1、第四章：蛋白质的结构与功能第四章：蛋白质的结构与功能第一节：蛋白质第一节：蛋白质一一.什么是蛋白质什么是蛋白质?蛋白质蛋白质(protein)是由许多氨基酸是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键通过肽键(peptide bond)相连相连形成的高分子含氮化合物。形成的高分子含氮化合物。What are proteins?分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺，
2、某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达及横纹肌等高达80。催化作用催化作用高效专一地催化机体内几乎所有高效专一地催化机体内几乎所有的反应的反应酶酶运输作用运输作用专一运输各种小分子和离子专一运输各种小分子和离子如血红蛋白如血红蛋白调节作用调节作用调节机体代谢活动调节机体代谢活动如胰岛素、钙调如胰岛素、钙调蛋白、阻遏蛋白蛋白、阻遏蛋白运动作用运动作用负责机体的运动负责机体的运动如肌动蛋白、肌如肌动蛋白、肌球蛋白球蛋白防御作用防御作用防御异体侵入机体防御异体侵入机体如免疫球蛋白、如免疫球蛋白、病毒外壳蛋白病毒外壳蛋白营养作用营养作用作为氨基酸的贮库，用于生长发育所需作为氨基酸的贮库，用于生长发
3、育所需或某些物质与蛋白质结合而被贮存或某些物质与蛋白质结合而被贮存如卵清蛋白、酪如卵清蛋白、酪蛋白、麦醇溶蛋蛋白、麦醇溶蛋白、铁蛋白白、铁蛋白结构蛋白结构蛋白 作为构建机体某部分的材料作为构建机体某部分的材料如如a-角蛋白、胶角蛋白、胶原蛋白原蛋白二.蛋白质在机体中的重要作用What do proteins do?三.蛋白质的化学组成C、H、O、N，大多含有大多含有 S有的还含有有的还含有P、Fe、I、Cu、Mo、Zn1.元素组成元素组成各元素的百分比对于大多数蛋白质都较相似，各元素的百分比对于大多数蛋白质都较相似，其中其中N约占约占16%。因此可通过测定生物样品中的含氮量计算出样品中蛋白质的
4、含量，1克氮就相当于6.25克蛋白质，（凯氏定氮法）。凯氏定氮法）。2.蛋白质的基本结构单元蛋白质的基本结构单元v 蛋白质的基本结构单元是蛋白质的基本结构单元是氨基酸氨基酸 amino acidv 多个氨基酸首尾连结形成长而不分支的多聚物多个氨基酸首尾连结形成长而不分支的多聚物多肽链多肽链v 多肽链再折叠卷曲，形成多肽链再折叠卷曲，形成蛋白质蛋白质第二节：氨基酸第二节：氨基酸H1.由R基团的性质 2.由aa的营养需求 几种特殊氨基酸几种特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸proline（亚氨基酸）（亚氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2Specific am
5、ino acidsSpecific amino acids 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸二硫键二硫键-HH(Cysteine)(Cysteine)三三.稀有稀有氨基酸氨基酸1.稀有的蛋白质氨基酸 2.非蛋白质氨基酸氨基酸同时含有氨基和羧基：氨基酸同时含有氨基和羧基：氨基具有氨基具有碱性碱性，羧基具有羧基具有酸性酸性H|RCC|NH3+OOH+-H+H-H|RCC|NH3+OO-H|RCC|NH2OO+-H+H强碱溶液强酸溶液两性离子四四.氨基酸的理化性质氨基酸的理化性质 1.两性性质甘氨酸的解离曲线甘氨酸的解离曲线滴定曲线滴定曲线H NCH COO22_H N CH COO32+_H N
6、CH COO32+_H NCH COO22_H N CH COOH32+H N CH COO32+_H N CH COOH32+pK=2.341 pI=5.97 pK=9.602Hcl的摩尔数NaOH的摩尔数6-12-1-3-9-000.50.51.0 pH两性性质和等电点 在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的溶液的pH值称为该氨基酸的等电点，值称为该氨基酸的等电点，用用 pI 表示表示(isoelectric point,pI)。pI 是氨基酸
7、的特征常数是氨基酸的特征常数等电点 等电点的计算等电点的计算例例 Gly 的的pI 计算计算H+H+NH2 CH2 COOGly NH3 CH2 COO Gly NH3 CH2 COOHGly H+H+K1K2K1、K2分别代表分别代表COOH和和NH3的表观解的表观解离常数。可以从离常数。可以从滴定曲线中求得。滴定曲线中求得。等电点的计算等电点的计算例例 Lys 的的pI 计算计算溶液 pH 值增大COOHCHNH3(CH2)4NH3Lys COOCHNH2(CH2)4NH2Lys COOCHNH3(CH2)4NH3Lys H+H+Lys COOCHNH2(CH2)4NH3H+H+H+H+K
8、1K2K3例例 Glu 的解离的解离等电点的计算等电点的计算结论除除Gly之外之外，其余蛋白质氨基酸都有手性碳，其余蛋白质氨基酸都有手性碳原子，都具有旋光性。原子，都具有旋光性。旋光性质旋光性质2.光学性质Trp、Tyr、Phe 含芳香环共轭双键系统，最大吸含芳香环共轭双键系统，最大吸收峰分别在收峰分别在 279nm、278nm、259nm。紫外吸收紫外吸收2.光学性质茚三酮反应茚三酮反应 还原性茚三酮还原性茚三酮OOOHH NH3CO2 RCHO水合茚三酮水合茚三酮RCHCOOHNH2OOO 2NH3OOOHH OOOONH4N O 3H2O蓝紫色化合物蓝紫色化合物OO3.重要的化学性质茚三
9、酮反应茚三酮反应 Sanger反应反应O2NNO2FH2NCHCOOHR O2NNO2 HNCHCOOHR HFEdman反应反应NCSNCNHRCHCOSH+、硝基甲烷硝基甲烷COOHH2NCHRHNCNHRCHCOOHSEdman反应反应Edman反应反应4、氨基酸分析 分配层析法：分配层析法：分配系数 Kd=CACBCA：一种物质在A相（流动相）中的浓度 CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度 原理：主要根据被分析的样品（如aa混合物）在两种互不相溶的两相中分配系数的不同而达到分离的目的，纸层析 单向纸层析图Rf值 洗脱液样品填充物分部收集玻璃柱离子交换离子交换层析法层析法1.平衡阶段平
10、衡阶段:离子交换剂与反离子结合离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用涤，既可重复使用第三节：肽（第三节：肽（peptidepeptide）一一.肽的定义肽的定义 一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基脱去脱去一分子水而形成酰胺键，这个键称为一分子水而形成酰胺键，这个键称为肽键肽键（peptid
11、e peptide bondbond），），产生的化合物叫做产生的化合物叫做肽肽（peptidepeptide）。）。二个氨基酸形成的肽称作二肽二个氨基酸形成的肽称作二肽,三个氨基酸形成三个氨基酸形成的肽称作三肽；的肽称作三肽；余类推。余类推。寡肽寡肽（oligopeptideoligopeptide）：）：aa 10 aa 10 aa 10 个个肽平面肽平面Peptide bond plane 二二.肽的结构肽的结构 无分枝无分枝的长链的长链 由由“N-C-CN-C-C”单元的周期性连接，构成多肽链的单元的周期性连接，构成多肽链的主链主链；氨基酸残基的氨基酸残基的R R基团连接在主链的基团连
12、接在主链的CaCa上，形成多肽链上，形成多肽链的的侧链侧链。具有方向性。两个末端分别为具有方向性。两个末端分别为N N端端(氨基端氨基端)和和C C端端(羧羧基端基端)。肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基氨基酸残基(residue)。1、中文表示法：从肽链的从肽链的N N端开始，对氨基酸残基逐一命名，端开始，对氨基酸残基逐一命名，残基称氨酰残基称氨酰 三三.肽的表示法肽的表示法2、三字母表示法：aa1-aa2-aa3-aa4-aa1.aa2.aa3.aa4.3、单字母表示法：ABCD 四四.多肽的理化性质多肽的理化性质 其
13、等电点是在所有可解离的基团的净电荷为其等电点是在所有可解离的基团的净电荷为0 0时的状态。时的状态。肽链的一端含有一个游离的肽链的一端含有一个游离的-氨基，另一端含氨基，另一端含有一个游离的有一个游离的-羧基，加上部分氨基酸可解离的羧基，加上部分氨基酸可解离的R R基基团，因而与氨基酸一样具有团，因而与氨基酸一样具有两性解质两性解质的性质。的性质。（1）双缩脲反应 肽键的紫外吸收：肽键的紫外吸收：210230nm 双缩脲 碱性CuSO4溶液 紫色肽的化学性质与氨基酸相似，但肽有与氨基酸不同的特殊反应：双缩脲反应双缩脲反应 五五.重要肽重要肽1 1、谷胱甘肽、谷胱甘肽还原性谷胱甘肽（还原性谷胱甘
14、肽（reduced glutathionereduced glutathione）是存在于动植物细是存在于动植物细胞中的一种非常重要的三肽。它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨胞中的一种非常重要的三肽。它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。酸组成。CONHCHCONHCHCOOH2|CH2|SH|CHNH2|COOH|CH2|CH2 GluCysGly|S|S|GluCysGly氧化型谷胱甘肽（）GSSG还原型谷胱甘肽（）GSH谷氨酰半胱氨酰甘氨酸 2 2多肽抗菌素多肽抗菌素 3多肽激素 4神经肽甲硫氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyphe-Met 亮氨酸脑啡肽 Tyr-Gly-Gly-phe-Leu 功能
15、：镇痛 如脑啡肽(enkephalin)一、填空：一、填空：1、在组成蛋白质的二十种氨基酸中，是亚氨基酸，当它在a-螺旋行进中出现时，可使螺旋 。2、Lys的a-COOH、a-NH3 的pK值分别为2.18和8.95，该氨基酸的pI值为9.74，则R基团的pK值为 ，它是由 基团的解离引起的。3、Glu的pK1(a-COOH)=2.19、pK2(R基团)=4.25、pK3(a-NH3 )=9.67，该氨基酸的pI值为 。二、选择题二、选择题(注意：有些题不止一个正确答案注意：有些题不止一个正确答案)：1、下列什么氨基酸溶液不使偏振光发生旋转(A)Ala (B)Gly (C)Leu (D)Ser
16、 (E)Val2、下列AA中，蛋白质内所没有的是(A)高半胱氨酸 (B)半胱氨酸(C)鸟氨酸 (D)胍氨酸3、在下列肽链主干原子排列中，哪个符合肽键的结构(A)CNNC (B)CCCN (C)NCCC(D)CCNC (E)COCN4、Cys的pK1(-COOH)为1.96，pK2(-NH3+)为8.18，pK3(R基团)为10.28，在pH为6.12的缓冲液中，该氨基酸所带电荷为(A)正电荷 (B)负电荷 (C)无电荷(D)等电荷5、下列氨基酸中，在波长280 nm处紫外吸收值最高的氨基酸是(A)Lys (B)Cys (C)Thr (D)Trp重要的化合物和化学反应：DNFB，Sanger 反
17、应PITC，Edman 反应 第四节：蛋白质的分子结构第四节：蛋白质的分子结构一级结构 初级结构（共价结构）二级结构 高级结构（空间结构）三级结构四级结构 在二级结构和三级结构之间还有另一些层次，如超二级结构和结构域。一一.蛋白质的结构蛋白质的结构 蛋白质的（primary structure）是指蛋白质肽链中氨基酸的排列顺序。而蛋白质的化学结构包括肽链数目、端基组成、氨基酸序列和二硫键的位置，又称共价结构。蛋白质的一级结构是最基本的结构，它决定着蛋白质高级结构。以胰岛素为例，胰岛素是动物胰脏中胰岛细胞分泌的一种分子量较小的激素蛋白，它的主要功能是降低体内血糖含量。临床上用来治疗糖尿病。一.蛋
18、白质的一级结构 最先由Sanger于1953年完成测定胰岛素一级结构.蛋白质的二级结构指多肽链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象。天然蛋白质包括-螺旋、-折叠、-转角、无规则卷曲等二级结构。二.蛋白质的二级结构（一）二级结构的概念 蛋白质分子的多肽链按一定方式折叠、盘绕或组装成特有的空间结构，亦称高级结构。蛋白质的高级结构即蛋白质的构象问题。构型（configuration）是指不对称碳原子上相连的各原子或取代基团的空间排布（D-构型、L-构型）。构型的改变伴随着共价键的断裂和重新形成。构型和构象（一）二级结构的概念 构型和构象 X-射线衍射技术研究表明，肽键C-N键介于单键和双键之
19、间，具有部分双键性质，不能自由旋转，其中绝大多数都形成刚性的酰胺平面结构。蛋白质的构象（二）酰胺平面Peptide bond plane 因此，从理论上讲，蛋白质的构象（二）酰胺平面原因：1.-螺旋(-helix)2.-折叠(-pleated sheet)3.-转角(-turn)4.无规卷曲(nonregular coil)（三）二级结构单元的种类1）肽链中的酰胺平面绕C相继旋转一定角度形成-螺旋，并盘绕前进。每隔3.6个氨基酸残基，螺旋上升一圈；每圈间距0.54nm，即每个氨基酸残基沿螺旋中心轴上升0.15nm，旋转100。-螺旋结构的主要特点（P51）：1.-螺旋(-helix)2）螺旋体
20、中所有氨基酸残基侧链都伸向外侧；肽链上所有的肽键都参与氢键的形成，链中的全部C=O和N-H几乎都平行于螺旋轴,氢键几乎平行于中心轴;-螺旋结构的主要特点：1.-螺旋(-helix)3）绝大多数天然蛋白质都是右手螺旋。每个氨基酸残基的N-H都与前面第四个残基C=O形成氢键。-螺旋结构的主要特点：1.-螺旋(-helix)l R为Gly时，由于Ca上有2个氢，使Ca-C、Ca-N的转动的自由度很大，即刚性很小，所以使螺旋的稳定性大大降低。l-螺旋遇到Pro就会被中断而拐弯，因为脯氨酸是亚氨基酸。l带相同电荷的氨基酸残基连续出现在肽链上时，螺旋的稳定性降低。侧链在-螺旋结构中的作用：2、-折叠(-p
21、leated sheet)-折叠是由两条或多条伸展的多肽链靠氢键联结而成的锯齿状片状结构。侧链基团与C间的键几乎垂直于折叠平面，R基团交替地分布于片层平面两侧。-折叠分平行式和反平行式，后者更为稳定。N端在同一端。氨基酸之间沿轴相距0.325nmN端不在同一端。氨基酸之间沿轴相距0.35nm2、-折叠(-pleated sheet)维持-折叠结构稳定性的力 氢键由一条链上的羰基和另一条链上的氨基之间形成，即氢键是在链与链之间形成的。2、-折叠(-pleated sheet)2、-折叠(-pleated sheet)3、-转角（-turn）也称-回折，存在于球状蛋白中。其特点是肽链回折180，使
22、得氨基酸残基的C=O和与第四个残基的N-H形成氢键。-转角都在蛋白质分子的表面。3、-转角（-turn）4、无规则卷曲（non-regular coil）又称自由卷曲，是指没有一定规律的松散肽链结构。酶的功能部位常常处于这种构象区域。无规卷曲常出现在a-螺旋与a-螺旋、a-螺旋与-折叠、-折叠与-折叠之间。它是形成蛋白质三级结构所必需的。1.定义指蛋白质中相邻的二级结构单位(即单个-螺旋或-转角)组合在一起，形成有规则的在空间上能辩认的二级结构组合体。三.蛋白质的超二级结构2.类型2.类型3.结构域(domain)指多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧
23、密球状实体，称为结构域（domain）或功能域。3.结构域(domain)四.蛋白质的三级结构 三级结构指的是多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成球状分子结构。（一）三级结构的概念（二）球状蛋白的三级的结构特怔 具有三级结构的蛋白质分子含有多种二级结构单元。如具有三级结构的球状蛋白溶菌酶中含有螺旋、-折叠、-转角和无规卷曲四种二级结构（二）球状蛋白的三级的结构特怔大多数非极性侧链埋在分子内部，形成疏水核；而极性侧链在分子表面，形成亲水面。分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋白质的活性中心 蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次。（三）维持
24、三级结构的作用力二硫键 共价键 疏水作用非共价键（次级键）氢键 离子键范德华力（三）肌红蛋白肌红蛋白由条多肽链和一个血红素（heme）辅基构成，分子量为16700，含153个氨基酸残基。五.蛋白质的四级结构(一)四级结构的概念 四级结构：由两条或两条以上具有三级结构的多肽链聚合而成、有特定三维结构的蛋白质构象。每条多肽链又称为亚基。血红蛋白由四条多肽链形成，是一种寡聚蛋白质。这四条链主要通过非共价键相互作用缔合在一起。血红蛋白分子上有四个氧的结合部位，因为每条链上含有一个血红素辅基。例如，血红蛋白的四级结构(一)四级结构的概念(一)四级结构的概念(二)维持四级结构的作用力v 疏水作用v 氢键v
25、 离子键v 范德华力 第五节：蛋白质的结构与功第五节：蛋白质的结构与功能能（一）一级结构与功能的关系（一）一级结构与功能的关系 以细胞色素以细胞色素C C为例为例：细胞色素细胞色素C C广泛存在于真核广泛存在于真核生物细胞的线粒体中，是一种含有血红素辅基的单生物细胞的线粒体中，是一种含有血红素辅基的单链蛋白质。在生物氧化时，细胞色素链蛋白质。在生物氧化时，细胞色素C C在呼吸链的电在呼吸链的电子传递系统中起传递电子的作用，使血红素上铁原子传递系统中起传递电子的作用，使血红素上铁原子的价数发生变化。子的价数发生变化。1.同功能蛋白的种属特异性与一级结构的关系三、蛋白质结构与功能关系三、蛋白质结构
26、与功能关系 脊椎动物的细胞色素脊椎动物的细胞色素C C由由l04l04个氨基酸残基组成个氨基酸残基组成，分子量约，分子量约13,00013,000左右；昆虫有左右；昆虫有108108个氨基酸残基组个氨基酸残基组成；植物则有成；植物则有112112个氨基酸残基组成，大都沿个氨基酸残基组成，大都沿N N端延端延伸。对不同生物的细胞色素伸。对不同生物的细胞色素C C的一级结构分析表明，的一级结构分析表明，大约有大约有2828个氨基酸残基是各种生物共有的，表明这个氨基酸残基是各种生物共有的，表明这些氨基酸残基是规定细胞色素些氨基酸残基是规定细胞色素C C的生物功能所必需的的生物功能所必需的。表4-5
27、不同有机体中细胞色素C中的氨基酸顺序与人的差异生物名称生物名称 氨基酸差异数氨基酸差异数 生物名称生物名称 氨基酸差异数氨基酸差异数黑猩猩黑猩猩0鸡、火鸡鸡、火鸡13恒河猴恒河猴1响尾蛇响尾蛇14兔兔9乌龟乌龟15袋鼠袋鼠10金枪鱼金枪鱼21鲸鲸10狗鱼狗鱼23牛羊猪牛羊猪10蚕蛾蚕蛾31狗狗11小麦小麦43骡骡11面包酵母面包酵母45马马12红色面包霉红色面包霉48 三、蛋白质结构与功能关系三、蛋白质结构与功能关系（一）一级结构与功能的关系（一）一级结构与功能的关系2.一级结构变异与分子病 所谓分子病是指由于遗传基因突变导致蛋白分子中所谓分子病是指由于遗传基因突变导致蛋白分子中某些氨基酸残基
28、被更换所造成的一种遗传病。镰刀状细某些氨基酸残基被更换所造成的一种遗传病。镰刀状细胞贫血病（胞贫血病（sickle-cell anemia）是最早被认识的一种分是最早被认识的一种分子病，这种疾病在非洲的某些地区十分流行。病人的红子病，这种疾病在非洲的某些地区十分流行。病人的红细胞在氧气不足的情况下变形而呈镰刀状，故由此得名细胞在氧气不足的情况下变形而呈镰刀状，故由此得名 三、蛋白质结构与功能关系三、蛋白质结构与功能关系（一）一级结构与功能的关系（一）一级结构与功能的关系2.一级结构变异与分子病 通过对血红蛋白分子的一级结构研究表明，病人的通过对血红蛋白分子的一级结构研究表明，病人的血红蛋白（血
29、红蛋白（HbS）与正常人的血红蛋白（与正常人的血红蛋白（HbA）相比，相比，在在574个氨基酸残基中只有个氨基酸残基中只有2个氨基酸残基的差异。个氨基酸残基的差异。HbA和和 HbS的的-链是完全相同的，所不同只是链是完全相同的，所不同只是-链上从链上从N末末端开始的第端开始的第6位的氨基酸残基，在正常的位的氨基酸残基，在正常的HbA分子中是分子中是谷氨酸，而患者的谷氨酸，而患者的HbS分子中为缬氨酸所代替，分子中为缬氨酸所代替，2.一级结构变异与分子病 镰刀状细胞贫血病：镰刀状细胞贫血病：Hb-AHb-A（正常人）：正常人）：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-His-Leu-T
30、hr-Pro-GluGlu-Glu-Lys-Glu-LysHb-SHb-S（患者）：患者）：Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-His-Leu-Thr-Pro-ValVal-Glu-Lys-Glu-Lys-链链 1 2 3 4 5 6 7 8 2.一级结构变异与分子病 原因是什么？Glu 和和Val 分子的侧链在性质上有很大的不同。分子的侧链在性质上有很大的不同。Glu 侧侧链带负电荷，而链带负电荷，而Val侧链是一个非极性基团，所以使得侧链是一个非极性基团，所以使得HbS分子表面的负电荷减少，这种变化使患者的血红蛋白分子表面的负电荷减少，这种变化使患者的血红蛋白容易发生聚集并形成
31、杆状多聚体，这就是导致红细胞变形容易发生聚集并形成杆状多聚体，这就是导致红细胞变形的原因。的原因。在体内许多具有一定功能的蛋白质如酶蛋白、在体内许多具有一定功能的蛋白质如酶蛋白、激素类蛋白等常以无活性的前体形式产生和贮存。激素类蛋白等常以无活性的前体形式产生和贮存。在一定情况下，这些前体经特定蛋白酶水解，切除在一定情况下，这些前体经特定蛋白酶水解，切除部分肽段后，才转变成有活性的蛋白质。这一过程部分肽段后，才转变成有活性的蛋白质。这一过程叫做叫做蛋白质前体的激活3.一级结构与蛋白质前体的激活 例如：例如：有功能的胰岛素含有有功能的胰岛素含有51个氨基酸残基，个氨基酸残基，由由A、B两条链组成。
32、但在胰岛两条链组成。但在胰岛 细胞最初合成的细胞最初合成的是一个比胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称前是一个比胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称前胰岛素原，它是胰岛素原的前体，而胰岛素原是胰岛素原，它是胰岛素原的前体，而胰岛素原是有活性的胰岛素的前体。前胰岛素原比胰岛素原有活性的胰岛素的前体。前胰岛素原比胰岛素原在在N末端上多一段肽链，称信号肽（末端上多一段肽链，称信号肽（signal peptide），），含有含有20个左右氨基酸残基，其中很多是疏水个左右氨基酸残基，其中很多是疏水侧链残基。侧链残基。3.一级结构与蛋白质前体的激活（一）一级结构与功能的关系（一）一级结构与功能的关系 许多蛋白质，
33、如酶蛋白、激素蛋白等，它们在体许多蛋白质，如酶蛋白、激素蛋白等，它们在体内常以无活性的前体存在，内常以无活性的前体存在，在一定情况下经体内的蛋在一定情况下经体内的蛋白酶水解，切去部分肽段后，白酶水解，切去部分肽段后，才变成有活性的蛋白质才变成有活性的蛋白质。3.一级结构与蛋白质前体的激活 前体胰岛素（前体胰岛素（84 84 aaaa）A A链（链（2121aaaa）B B链（链（3030aaaa）C C链（链（3333aaaa）活性胰岛素活性胰岛素（二）空间结构与功能的关系（二）空间结构与功能的关系 牛胰核糖核酸酶牛胰核糖核酸酶A A（RNaseRNase）是由是由124124个氨个氨基酸残基
34、组成的单链蛋白质，含有基酸残基组成的单链蛋白质，含有4 4个二硫键，个二硫键，并通过其它次级键使多肽链得以折叠成一个具并通过其它次级键使多肽链得以折叠成一个具有三维构象的、有催化能力的活性蛋白质。三有三维构象的、有催化能力的活性蛋白质。三维结构的形成对维持酶的活力是必不可少的。维结构的形成对维持酶的活力是必不可少的。例一例一（二）空间结构与功能的关系（二）空间结构与功能的关系 当天然的当天然的RNase RNase 在在8 8molLmolL-1-1尿素存在下用尿素存在下用-巯基乙巯基乙醇处理后，分子内四个二硫键即被断裂，整个肽链呈醇处理后，分子内四个二硫键即被断裂，整个肽链呈伸展的无规则的线
35、形状态，同时酶活性完全丧失。但伸展的无规则的线形状态，同时酶活性完全丧失。但是当用透析方法将尿素和巯基乙醇除去后，是当用透析方法将尿素和巯基乙醇除去后，RNaseRNase活性活性又可完全恢复。研究表明，复性后的产物与天然又可完全恢复。研究表明，复性后的产物与天然RNaseRNase并无差别。所有正确配对的并无差别。所有正确配对的4 4个二硫键都获得重建。个二硫键都获得重建。（二）空间结构与功能的关系（二）空间结构与功能的关系 （二）空间结构与功能的关系（二）空间结构与功能的关系血红蛋白的别构效应血红蛋白的别构效应 例二例二（二）空间结构与功能的关系（二）空间结构与功能的关系肌红蛋白与血红蛋白
36、肌红蛋白与血红蛋白：两者三级结构相似：两者三级结构相似别构效应别构效应。PoPo2 2/133Pa/133Pa001.0.0.5.20406080100活动肌肉中活动肌肉中PoPo2 2肺泡中肺泡中PoPo2 2氧饱和度氧饱和度肌红蛋白血红蛋白第六节：蛋白质的重要性质(一一)胶体性质胶体性质 蛋白质的分子量蛋白质的分子量1 1万万-100-100万之间，其分子直万之间，其分子直径径1-1001-100nmnm之间，在胶体颗粒的范围。蛋白质的之间，在胶体颗粒的范围。蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如蛋白质
37、颗粒表面带有很多极性基团，如 NHNH3 3、COOCOO-、OHOH-、SHSH、CONHCONH2 2等和水有高度亲和性等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成外面形成层水膜。层水膜。所以蛋白质具有胶体性质，如布朗运动、光散所以蛋白质具有胶体性质，如布朗运动、光散射、电泳、不能透过半透膜及具有吸附能力等。利射、电泳、不能透过半透膜及具有吸附能力等。利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方法称棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方法称透
38、透析（析（dialysis）。）。蛋白质能形成较为稳定的亲水胶体的另一个原因蛋白质能形成较为稳定的亲水胶体的另一个原因：蛋白质颗粒在非等电点状态时带有相同电荷，使：蛋白质颗粒在非等电点状态时带有相同电荷，使得蛋白质颗粒之间相相互排斥，得蛋白质颗粒之间相相互排斥，(一一)胶体性质胶体性质(二二)两性解离及等电点两性解离及等电点 蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，即能和蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，即能和酸作用，也能和碱作用。蛋白质分子中可解离的基酸作用，也能和碱作用。蛋白质分子中可解离的基团除肽链末端的团除肽链末端的-氨基和氨基和-羧基外，主要还是多肽羧基外，主要还是多肽链中氨基酸残基上的侧
39、链基团如链中氨基酸残基上的侧链基团如-氨基、氨基、-羧基、羧基、-羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的pHpH条件下，这些基团能解离为带电基团从而使蛋白条件下，这些基团能解离为带电基团从而使蛋白质带电。质带电。蛋白质的等电点（蛋白质的等电点（pIpI）：）：当某蛋白质在一定的当某蛋白质在一定的pHpH的溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向的溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的阳极也不向阴极移动，此时溶液的pHpH值叫做该蛋白质值叫做该蛋白质的等电点。的等电点。蛋白质的带电性质与溶液的蛋白质的带电性质与
40、溶液的pHpH有关。利用蛋白质有关。利用蛋白质的两性解离可以通过电泳分离纯化蛋白质。的两性解离可以通过电泳分离纯化蛋白质。(二二)两性解离及等电点两性解离及等电点 蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构蛋白质受到某些理化因素的影响，其空间结构发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改发生改变，蛋白质的理化性质和生物学功能随之改变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种变或丧失，但未导致蛋白质一级结构的改变，这种现象叫变性作用（现象叫变性作用（denaturationdenaturation）。）。1.蛋白质变性的概念2.蛋白质变性的因素物理因素物理因素：加热、紫外线、超声波、高压等；：加
41、热、紫外线、超声波、高压等；化学因素化学因素：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢：强酸、强碱、脲、盐酸胍、去垢剂、重金属盐等；剂、重金属盐等；(三三)蛋白质的变性蛋白质的变性3.蛋白质变性后的表现(三三)蛋白质的变性蛋白质的变性4.蛋白的复性 蛋白质的变性作用若不过于剧烈，则是一种可蛋白质的变性作用若不过于剧烈，则是一种可逆过程。高级结构松散了的变性蛋白质通常在除去逆过程。高级结构松散了的变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠形成原来的构变性因素后，可缓慢地重新自发折叠形成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为为复性复性(re
42、naturation)renaturation)。大多蛋白质变性后，很难复性。大多蛋白质变性后，很难复性。(三三)蛋白质的变性蛋白质的变性(四四)蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去加入适当试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，蛋白质的胶体溶液就不稳定水化层，蛋白质的胶体溶液就不稳定,并将产生沉淀。并将产生沉淀。能使蛋白质沉淀的试剂有：能使蛋白质沉淀的试剂有：1.1.高浓度中性盐高浓度中性盐 （NHNH4 4)2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、NaClNaCl 这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析，这种加入盐使蛋白质沉淀析出的现象称
43、为盐析，用于蛋白质分离制备。用于蛋白质分离制备。2.2.有机溶剂有机溶剂 丙酮、乙醇丙酮、乙醇3.3.重金属盐重金属盐 Hg Hg2+2+、AgAg+、PbPb+（与蛋白质中带负电基团形与蛋白质中带负电基团形成不易溶解的盐成不易溶解的盐,或改变蛋白质的空间结构或改变蛋白质的空间结构）4.4.生物碱试剂和某些酸类物质生物碱试剂和某些酸类物质 苦味酸、单宁酸苦味酸、单宁酸 三氯乙酸、磺基水杨酸等三氯乙酸、磺基水杨酸等 （与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐）（与蛋白质中带正电荷的基团生成不溶性盐）5.5.加热变性沉淀加热变性沉淀(四四)蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀(五五)蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反
44、应1.1.双缩脲反应双缩脲反应 双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。双双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多物，此反应称双缩脲反应。蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反。通常可用此反应来定性鉴定蛋白质，也可根据反应产物的颜色深浅在应产物的颜色深浅在540540nmnm处进行蛋白质的定量测定处进行蛋白质的定量测定。2.2.酚试剂（酚试剂（Folin
45、-酚试剂）反应酚试剂）反应 蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸蛋白质分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将中的酚基能将Folin-酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸酚试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的混合物）。这一反应常用来定量测定蛋白质含量。这一反应常用来定量测定蛋白质含量。可根据反可根据反应产物的颜色深浅在应产物的颜色深浅在540540nmnm处进行蛋白质的定量处进行蛋白质的定量测定测定.(五五)蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应3.3.茚三酮反应茚三酮反应 由于蛋白质多肽链两端有游离的由于蛋白质多肽链两端有游离的-NH2和和-C
46、OOH，所以蛋白质也可以和茚三酮发生反应。所以蛋白质也可以和茚三酮发生反应。4.考马斯亮兰考马斯亮兰 与蛋白质反应形成蓝色透明物质，在与蛋白质反应形成蓝色透明物质，在595nm下进行比色。下进行比色。(五五)蛋白质的颜色反应蛋白质的颜色反应(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定1.1.蛋白质分离、纯化的过程和一般原则蛋白质分离、纯化的过程和一般原则 （1 1）前处理（）前处理（Pretreatment）-细胞破碎，蛋白细胞破碎，蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来。（2 2）粗分级（）粗分级（Rough fractio
47、nation）当蛋白质混当蛋白质混合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法合物的提取液获得后，选用一套适当分离纯化方法，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。，使目的蛋白与大量的杂蛋白分离开。（3 3）细分级（）细分级（Fine fractionation）是将样品进是将样品进一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较一步提纯的过程。样品经粗分级以后，一般体积较小，杂蛋白已经大部分被除去。小，杂蛋白已经大部分被除去。（4 4）结晶（）结晶（Crystal）由于结晶中从未发现过变性由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也
48、是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质，也是断定制品处于天然状态的有力指标。蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。2.2.蛋白质分离纯化的一般方法蛋白质分离纯化的一般方法 （1）根据蛋白质分子大小不同的分离方法）根据蛋白质分子大小不同的分离方法a.透析（透析（dialysis）和超滤和超滤 （ultrafiltration）(六六)蛋白质的蛋白质的的分离、纯化与鉴定的分离、纯化与鉴定b.密度梯度（区带）离心密度梯度（区带）离心 c.凝胶过滤（凝胶过滤（gel filtration）葡聚糖凝胶过滤（2）根据蛋白质溶解度的差异进行分离的方法根据蛋白质溶解度的差异进
49、行分离的方法 a.等电点沉淀（等电点沉淀（isoelectric precipitation）b.蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析 c.有机溶剂分级分离有机溶剂分级分离（3）根据蛋白质电荷不同的分离方法）根据蛋白质电荷不同的分离方法 a.电泳电泳-在电场中，带电颗粒向着与其带相反电荷的在电场中，带电颗粒向着与其带相反电荷的电极移动，这种现象称电泳（电极移动，这种现象称电泳（electrophoresis）。）。n影响迁移率的因素：电位梯度影响迁移率的因素：电位梯度 电流密度电流密度 导电性导电性 环境环境pH（分子电荷）分子电荷）离子强度离子强度 分子的大小、形状分子的大小、形状 n根据电
50、泳的原理和影响因素可以设计不同的电根据电泳的原理和影响因素可以设计不同的电泳方法以达到预期的目的泳方法以达到预期的目的聚丙烯酰胺的结构和特点聚丙烯酰胺的结构和特点 单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺单体：丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺 增速剂：增速剂：TEMEDTEMED（N,N,NN,N,N,N,N-四甲基乙二胺）、四甲基乙二胺）、3-3-二甲胺丙腈二甲胺丙腈 引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素引发剂：过硫酸铵、过硫酸钾、核黄素 特性：机械性能、弹性、透明度、粘着度、孔径特性：机械性能、弹性、透明度、粘着度、孔径大小大小n电泳原理：电泳原理：1.1.最主要的特性是蛋白质的带电行为，产生最主要的特性是蛋
