1、2021/3/13概 述 遗传性疾病 是由遗传物质改变所导致的疾病或缺陷，按一定的方式垂直传递。我国每年新出生人口中6患有不同的遗传病，新增遗传病患儿约120万 遗传病的发病率逐渐升高2021/3/13遗传病的分类 基因病 染色体病 体细胞遗传病单基因遗传病单基因遗传病 多基因遗传病多基因遗传病2021/3/13一、单基因遗传病的分子诊断2021/3/13定 义单基因遗传病(monogenic disease)指单个基因突变所引起的遗传病。特点：病种较多，单个疾病发病率低 临床表现复杂多样 遗传规律符合孟德尔定律2021/3/131.单基因遗传病发病的分子机制单基因遗传病的基因突变类型 基因的
2、外显子或内含子完全或部分缺失 基因的单碱基突变 三核苷酸重复突变 基因部分片段重复转录，基因产物大小改变 插入突变，基因组其他部位的DNA片段插入到目的DNA序列内2021/3/132.单基因遗传病的分类v 常染色体显性遗传v 常染色体隐性遗传v X连锁显性遗传v X连锁隐性遗传v Y连锁遗传2021/3/13(1)常染色体显性遗传 (autosomal dominant inheritance,AD)致病基因位于常染色体一对等位基因中只要有一个致病基因就可表现出基本性状男女患病机会相等如：先天性软骨发育不全病、亨廷顿病2021/3/13(2)常染色体隐性遗传 (autosomal reces
3、sive inheritance,AR)致病基因位于常染色体 携带一个隐性致病基因的杂合子不表现症状，只有获得一对隐性基因的纯合子才表现出相应症状 男女受累机会均等如：苯丙酮尿症、白化病2021/3/13(3)X连锁显性遗传 (X-linked dominant inheritance,XD)致病基因位于X染色体 以显性遗传的方式向后代遗传 男性患者的女儿全部为患者，儿子全部正常，女性患者的子女中各有50可能性是患者如：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、假性甲状腺功能减退病2021/3/13(4)X连锁隐性遗传 (X-linked recessive inheritance,XR)致病基因位于X染
4、色体 女性在纯合子时表现出相应性状；携带一个隐性致病基因时，为表型正常的致病基因携带者 男性X染色体上有一个隐性致病基因就会发病如：甲型血友病、红绿色盲2021/3/13(5)Y连锁遗传 (Y-linked inheritance,YL)致病基因位于Y染色体 伴随Y染色体以显性遗传方式向男性后代传递 只有男性才表现出相应性状如：外耳道多毛症2021/3/132021/3/133.单基因遗传病的基因诊断 表型诊断 根据症状体征来判断病因并诊断 分子诊断（基因诊断）直接检测患者基因(DNA)或其转录产物(mRNA)诊断疾病 基因诊断是当前诊断遗传病最精确的方法2021/3/13(1)基因诊断的思路
5、 从蛋白质入手 从蛋白质到核酸，由表型至基因型 从DNA入手 由DNA到蛋白质 从候选基因入手2021/3/13从蛋白质入手明确蛋白产物明确蛋白产物测定蛋白质的氨基酸序列测定蛋白质的氨基酸序列合成合成DNA探针探针筛选编码基因或筛选编码基因或cDNA克隆克隆DNA测序确定导致疾病的分子缺陷测序确定导致疾病的分子缺陷2021/3/13从蛋白质入手 通过该策略诊断许多单基因遗传疾病 白化病 苯丙酮尿症 镰状细胞贫血 该策略已较少采用2021/3/13 从DNA入手连锁分析确定致病基因的染色体定位连锁分析确定致病基因的染色体定位在该区域内搜索、分离致病基因在该区域内搜索、分离致病基因找到导致遗传病的
6、分子缺陷找到导致遗传病的分子缺陷阐明正常与异常基因产物的生理功能和病理效应阐明正常与异常基因产物的生理功能和病理效应2021/3/13从DNA入手 当前遗传性疾病诊断的主要策略 杜氏肌营养不良 亨廷顿舞蹈病 该策略的关键是DNA标志物2021/3/13从候选基因入手将某一疾病基因初步定位将某一疾病基因初步定位以该区域中已克隆的无名基因、以该区域中已克隆的无名基因、cDNA等为候选者等为候选者根据定位结构是否相同来鉴定疾病相关基因根据定位结构是否相同来鉴定疾病相关基因此方法具有速度快、效率高的优点此方法具有速度快、效率高的优点2021/3/13(2)基因诊断的途径 确定单基因遗传疾病后，再确定基
7、因检测的方法 采集先证者与其父母的DNA；携带者基因分析时，需采集与患者、携带者有血缘关系的亲属样品 从人体组织的有核细胞中提取分离DNA 外周血有核细胞、口腔黏膜、毛囊细胞2021/3/13(2)基因诊断的途径 DNA印迹法(Southern blotting)分析基因或基因片段的缺失、插入或动态突变 PCR与其衍生技术 分析核苷酸取代、缺失或插入造成的点突变 基因芯片技术 自动化、微量化、高通量2021/3/134.单基因遗传病基因诊断中存在的问题(1)遗传异质性(genetic heterogeneity)由同一或不同基因座的不同突变所致的非常类似的表型 同一种表型可由多个不同的基因型控
8、制 大多数遗传病都有遗传异质性2021/3/13 遗传异质性1)等位基因异质性 由同一基因座不同突变所致非常类似的表型地中海贫血可由100多种突变引起2)基因座异质性 由不同基因座不同突变所致非常类似的表型2021/3/134.单基因遗传病基因诊断中存在的问题(2)基因突变的多样性 基因突变包括缺失、插入、替换和动态突变等(3)临床诊断是基因诊断的基础 基因诊断前注意临床诊断的准确性 多数遗传病需依靠多态性标志物进行家系连锁分析，确定疾病相关基因2021/3/134.单基因遗传病基因诊断中存在的问题(4)基因诊断方法的选择 根据基因诊断的目的慎重选择方法 产前诊断时，应选择高特异性和高灵敏度的
9、方法，可同时应用两种以上原理不同的方法进行检测，减低误诊率2021/3/13(二)常染色体显性遗传病的分子诊断亨廷顿病(Huntington disease,HD)常染色体显性遗传病 常于3045岁缓慢起病，临床表现为进行性加重的舞蹈样不自主运动和智能障 患者大多有家族史，患病率为5/10万10/10万2021/3/131.HD基因的结构与定位 亨廷顿病相关基因ITl5 (interesting transcript 15)位于染色体4p16.3，由67个外显子构成，编码产生蛋白质huntingtinIT15基因外显子1的起始密码子ATG下游17个密码子处有一段多态性的CAG重复序列，转录翻译
10、产生一段聚谷氨酰胺连于huntingtin蛋白的N端2021/3/132.ITl5基因在HD中的变化 正常IT15基因的(CAG)n重复长度为934个重复单位 HD患者n36，最多超过120 疾病状态下，IT15基因(CAG)n重复的多少与发病的早晚、疾病的严重程度呈正比2021/3/132021/3/133.亨廷顿病的基因诊断方法基因诊断主要检测(CAG)n重复次数 普通PCR：检测出重复次数较少的小片段 Southern印迹法：分析重复次数很大的样本2021/3/132021/3/13(三)常染色体显性遗传病的分子诊断镰状细胞贫血 (sickle cell anemia,SCA)2021/
11、3/13(三)常染色体显性遗传病的分子诊断镰状细胞贫血 (sickle cell anemia,SCA)常染色体隐性遗传病 血红蛋白基因突变导致镰状血红蛋白(HbS)取代正常血红蛋白(HbA)热带非洲黑人发病率高达402021/3/13 1.镰状细胞贫血的遗传学发病机制 珠蛋白基因第6位密码子GAG变为GTA，HbA的链第6位谷氨酸被缬氨酸取代，形成HbS 缺氧时，HbS溶解度降低，在细胞内聚合，红细胞变形扭曲成镰刀状2021/3/132 镰状细胞贫血的基因分型 纯合子(SS)型 没有正常的血红蛋白，病情严重杂合子(AS)型 镰状细胞基因携带者，一般无异常表现，仅在低氧情况下出现镰状红细胞双重
12、杂合子型 临床症状轻微2021/3/133.镰状细胞贫血的基因诊断方法 限制性内切酶分析法 限制性内切酶Mst DNA印迹法 等位基因-RFLP连锁分析2021/3/13限制性内切酶分析法利用内切酶Mst消化待检的DNA样品正常的A和突变的S第5-7位密码子序列：正常A：CCTGAGGAG 突变S：CCTGTGGAG 第6位密码A变成T，使Mst II不能识别2021/3/13(四)X连锁显性遗传病的分子诊断脆性X综合征(fragile X syndrome,FraX)X连锁显性遗传病 最常见的遗传性智力障碍 男性群体中的发生率为1/20001/1000，男、女患病的比率为2:12021/3/
13、13脆性X综合征 2021/3/131.脆性X智力障碍基因的结构与定位 脆性X基因(FMR-1)缺陷使FMR-1蛋白(FMRP)生成减少或缺乏，导致脆性X综合征 FMR-1基因位于Xq27.3，在基因组中跨越38 kb，由17个外显子和16个内含子组成2021/3/132.脆性X智力障碍基因的突变特征 FMR-l基因5端外显子上的非翻译区有一(CGG)n重复序列的多态性结构，正常人群(CGG)n重复次数在650之间1)FMR-1基因(CGG)n重复序列异常扩增前突变：(CGG)n重复数为50200全突变：(CGG)n重复数2002021/3/132.脆性X智力障碍基因的突变特征(2)FMR-1
14、基因5端CpG岛的异常甲基化 FMR-1转录受抑制或减弱，FMRP表达受阻(3)FMR-1基因的缺失和点突变 FMR-1基因的错义突变和缺失型突变影响 FMRP的正常结构2021/3/133.脆性X综合征的基因诊断方法1)Southern blot分析 检测(CGG)n的拷贝数和甲基化状态 确认全突变与前突变 适用于患者与携带者的诊断2)PCR方法 扩增(CGG)n重复序列，检测扩增片段长度 嵌合体患者有较小的(CGG)n片段，也有PCR扩增产物，可导致假阳性2021/3/13(五)X连锁隐性遗传病的分子诊断Duchenne肌营养不良(DMD)和Becker肌营养不良(BMD)X连锁隐性遗传性
15、疾病，主要累与男性个体 Xp上抗营养不良蛋白(dystrophin)基因突变引起的一组肌肉疾病 2021/3/131.Dystrophin基因 Dystrophin基因定位于Xp21，长达2 400 kb，有79个外显子 DMD：dystrophin基因表现为显著丢失甚至 缺失，临床症状较重 BMD：dystrophin基因结构发生改变，但能 够指导合成蛋白，症状较轻2021/3/132.Dystrophin基因的突变特征 基因突变率较高 基因突变形式多样缺失、点突变、重复、微小缺失或微小重复 缺失和重复的热点1)Dystrophin基因5端和中央区2)小突变位于dystrophin基因的非编
16、码区2021/3/133.DMD/BMD的基因诊断方法(1)基因缺失的检测常用方法 Southern印迹法 多重PCR 定量PCR 限制性内切酶分析 脉冲场凝胶电泳 荧光原位杂交技术(FISH)多重连接依赖式探针扩增技术(MLPA)微阵列比较基因组杂交技术(array-CGH)2021/3/133.DMD/BMD的基因诊断方法(2)基因点突变的检测 变性高效液相色谱分析(DHPLC)单链构象多态性分析(SSCP)异源双链多态分析(HA)化学错配碱基裂解法(CMC)RT-套式PCR 截短蛋白试验和直接测序2021/3/133.DMD/BMD的基因诊断方法(3)基因检测应注意的问题 检测技术尚难在
17、一般实验室普与 检测中应注意设置对照，做好质量控制 检测前与患者沟通2021/3/13二、多基因遗传病的分子诊断2021/3/131.多基因遗传病的概念 多基因遗传(polygenic inheritance)指生物和人类的许多表型性状由不同座位的较多基因协同决定，而非单一基因的作用。2021/3/132.多基因遗传特点基因微效性 多基因遗传时，每对基因的性状效应是微小的协同作用 不同微效基因可协同累加作用，导致表型产生环境因素 多基因遗传表型受环境因素的影响，是基因与环境结合形成的一种性状2021/3/132.多基因遗传病的分子诊断策略(1)基因直接检测法 适用于已知基因异常的疾病(2)基因
18、间接检测法 适用于致病基因已知，但其异常未知；或 致病基因本身未知 对受检者与其家系进行连锁分析，推测受 检者是否获得致病基因 2021/3/132.多基因遗传病的分子诊断 糖尿病的分子诊断 冠心病的分子诊断 阿尔茨海默病的分子诊断2021/3/13三、出生缺陷与产前诊断2021/3/13（一）出生缺陷 指胚胎或胎儿在发育过程中发生的结构或功能的异常。1.出生缺陷的类型 畸形缺陷 裂解缺陷 发育不良 变形缺陷2021/3/13（一）出生缺陷2.出生缺陷的发生因素 源于受孕前的原因 染色体异常、单基因缺陷、多基因缺陷 源于受孕后的原因 宫内暴露环境因素 不明原因2021/3/13（二）产前诊断(
19、prenatal diagnosis)在胎儿期对先天性疾病或遗传性疾病进行诊断 利用非侵入性或侵入性手段对胎儿进行特异 性检查 判断胎儿的染色体或基因是否正常 预防遗传病患儿出生2021/3/131.产前诊断的指征 女方35岁，男方45岁 不良妊娠史、不良生育史 本人患遗传病或家族中有遗传病患者 遗传检查异常 超声波检查异常 母亲血清学筛查异常 有毒物、射线接触史 孕期有病原感染史、服药史2021/3/132.产前分子诊断策略(1)细胞遗传学检查 经典细胞遗传学方法 染色体检查或核型分析 分子细胞遗传学方法 荧光原位杂交(FISH)染色体涂染(chromosome painting)光谱核型分析技术(SKY)比较基因组杂交(CGH)微阵列-比较基因组杂交(array-CGH)2021/3/132.产前分子诊断策略(2)基因诊断 以来源于胎儿的DNA、RNA为原料，检查胎儿基因的存在、缺陷或表达异常PCRDNA测序DNA芯片MLPA技术2021/3/133.非侵入性产前分子诊断非侵人性产前分子诊断材料A.经宫颈脱落的胎儿滋养细胞B.母体外周血中胎儿细胞 滋养细胞、淋巴细胞、粒细胞、有核红细胞C.母体外周血中胎儿游离DNA 2021/3/13(三)单基因遗传病的产前分子诊断v假性肥大性进行性肌营养不良(DMD/BMD)v软骨发育不全(ACH)v苯丙酮尿症（PKU）2021/3/13
