胞肺癌的称谓Soda M,et al.Nat
4、ure 2007;448(7153):561-566.Shaw AT,et al.J Clin Oncol 2009;27:4247-4253.Kwak EL,et al.N Engl J Med 2010;363:1693-1703.NSCLC临床病理分型的演变AdenocarcinomaSquamous-cell carcinomaLarge cell carcinoma组织分型 Current Standard of NSCLC CareNon-squamousNSCLC 分型现状SquamousEGFR WTEGFR MuSquamousEGFR MuKRAS MuALK+Other
5、non-squamous WTSquamous2012NCCN2014NCCNEGFR MuALK+KRAS MuOther non-squamous WTSquamousROS1+2010NCCNNCCN Guidelines,NSCLC,Version 4.2014Horn L,et al.Clin Oncol.2009驱动基因分型 早期NSCLC分子分型与治疗决策密切相关HER2EGFR mutantsALKROS/RETb-rafK-rasChemotherapy and PCIAdenoLCC/NOSSCCSCLCK-rasALK阳性非小细胞肺癌有哪些特点？ALK阳性NSCLC具有鲜
6、明的临床及病理特征特征EGFR突变EML4/ALK组织学腺癌 TTF1+腺癌TTF1+亚型非粘液型粘液型吸烟状态不吸烟不吸烟人种东亚所有人种发病年龄66岁52岁性别女性无差异Shaw AT,et al.J Clin Oncol 2009;27:4247-4253.85.4%的ALK阳性NSCLC年龄65岁(PROFILE1007)与EGFR突变人群相比，ALK融合人群年龄更轻ALK阳性患者的中位年龄比EGFR阳性患者中位年龄小15岁低年龄组ALK阳性率高于EGFR在低于51岁的人群中，ALK阳性率高于EGFR阳性率，可达18.5%，所以对于年轻患者来说，在标本限制的情况下建议先检测ALK靶点。
7、Scientific Reports;Li Zhang,2014中国中国ALK突变的发生率有多高？突变的发生率有多高？AuthorAuthorALK incidenceALK incidencePublicationsPublicationsZhang X,Wu YL et al.11.6%(12/103)Mol Cancer 2009Wong,et al.(Hongkong)4.9%(13/265)Cancer 2009Li H,Chen HQ,et al.3.0%(7/230 smokers,ACsmokers,AC)Lung Cancer 2012Sun Y,Chen H,Ji H,et
8、 al.5.8%(3/52 surgical AC,non-smokerssurgical AC,non-smokers)JCO 2010Wu SG,Yang PC,et al.(Taiwan)34%(39/116,AC,WT EGFRAC,WT EGFR)JTO 2012Rikova K,et al4.7%(6/137)Cell 2007Wang Z,Wang J,et al.9.7%(11/113,Stage IVStage IV)Oncology 2012Ren S,Zhou C,et al.9.6%(10/104,Female,Female,AC,non-smoker AC,non-s
9、moker)Cell Biochem Biophys.2012;Cancer 2012早期患者（手术标本）ALK阳性率4.5%，晚期患者ALK阳性率8%-10%，胸水标本的ALK阳性率可达11%。不同人种中克唑替尼的疗效的差异不同人种中克唑替尼的疗效的差异ID患者数患者数ORR(%)PFS（月）（月）所有所有亚裔亚裔(%)所有所有非亚裔非亚裔亚裔亚裔中国中国所有所有非亚裔非亚裔亚裔亚裔中国中国PROFILE100114941(28)60.854.876.9-9.7-PROFILE100525993(36)59.8547073.98.1-PROFILE1007347157(45)65-74.77
10、57.77.18.1-PROFILE1014343157(46)747270-10.9-13.6-Fei-Yu Niu,Yi-Long Wu.Onco Targets and Therapy 2 May 2015 亚裔或者中国患者，亚裔或者中国患者，ORR维持在维持在70%以上；克唑替尼以上；克唑替尼一线治疗亚裔患者，一线治疗亚裔患者，中中位位PFS达到达到13.6个月个月什么样的人群需要进行ALK检测？更 新更 新内容内容2 0 11版版2015版版对临床实践影响对临床实践影响诊诊断断病 理报 告内容未提及分子病理诊断结果诊断内容包括肿瘤部位、组织学亚型、累及范围（支气管、胸膜、脉管、神经、
11、伴随病变类型、肺内播散灶、淋巴结转移情况等）、切缘及必要的特殊染色、免疫组化结果或分子检测结果免疫组化结果或分子检测结果。包含的信息应满足临床分期的需要，并给出pTNM分期。规范诊断：规范诊断：标准NSCLC诊断需尽可能注明EGFR&ALK基因状态（如：右肺上叶腺癌T3N2M1（骨）-IV期 ALK融合基因阳性）N S CLC驱动 基因 检测未推荐EGFR&A L K检测对于晚期NSCLC、腺癌或者含腺癌成分的其他类型肺癌，应在诊断的同时常规进行表皮生长因子应在诊断的同时常规进行表皮生长因子（EGFR）和间变性淋巴瘤激酶（）和间变性淋巴瘤激酶（ALK）等基因突）等基因突变检测变检测，检测前应有
12、送检标本的质控（包括亚型确认及样本量确认）。检测标本类型包括活检组织、细胞学标本和细胞蜡快，检测方法推荐使用获得国家食品药品监督管理总局批准的检测方法或试剂。常规检测：常规检测：晚期NSCLC诊断同时，需常规检测EGFR&ALK基因状态（特殊情况除外）非小细胞肺癌靶向个体化诊疗策略更新要点非小细胞肺癌靶向个体化诊疗策略更新要点P71P69腺癌腺癌/大细胞癌大细胞癌/NOS应该进行应该进行EGFR及及ALK检测检测少吸烟少吸烟/小活检肺鳞癌，不能排除混合性成分，需要小活检肺鳞癌，不能排除混合性成分，需要进行进行EGFR/ALK检测检测为了识别出已经有有效药物治疗的罕见驱动基因靶点，NCC指南强烈
13、推荐强烈推荐对肿瘤病人进行更广谱更广谱的肿瘤驱动基因肿瘤驱动基因检测，或为病人推荐可获得的临床研究。广谱的驱动基因筛查是改善NSCLC预后的关键Version 4.2016强调分子检测的重要性强调分子检测的重要性如何检测ALK融合突变？CFDA获批的三种诊断方法ALK break-apart FISH assay(Abbott Molecular,Vysis probes)ALK immunohistochemistry(Roche Ventana)SplitIsolated redAmoy Dx EML4-ALK融合基因检测试剂盒RT-PCR（厦门艾德）19荧光原位杂交（FISH）5ALKE
14、ML43阳性阳性（分离 倒位）2p23-215ALKEML43倒位（70）基因融合阴性阴性两个信号之间的距离小于2个信号直径 12 Mb本图由Lukas Bubendorf提供实时逆转录法（RT-PCR）原理20逆转录酶（AMV）催化合成cDNA第一条链加入PCR成分用Takara Ex TaqTM HS合成cDNA第二条链扩增cDNART-PCR试剂盒的原理试剂盒的原理EML4ALK上游引物下游引物融合点检测探针VENTANA IHC 试剂设计ALK融合蛋白融合蛋白:无ALK重排的NSCLC不表达ALK融合蛋白 部分ALK融合蛋白表达较低Ventana IHC的原理的原理:使用具有高度敏感性
15、和特异性的一抗D5F3 全自动仪操作，充分保证特异性 独有Optiview扩增技术，充分保证敏感性D5F3 rabbitt monoclonal antibodyOptiview DAB IHC DetectionOptiview Amplification Kit01+2+3+NegPosPosPosCST-IHCVentana-IHCPosVentana-IHC原理：在常规IHC之后加入扩增信号，并且通过充分洗涤一抗避免假阳性-创建一个创建一个“二元二元”的判读系统的判读系统J.Ying,et al.Annals of Oncology 2013;VentanaVentana IHCIHC
16、与与FISHFISH检测结果比较检测结果比较FISH总数敏感性特异性一致率阳性阴性Ventana IHC(1)阳性46753100%98.20%98.40%阴性0377377Ventana IHC(2)阳性3103194%100%99.10%阴性2198200Ventana IHC(2)阳性32032100%100%100%阴性0217217Ventana IHC(3)阳性4024291%96%94%阴性45357Ventana IHC(4)阳性1801890%100%99.60%阴性2503505Ventana IHC(5)阳性63265100%98.4%98.9%阴性0131131(1)(
17、1)JinghuiJinghui Wang,et al.Wang,et al.PLoSPLoS ONE 2014 9(7):e101551 ONE 2014 9(7):e101551(2)(2)EugenEugen C.C.Minca,etMinca,et al.al.J Mol Diagn 2013,15:341-346J Mol Diagn 2013,15:341-346(3)(3)MurryMurry W.W.Wynes,etWynes,et al.J al.J ThoracThorac OncolOncol.2014;9:631638.2014;9:631638(4)(4)Greta,
18、etGreta,et al.Arch al.Arch PatholPathol Lab Med.Lab Med.doidoi:10.5858/arpa.2013-0388-OA:10.5858/arpa.2013-0388-OA（5 5）J.Ying;etJ.Ying;et al.Annals of oncology.2013,24:2589-2593 al.Annals of oncology.2013,24:2589-259324全自动VENTANA IHC优势一 判读标准简单，仅存在阴性 or 阳性的判读 IHC 阳性=FISH 阳性25全自动VENTANA IHC优势二 全自动检测，避
19、免操作流程中的误差，可重复性好26全自动VENTANA IHC优势三 价格便宜，可同时用于ALK的筛选和诊断EMEAEMEA（欧盟）、（欧盟）、CFDACFDA批准批准VentanaVentana IHC IHC用于诊断用于诊断ALKALK阳阳性性NSCLCNSCLC，从而帮助确定可，从而帮助确定可使用克唑替尼的患者使用克唑替尼的患者VENTANA IHC试剂盒已于2013.8全部获得CFDA批准，用于检测ALK阳性NSCLC第一次切片 HE（腺、鳞、非小细胞型）第二次切片 各种IHC第三次切片 EGFR（ALK等）第四次切片 各种少见突变ALKALK Ventana检测推荐的检测时间1：节约标本节约标本-针对非小细胞肺癌在第二次切片的时候多切2张切片2：节约费用节约费用用IHC的方法让更多患者得到筛查3：节约时间节约时间随病理大报告同时得到ALK结果2930细胞学标本检测ALK针对锁骨上淋巴结FNA，和胸水，都可以常规进行Ventana IHC检测
