1、12主要讲授内容：主要讲授内容：一一 概述概述二二 基因治疗分类基因治疗分类六六 展望展望34 至于传染病，是由外源病原体如至于传染病，是由外源病原体如病毒、细菌及其它微生物引起的疾病，病毒、细菌及其它微生物引起的疾病，而这些病原体是通过它们的遗传物质而这些病原体是通过它们的遗传物质及其表达产物作用于人体而致病。同及其表达产物作用于人体而致病。同时，这些病原体的遗传物质还可以在时，这些病原体的遗传物质还可以在人体内不断复制。人体内不断复制。5 所以，人的疾病的发生，都是人细所以，人的疾病的发生，都是人细胞本身的基因改变或由外源病原体的基胞本身的基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的
2、最后结果。因及产物与人体相互作用的最后结果。为此，长期以来科学家们想象人类能否为此，长期以来科学家们想象人类能否最终依靠遗传物质，无论是人本身的或最终依靠遗传物质，无论是人本身的或外源的，来治疗疾病，包括纠正人自身外源的，来治疗疾病，包括纠正人自身基因的结构或功能上的错乱，阻止病变基因的结构或功能上的错乱，阻止病变的进展，杀灭病变的细胞或抑制外源病的进展，杀灭病变的细胞或抑制外源病原体遗传物质的复制，从而达到治疗的原体遗传物质的复制，从而达到治疗的目的。目的。6定义定义 把基因转移到患者体内，使其发把基因转移到患者体内，使其发挥作用，以达到治疗疾病目的的技挥作用，以达到治疗疾病目的的技术称为基
3、因治疗术称为基因治疗(Gene Therapy)(Gene Therapy)。7 基因治疗自基因治疗自AndersonAnderson于于19901990年进行年进行了第一例应用腺苷脱氨酶基因（了第一例应用腺苷脱氨酶基因（ADAADA），），经反转录病毒导入人体自身经反转录病毒导入人体自身T T淋巴细胞，淋巴细胞，经扩增后输回患儿体内，获得了成功。经扩增后输回患儿体内，获得了成功。患儿患儿5 5年后体内年后体内10%10%造血细胞造血细胞ADAADA基因呈阳基因呈阳性，除了还需应用部分剂量的性，除了还需应用部分剂量的ADAADA蛋白外，蛋白外，其他体征正常。这一成功标记着基因治其他体征正常。这
4、一成功标记着基因治疗的时代已经开始。疗的时代已经开始。8二二 基因治疗分类：基因治疗分类：1.1.目的基因导入体内的方式目的基因导入体内的方式 体外途径体外途径(ex vivoex vivo)间接法，间接法，回输法回输法 体内途径体内途径(in vivoin vivo)直接法直接法2.2.靶细胞靶细胞 体细胞：疾病相关细胞，免疫系体细胞：疾病相关细胞，免疫系统细胞，干细胞统细胞，干细胞 生殖细胞：严格禁止生殖细胞：严格禁止9 间接法是指先将合适的靶细胞间接法是指先将合适的靶细胞从体内取出，在体外扩增，并将外从体内取出，在体外扩增，并将外源基因导入细胞内使其高效表达，源基因导入细胞内使其高效表达
5、，然后将这种基因修饰过的靶细胞回然后将这种基因修饰过的靶细胞回输病人体内，使外源基因在体内表输病人体内，使外源基因在体内表达，从而达到治疗目的。达，从而达到治疗目的。10111213142.2.代偿性基因治疗代偿性基因治疗 通过对有代偿功能的基因通过对有代偿功能的基因的正调控，开启其关闭状态来代的正调控，开启其关闭状态来代偿功能异常的基因。例如，以某偿功能异常的基因。例如，以某些作用剂提高珠蛋白基因的表达些作用剂提高珠蛋白基因的表达以治疗以治疗 地中海贫血。地中海贫血。153.3.基因补偿性治疗基因补偿性治疗 基因补偿性治疗指将目的基因导基因补偿性治疗指将目的基因导入病变细胞或其它细胞，不去除
6、异常入病变细胞或其它细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得以加强。目前基能或使原有的功能得以加强。目前基因治疗多采用此种策略。因治疗多采用此种策略。164.4.基因失活性治疗基因失活性治疗 基因失活性早期一般指反义核基因失活性早期一般指反义核酸技术。它将特定的反义核酸，包酸技术。它将特定的反义核酸，包括反义括反义RNARNA、反义、反义DNADNA和核酶导入细和核酶导入细胞，在翻译和转录水平阻止某些基胞，在翻译和转录水平阻止某些基因的异常表达，以达到治疗疾病的因的异常表达
7、，以达到治疗疾病的目的。目的。RNAiRNAi、肽核酸、基因敲除。、肽核酸、基因敲除。171819208.8.化疗保护性基因治疗化疗保护性基因治疗 向正常细胞内导入单相或多相细向正常细胞内导入单相或多相细胞毒性药物的抗性基因，使得正常细胞毒性药物的抗性基因，使得正常细胞耐受化疗药物的能力大大提高。如：胞耐受化疗药物的能力大大提高。如：导入多药耐药基因（导入多药耐药基因（MDRMDR），可使正），可使正常细胞获得广泛的化疗药物耐受性。常细胞获得广泛的化疗药物耐受性。2122232425262728（三）基因载体和基因转移系统（三）基因载体和基因转移系统 目前使用的基因载体有病毒载体目前使用的基因
8、载体有病毒载体和非病毒载体。和非病毒载体。1.1.非病毒介导的基因转移非病毒介导的基因转移 物理方法物理方法 显微注射法显微注射法电穿孔法电穿孔法直接注射法和微粒子轰击法直接注射法和微粒子轰击法 29 化学方法化学方法 DNA-DNA-磷酸钙共沉淀法磷酸钙共沉淀法 多聚阳离子多聚阳离子-DNA-DNA复合物法复合物法 脂质体脂质体-DNA-DNA复合物法复合物法 融合法：通过原生质球相互融合法：通过原生质球相互融合的方法，将目的基因导入靶融合的方法，将目的基因导入靶细胞。细胞。3031321.1.逆转录病毒（逆转录病毒（retrovirus,RVretrovirus,RV）RVRV是目前基因转
9、移中应用最为是目前基因转移中应用最为广泛的一类病毒。是一类广泛的一类病毒。是一类RNARNA病毒。病毒。由于缺失了自身包装所必需的蛋白由于缺失了自身包装所必需的蛋白（结构蛋白（结构蛋白gapgap，多聚酶，多聚酶polpol，包膜，包膜糖蛋白糖蛋白envenv）基因，因此其复制需）基因，因此其复制需依赖辅助细胞系。逆转录病毒转染依赖辅助细胞系。逆转录病毒转染效率高，理论上可高达效率高，理论上可高达100%100%。33转染后，前病毒基因组（经反转转染后，前病毒基因组（经反转录后形成的录后形成的DNADNA）可与靶细胞基）可与靶细胞基因组随机组合，因而能稳定的表因组随机组合，因而能稳定的表达外源
10、基因。达外源基因。缺点：缺点：1 1）只能转染处于增殖状态）只能转染处于增殖状态的细胞；的细胞；2 2）携带的外源基因不）携带的外源基因不能太大（能太大（8-10Kb8-10Kb）；）；343 3）逆转录病毒的感染依赖于靶细）逆转录病毒的感染依赖于靶细胞表面适宜受体存在，限制了它的胞表面适宜受体存在，限制了它的应用，尤其是体内基因治疗的应用；应用，尤其是体内基因治疗的应用；4 4）理论上讲，从包装细胞释放出）理论上讲，从包装细胞释放出的复制缺陷的逆转录病毒只有一次的复制缺陷的逆转录病毒只有一次性感染靶细胞，但在某种情况下也性感染靶细胞，但在某种情况下也会造成野生型病毒的爆发。会造成野生型病毒的
11、爆发。355 5）由于病毒基因组是随机整合到靶）由于病毒基因组是随机整合到靶细胞基因组的，因而具有致细胞癌细胞基因组的，因而具有致细胞癌变的可能；变的可能；6 6）逆转录病毒不能耐）逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩等处理过程，否则会受纯化和浓缩等处理过程，否则会使其感染活性大大下降。使其感染活性大大下降。36逆转录病毒载体的构建逆转录病毒载体的构建 外源基因插入病毒基因组有两外源基因插入病毒基因组有两种方式，一种是直接将外源基因插种方式，一种是直接将外源基因插入到病毒基因中；另一种是以外源入到病毒基因中；另一种是以外源基因取代病毒的必需结构基因。基因取代病毒的必需结构基因。37 在复制缺陷型病毒中
12、，外源在复制缺陷型病毒中，外源目的基因的插入使病毒基因灭火目的基因的插入使病毒基因灭火或以目的基因取代病毒的必需基或以目的基因取代病毒的必需基因，使产生的重组前病毒不能表因，使产生的重组前病毒不能表达病毒结构蛋白，因此转录产生达病毒结构蛋白，因此转录产生的的RNARNA不能被包装产生子代重组病不能被包装产生子代重组病毒，毒，38必须借助辅助病毒的共感染或通过包必须借助辅助病毒的共感染或通过包装细胞提供病毒复制所必需的反式作装细胞提供病毒复制所必需的反式作用蛋白，然后才能包装产生子代重组用蛋白，然后才能包装产生子代重组病毒。这样获得的子代重组病毒仅仅病毒。这样获得的子代重组病毒仅仅具有一次感染性
13、，避免了产生继发扩具有一次感染性，避免了产生继发扩散感染的危险。散感染的危险。39 包装细胞（包装细胞（pakaging cellpakaging cell）包装细胞是通过基因工程技术对细胞包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因进行修饰，使其产生病毒结构基因gaggag、polpol、envenv所编码的蛋白，为逆转录病毒载所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组整病毒的基因组RNARNA，一句话，包装细胞，一句话，包装细
14、胞本身不能产生任何形式的病毒颗粒。本身不能产生任何形式的病毒颗粒。40逆转录病毒载体介导基因转移的一逆转录病毒载体介导基因转移的一般过程：般过程：1 1）目的基因克隆到逆转录病毒载）目的基因克隆到逆转录病毒载体上；体上；2 2）带有目的基因的逆转）带有目的基因的逆转录病毒载体通过物理方法如磷酸录病毒载体通过物理方法如磷酸钙介导或电穿孔法导入已选定的钙介导或电穿孔法导入已选定的包装细胞；包装细胞；41 3 3）根据载体所提供的筛选标记基因筛）根据载体所提供的筛选标记基因筛选转化细胞；选转化细胞；4 4）选择具有高滴度重组病）选择具有高滴度重组病毒的转化细胞，分离重组病毒；毒的转化细胞，分离重组病
15、毒；5 5）重组）重组病毒感染靶细胞，采用两种方式，一种病毒感染靶细胞，采用两种方式，一种是以无细胞带病毒上清和靶细胞一起温是以无细胞带病毒上清和靶细胞一起温育；另一种以产病毒的包装细胞经射线育；另一种以产病毒的包装细胞经射线照射致死后作为饲养细胞，被靶细胞在照射致死后作为饲养细胞，被靶细胞在其上面培养达到目的。其上面培养达到目的。42 6 6）如采用体外感染，则将感染的）如采用体外感染，则将感染的细胞回输体内，分析治疗基因的细胞回输体内，分析治疗基因的表达及治疗效果；表达及治疗效果；7 7）病毒感染的）病毒感染的质量控制，在基因转移过程中要质量控制，在基因转移过程中要进行严格的质量控制。进行
16、严格的质量控制。43基因转移的方法和途径基因转移的方法和途径 逆转录病毒载体系统进行基因转移逆转录病毒载体系统进行基因转移的方法主要有的方法主要有in vivoin vivo和和ex vivoex vivo两种。两种。基因治疗的早期多采用离体方案。离基因治疗的早期多采用离体方案。离体方案基因转移效率高，具有明确的体方案基因转移效率高，具有明确的基因转移，但必须进行宿主细胞的体基因转移，但必须进行宿主细胞的体外分离培养，而大多数人体组织细胞，外分离培养，而大多数人体组织细胞，原代培养比较困难。原代培养比较困难。44 近年来，更多采用体内方案。重组近年来，更多采用体内方案。重组逆转录病毒直接注射的
17、途径主要有：逆转录病毒直接注射的途径主要有：1 1）采用静脉注射等途径，将重组病）采用静脉注射等途径，将重组病毒直接注射到机体内，通过重组病毒毒直接注射到机体内，通过重组病毒的感染作用实现基因转移；的感染作用实现基因转移；2 2）直接）直接将产生重组逆转录病毒载体的包装细将产生重组逆转录病毒载体的包装细胞注射到组织或肿瘤中，由包装细胞胞注射到组织或肿瘤中，由包装细胞释放再感染靶细胞；释放再感染靶细胞；45 3 3）直接将表达载体，可以是非）直接将表达载体，可以是非病毒性表达质粒，注射到人体内，病毒性表达质粒，注射到人体内，如将如将HIV-1HIV-1病毒载体注射到肌肉病毒载体注射到肌肉内，使其
18、表达相应的内，使其表达相应的envenv基因蛋基因蛋白，引起相应的细胞免疫。白，引起相应的细胞免疫。46472.2.腺病毒（腺病毒（adenovirus,AVadenovirus,AV）AVAV是一些大的（约是一些大的（约38kb38kb）双链）双链DNADNA。目前作为基因治疗中所用的。目前作为基因治疗中所用的AVAV载体通常是一些复制缺陷病毒，其载体通常是一些复制缺陷病毒，其基因缺失位于基因组的基因缺失位于基因组的E1A-E1BE1A-E1B或或E3E3区。区。48 AVAV既能感染增殖期细胞，也能既能感染增殖期细胞，也能感染静止期细胞。这类病毒比较稳感染静止期细胞。这类病毒比较稳定，且浓
19、缩和纯化对其感染活性影定，且浓缩和纯化对其感染活性影响不大。其不足之处为：响不大。其不足之处为：1 1）病毒）病毒基因组一般不与靶细胞基因组整合，基因组一般不与靶细胞基因组整合，因而其表达外源基因是暂时的和不因而其表达外源基因是暂时的和不稳定的；稳定的；49 2 2）在）在AVAV的生活周期中，有许多不同的生活周期中，有许多不同生物学活性的蛋白暂时表达，其中生物学活性的蛋白暂时表达，其中也包括一些与细胞恶性转化相关的也包括一些与细胞恶性转化相关的蛋白；蛋白；3 3）感染细胞内大量病毒蛋白）感染细胞内大量病毒蛋白的表达，可导致机体对受染细胞的的表达，可导致机体对受染细胞的强烈免疫应答。这一毒副作
20、用在体强烈免疫应答。这一毒副作用在体内基因治疗是必须引起足够的重视。内基因治疗是必须引起足够的重视。50 目前有报道利用目前有报道利用CreloxpCreloxp重组重组构建构建“无内脏（无内脏（gutlessgutless）”AVAV载体载体可望解决可望解决AVAV的免疫原性问题；的免疫原性问题；4 4）AVAV几乎可以感染所有细胞，缺乏特异几乎可以感染所有细胞，缺乏特异性。或许可以通过使用组织特异性性。或许可以通过使用组织特异性启动子来克服这一问题。启动子来克服这一问题。513.3.腺相关病毒（腺相关病毒（adeno-associated adeno-associated virus,AA
21、Vvirus,AAV）:AAV:AAV属于微小病毒家族成属于微小病毒家族成员，是一类小的单链员，是一类小的单链DNADNA病毒（基因组病毒（基因组约约4.7kb4.7kb），非常稳定。本身无致病性，），非常稳定。本身无致病性，需辅助病毒（常为需辅助病毒（常为AVAV）存在时才能复）存在时才能复制。制。AAVAAV可感染人的细胞，并能整合至可感染人的细胞，并能整合至非分裂相细胞。非分裂相细胞。52 大部分大部分AAVAAV基因组可去除，从而可基因组可去除，从而可使外源基因得以大量补足。使外源基因得以大量补足。AAVAAV可以可以整合进入宿主细胞基因组，但不如整合进入宿主细胞基因组，但不如RVRV
22、的整合效率高。有趣的是，在感的整合效率高。有趣的是，在感染细胞中，野生型染细胞中，野生型AAVAAV基因组可高效基因组可高效定点整合于人类第定点整合于人类第1919号染色体长臂号染色体长臂的特定位置上，这种整合可导致染的特定位置上，这种整合可导致染色体基因重排，色体基因重排，53 而这种重排与慢性而这种重排与慢性B B淋巴细胞白血淋巴细胞白血病相关。然而携带治疗性基因的病相关。然而携带治疗性基因的AAVAAV载体似乎不象它的野生型亲本，载体似乎不象它的野生型亲本，没有定点整合于没有定点整合于1919号染色体的相同号染色体的相同特征。因此从安全的角度来考虑，特征。因此从安全的角度来考虑，这种这种
23、AAVAAV的定点整合有多大优越性，的定点整合有多大优越性，尚值得进一步探讨。尚值得进一步探讨。544.4.单纯疱疹病毒（单纯疱疹病毒（herpes simplex herpes simplex virus,HSVvirus,HSV）:HSV:HSV是一些双链是一些双链DNADNA病病毒（基因组约毒（基因组约150kb150kb），具有嗜神经），具有嗜神经细胞的特性，能在神经细胞内形成细胞的特性，能在神经细胞内形成“终生隐性感染终生隐性感染”。将外源基因导。将外源基因导入并使之长久存在于中枢神经系统入并使之长久存在于中枢神经系统是该类病毒载体的一大特点。是该类病毒载体的一大特点。55 如果能够
24、选择性地调节目的基因的表如果能够选择性地调节目的基因的表达，而不诱导病毒基因的表达，这将对达，而不诱导病毒基因的表达，这将对中枢神经系统疾病的基因治疗大有帮助。中枢神经系统疾病的基因治疗大有帮助。HSVHSV的缺点：的缺点：1 1）仅能感染分裂细胞，从）仅能感染分裂细胞，从而使之在成人脑组织中的应用受到限制。而使之在成人脑组织中的应用受到限制。2 2）这类病毒（包括无复制能力的病毒）这类病毒（包括无复制能力的病毒）对靶细胞具有毒害作用，需慎重。对靶细胞具有毒害作用，需慎重。565758四心血管病的基因治疗四心血管病的基因治疗 近二十年来，由于心血管病发近二十年来，由于心血管病发病的分子机制和基
25、因转移技术的发病的分子机制和基因转移技术的发展，使心脑血管病的基因治疗亦取展，使心脑血管病的基因治疗亦取得了十分可喜的成就。得了十分可喜的成就。19931993年年WilsonWilson应用应用LDLRLDLR基因治疗家族性高基因治疗家族性高胆固醇血症。胆固醇血症。59 19961996年年IsnerIsner应用血管内皮生长应用血管内皮生长因子基因治疗梗塞性血管病，都已因子基因治疗梗塞性血管病，都已在临床应用，并获得了成功。尽管在临床应用，并获得了成功。尽管在人类已实施的近在人类已实施的近400400个临床基因治个临床基因治疗方案中，心血管病只占疗方案中，心血管病只占5%5%左右，左右，但
26、其成功率却是最高的。但其成功率却是最高的。60 心脑血管病的基因治疗有三个最心脑血管病的基因治疗有三个最基本的条件：基本的条件：1 1治疗基因的选择，这治疗基因的选择，这取决于心脑血管病发病的分子生物取决于心脑血管病发病的分子生物学机制的研究；学机制的研究；2 2）体内基因运载系）体内基因运载系统，这是目前心脑血管病基因治疗统，这是目前心脑血管病基因治疗主要的限速因素；主要的限速因素；3 3）治疗基因在体）治疗基因在体内的表达与调控，这是目前心脑血内的表达与调控，这是目前心脑血管病基因治疗研究中最薄弱的环节。管病基因治疗研究中最薄弱的环节。61心血管病基因治疗的一些特点心血管病基因治疗的一些特
27、点 心脑血管病主要包括单基因遗传心脑血管病主要包括单基因遗传病和多基因的心血管病两大类。前病和多基因的心血管病两大类。前者发病率较低，主要有家族性高胆者发病率较低，主要有家族性高胆固醇血症，遗传性扩张性心肌病，固醇血症，遗传性扩张性心肌病，肥厚性心肌病，长肥厚性心肌病，长Q-TQ-T综合征，遗传综合征，遗传性心肌营养不良等。这些疾病多因性心肌营养不良等。这些疾病多因基因突变和缺陷所引起，基因突变和缺陷所引起，62 其致病基因大部分已经克隆出来。其致病基因大部分已经克隆出来。基因治疗所选择。外源基因需在体基因治疗所选择。外源基因需在体内长期，稳定表达才能有效。后者，内长期，稳定表达才能有效。后者
28、，发病率很高，主要有高血压，动脉发病率很高，主要有高血压，动脉粥样硬化，心肌肥厚，心功能不全，粥样硬化，心肌肥厚，心功能不全，再狭窄等。这些疾病多是环境因素再狭窄等。这些疾病多是环境因素和遗传因素相互作用所引起。和遗传因素相互作用所引起。63 心血管病与肿瘤，传染病等不心血管病与肿瘤，传染病等不同，其发病过程较长，在发病的过同，其发病过程较长，在发病的过程中存在一系列致病和抗病因素漫程中存在一系列致病和抗病因素漫长的相互拮抗和调整的过程，是一长的相互拮抗和调整的过程，是一系列网络调节失衡的结果。对于绝系列网络调节失衡的结果。对于绝大多数的心脑血管病基因治疗的目大多数的心脑血管病基因治疗的目的是
29、促进自身的保护机制，阻断疾的是促进自身的保护机制，阻断疾病发展过程中的恶性循环。病发展过程中的恶性循环。64 因此，对于绝大多数常见的心脑因此，对于绝大多数常见的心脑血管病的基因转移，不一定需要整血管病的基因转移，不一定需要整合到染色体中，长期而终生表达，合到染色体中，长期而终生表达，常常瞬间，有限的表达，阻断疾病常常瞬间，有限的表达，阻断疾病的恶性循环即可达到治疗的目的。的恶性循环即可达到治疗的目的。65心血管系统的基因转移心血管系统的基因转移 心血管系统的基因转移可分为间心血管系统的基因转移可分为间接细胞转移和直接基因转移两大类。接细胞转移和直接基因转移两大类。1.1.基因缝线：基因缝线：
30、基因缝线是一种裸基因缝线是一种裸DNADNA直接注射至直接注射至体内的转移方法现在证明用裸体内的转移方法现在证明用裸DNADNA进进行肌肉、血管和心肌直接注射，都可行肌肉、血管和心肌直接注射，都可以实现局部组织的基因转移，并表达以实现局部组织的基因转移，并表达出相应的蛋白质。出相应的蛋白质。66 基因缝线是将裸基因缝线是将裸DNADNA通过多聚赖氨通过多聚赖氨酸或鱼精蛋白直接黏附在手术缝合酸或鱼精蛋白直接黏附在手术缝合线上，进行肌肉、血管和心肌缝合。线上，进行肌肉、血管和心肌缝合。这种方法可以避免直接注射裸这种方法可以避免直接注射裸DNADNA后后的流失，使其长期滞留在局部组织，的流失，使其长
31、期滞留在局部组织，发挥持续转基因作用。发挥持续转基因作用。672.基因球囊和支架基因球囊和支架 基因球囊和支架是将外源基因基因球囊和支架是将外源基因通过多聚赖氨酸或鱼精蛋白，固定通过多聚赖氨酸或鱼精蛋白，固定在动脉导管球囊或支架的表面，通在动脉导管球囊或支架的表面，通过动脉导管送入血管局部，固定球过动脉导管送入血管局部，固定球囊和支架，令球囊加压和充气，使囊和支架，令球囊加压和充气，使其紧贴在血管表面或将支架植入血其紧贴在血管表面或将支架植入血管壁内。管壁内。683.3.血管外膜的基因转移血管外膜的基因转移 应用多聚凝胶（生物胶）与外应用多聚凝胶（生物胶）与外源基因混合，形成基因胶或基因微源基
32、因混合，形成基因胶或基因微球，注射在血管周围或组织内，亦球，注射在血管周围或组织内，亦可延长基因转移时间，提高转基因可延长基因转移时间，提高转基因效率。效率。694.4.阳离子脂质体阳离子脂质体 脂质体是一种人工的脂质双层脂质体是一种人工的脂质双层结构，可以通过与细胞膜的融合或结构，可以通过与细胞膜的融合或受体介导的细胞吞饮，将外源受体介导的细胞吞饮，将外源DNADNA送送入细胞内。入细胞内。705.5.受体介导的基因转移受体介导的基因转移 在心血管细胞表面存在许多特异性的在心血管细胞表面存在许多特异性的受体，当配体受体，当配体DNADNA复合物与受体结合后，复合物与受体结合后，可以通过受体的
33、内趋化和胞饮作用，将可以通过受体的内趋化和胞饮作用，将外源基因特异性转移到靶细胞内。外源基因特异性转移到靶细胞内。716.病毒脂质体病毒脂质体 病毒脂质体是将灭活的病毒或病毒脂质体是将灭活的病毒或病毒的包被蛋白的片段镶嵌在阳离病毒的包被蛋白的片段镶嵌在阳离子脂质体的双层脂质层中所构建的子脂质体的双层脂质层中所构建的一种基因载体。这种载体不含病毒一种基因载体。这种载体不含病毒的基因，仅仅利用病毒中负责感染的基因，仅仅利用病毒中负责感染细胞的蛋白片段。细胞的蛋白片段。727.7.病毒介导的基因转移病毒介导的基因转移 逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒。逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒。(一一)遗传性心血
34、管病的基因治疗遗传性心血管病的基因治疗家族性高胆固醇血症的基因治疗家族性高胆固醇血症的基因治疗 19931993年美国费城医学中心年美国费城医学中心GrossmanGrossman应用逆转录病毒载体携带应用逆转录病毒载体携带LDLRLDLR基因，基因，治疗治疗5 5例家族性高胆固醇血症的病人，例家族性高胆固醇血症的病人，取得成功。取得成功。73 他们首先从病人体内取出他们首先从病人体内取出2/32/3的的肝脏，分离出肝细胞进行体外培养，肝脏，分离出肝细胞进行体外培养，再应用重组再应用重组LDLRLDLR基因的逆转录病毒，基因的逆转录病毒，转染培养的肝细胞，经筛选和大量转染培养的肝细胞，经筛选和
35、大量培养，最后通过门静脉回输到肝脏。培养，最后通过门静脉回输到肝脏。证明其外源性野生型证明其外源性野生型LDLRLDLR可以在肝可以在肝脏长期表达，血浆脏长期表达，血浆LDLLDL的水平明显降的水平明显降低，可以明显延长患者存活期。低，可以明显延长患者存活期。74 这种方法技术复杂，费用高，可这种方法技术复杂，费用高，可引起肝炎等免疫反应，难以普及和引起肝炎等免疫反应，难以普及和推广。推广。19961996年他们应用腺病毒介导年他们应用腺病毒介导极低密度脂蛋白受体基因（极低密度脂蛋白受体基因（VLDLRVLDLR）的，直接注入肝脏，证明亦可以治的，直接注入肝脏，证明亦可以治疗实验性高胆固醇血症
36、，但表达时疗实验性高胆固醇血症，但表达时间较反转录病毒载体短，但操作简间较反转录病毒载体短，但操作简便。便。75 北医心血管研究所最近用北医心血管研究所最近用AVAV脂质体脂质体携带携带LDLRLDLR基因，直接从门静脉注入，证基因，直接从门静脉注入，证明明LDLRLDLR基因可以在肝细胞中高度表达，基因可以在肝细胞中高度表达，并可降低血中并可降低血中LDLLDL和甘油三酯的水平，和甘油三酯的水平，且无明显毒副作用，但持续时间短，一且无明显毒副作用，但持续时间短，一次注射作用只可持续次注射作用只可持续2-32-3周。周。76（二）复杂性心血管病的基因治疗（二）复杂性心血管病的基因治疗 除了单基
37、因遗传性心脑血管病以外，除了单基因遗传性心脑血管病以外，绝大多数的心脑血管病都是多基因复杂的绝大多数的心脑血管病都是多基因复杂的心脑血管病。主要包括高血压，高脂血症心脑血管病。主要包括高血压，高脂血症和动脉粥样硬化，血栓症，心功能不全，和动脉粥样硬化，血栓症，心功能不全，再狭窄，梗塞性血管病等等。再狭窄，梗塞性血管病等等。77 人们对这些疾病虽然进行了大量，长人们对这些疾病虽然进行了大量，长期的研究，但至今还未找到这些疾病发期的研究，但至今还未找到这些疾病发病的主要致病基因。绝大多数心血管疾病的主要致病基因。绝大多数心血管疾病不一定都是基因结构的缺陷病不一定都是基因结构的缺陷突变、突变、缺失、
38、重排和移位，而主要表现为基因缺失、重排和移位，而主要表现为基因转录表达和调控的失衡。因此，利用这转录表达和调控的失衡。因此，利用这些候选和调控基因，补充和促进某些基些候选和调控基因，补充和促进某些基因的表达，阻遏某些基因的功能，亦可因的表达，阻遏某些基因的功能，亦可达到防治疾病的目的。达到防治疾病的目的。781 1 梗塞性血管病的基因治疗梗塞性血管病的基因治疗 梗塞性血管病包括外周梗塞性血梗塞性血管病包括外周梗塞性血管病、冠状动脉梗塞、脑梗塞和再狭管病、冠状动脉梗塞、脑梗塞和再狭窄等。血管内血栓形成，血管内膜增窄等。血管内血栓形成，血管内膜增生、高脂血症、动脉粥样硬化、糖尿生、高脂血症、动脉粥
39、样硬化、糖尿病等都可以引起血管的阻塞，引起器病等都可以引起血管的阻塞，引起器官、组织的缺血、损伤和猝死。官、组织的缺血、损伤和猝死。79 目前主要针对不同原因和梗塞目前主要针对不同原因和梗塞的程度采用容栓和介入疗法。严的程度采用容栓和介入疗法。严重的梗塞必须进行血管外科手术重的梗塞必须进行血管外科手术-搭桥术（搭桥术（bypassbypass）。但这种方）。但这种方法，不仅手术复杂，费用昂贵，法，不仅手术复杂，费用昂贵，难以推广，而且有一定的危险。难以推广，而且有一定的危险。80 19951995年年IsnerIsner最先应用最先应用VEGFVEGF基因治疗实验基因治疗实验性外周梗塞性血管病
40、，证明给兔肌肉内注射性外周梗塞性血管病，证明给兔肌肉内注射裸裸VEGFVEGF质粒，可以在肌肉局部表达，并可促质粒，可以在肌肉局部表达，并可促进血管新生和侧枝循环的建立。进血管新生和侧枝循环的建立。19971997年在美年在美国经国经FDAFDA批准应用批准应用VEGFVEGF基因在临床治疗外周基因在临床治疗外周梗塞性血管病，并取得了明显效果：梗塞性血管病，并取得了明显效果：6 6例严例严重下肢缺血的患者，肌肉注射重下肢缺血的患者，肌肉注射2-4mgVEGF2-4mgVEGF质质粒粒DNADNA，每四周重复一次，共二次，在，每四周重复一次，共二次，在6 6个病个病人人7 7条患肢均观察到明显的
41、效果。条患肢均观察到明显的效果。81除除VEGFVEGF基因外，应用和基因外，应用和血管生成素基因可以治疗梗塞性血管生成素基因可以治疗梗塞性血管病。近年等将裸血管生血管病。近年等将裸血管生成素的质粒，直接注射入家兔肌成素的质粒，直接注射入家兔肌肉，证明它可促进新生血管的生成和肉，证明它可促进新生血管的生成和侧枝循环的建立，治疗实验性梗塞性侧枝循环的建立，治疗实验性梗塞性血管病。血管病。822.高脂血症和动脉粥样硬化的基因治疗高脂血症和动脉粥样硬化的基因治疗高脂血症是动脉粥样硬化最主要的致高脂血症是动脉粥样硬化最主要的致病因素，它是由于脂代谢障碍所引起。包病因素，它是由于脂代谢障碍所引起。包括一
42、系列载脂蛋白、脂蛋白脂肪酶、括一系列载脂蛋白、脂蛋白脂肪酶、和等。这些、和等。这些蛋白质基因的结构、表达和功能异常可引蛋白质基因的结构、表达和功能异常可引起血浆致动脉粥样硬化的水平升高起血浆致动脉粥样硬化的水平升高和抗动脉粥样硬化的水平降低和抗动脉粥样硬化的水平降低。831.LDL1.LDL受体和清道夫受体的基因受体和清道夫受体的基因 家族性高胆固醇血症主要是因为家族性高胆固醇血症主要是因为LDLRLDLR基因突变和缺失所引起的，因此，应用基因突变和缺失所引起的，因此，应用ex vivo ex vivo 的方法，在肝脏内输入的方法，在肝脏内输入LDLRLDLR基基因修饰的肝细胞，可以有效治疗家
43、族性因修饰的肝细胞，可以有效治疗家族性高胆固醇血症。应用腺病毒介导高胆固醇血症。应用腺病毒介导VLDLRVLDLR基基因亦同样有效。因亦同样有效。84 1）清道夫受体（清道夫受体（SR-BSR-B）在肝脏）在肝脏HDLHDL的清的清除中起重要作用。剔除除中起重要作用。剔除SR-B1SR-B1基因的小鼠基因的小鼠血浆血浆HDLHDL水平可升高两倍，相反在肝脏应水平可升高两倍，相反在肝脏应用腺病毒介导用腺病毒介导SR-B1SR-B1基因，可使血浆基因，可使血浆HDLHDL完完全消失。有人提议应用反义全消失。有人提议应用反义SR-B1SR-B1，升高，升高血浆血浆HDLHDL水平，治疗动脉粥样硬化。
44、水平，治疗动脉粥样硬化。85 2）APOA-1APOA-1基因基因 载脂蛋白载脂蛋白A1A1是是HDLHDL的的主要载脂蛋白，它参与胆固醇的逆向转主要载脂蛋白，它参与胆固醇的逆向转移，促使细胞内胆固醇的清除。最近，移，促使细胞内胆固醇的清除。最近，FanFan等构建含有等构建含有APOA-1APOA-1基因的逆转录病基因的逆转录病毒载体进行肌肉内基因转移，证明它可毒载体进行肌肉内基因转移，证明它可以在成肌母细胞和肌细胞中表达，升高以在成肌母细胞和肌细胞中表达，升高血浆中血浆中HDLHDL水平，若同时转移水平，若同时转移LCATLCAT基因，基因，效果更明显。效果更明显。863 3）OBOB基因
45、基因 肥胖和糖尿病亦是高脂血症和动脉肥胖和糖尿病亦是高脂血症和动脉粥样硬化的一个危险因素。粥样硬化的一个危险因素。OBOB基因缺陷和基因缺陷和表达不足是引起肥胖的一个重要原因。用表达不足是引起肥胖的一个重要原因。用缺陷型腺病毒介导缺陷型腺病毒介导LeptinLeptin基因，给食饵性基因，给食饵性肥胖小鼠和遗传肥胖小鼠注射可使血浆肥胖小鼠和遗传肥胖小鼠注射可使血浆LeptinLeptin水平增加，进食减少，体重降低，水平增加，进食减少，体重降低，体脂丢失，血清胰岛素和糖能量恢复正常。体脂丢失，血清胰岛素和糖能量恢复正常。87 肌肉内注射腺病毒介导的肌肉内注射腺病毒介导的LeptinLeptin
46、基基因，也有同样作用。应用因，也有同样作用。应用LeptinLeptin基基因可以治疗肥胖症和高脂血症。目因可以治疗肥胖症和高脂血症。目前美国前美国FDAFDA已批准进行临床试验。已批准进行临床试验。88 动脉粥样硬化的发生，不仅与脂代动脉粥样硬化的发生，不仅与脂代谢有关，内皮细胞损伤，血管平滑肌细谢有关，内皮细胞损伤，血管平滑肌细胞的增殖和迁移，血栓形成，局部过氧胞的增殖和迁移，血栓形成，局部过氧化和炎症反应亦是动脉粥样硬化发病的化和炎症反应亦是动脉粥样硬化发病的重要因素，因此抗平滑肌细胞增殖，抗重要因素，因此抗平滑肌细胞增殖，抗血栓形成，抗炎症反应，抗氧化的基因血栓形成，抗炎症反应，抗氧化
47、的基因亦可作为动脉粥样硬化的靶基因。亦可作为动脉粥样硬化的靶基因。89六六 基因治疗的展望基因治疗的展望 基因治疗要取得突破，必须解决几个问题：基因治疗要取得突破，必须解决几个问题：基因导入系统；基因表达的可控性及更多更好基因导入系统；基因表达的可控性及更多更好的治疗基因。的治疗基因。1 1 高效的、靶向性基因导入系统高效的、靶向性基因导入系统 基因治疗的关键中的首要问题是能将治疗基基因治疗的关键中的首要问题是能将治疗基因输送到并进入特定靶细胞，从而要能在该细因输送到并进入特定靶细胞，从而要能在该细胞中得到高效表达。胞中得到高效表达。902.2.外源基因表达的可控性外源基因表达的可控性 最理想
48、的可控性是模拟人体内基因本身最理想的可控性是模拟人体内基因本身的调控模式。这是今后长期追求的目标。是的调控模式。这是今后长期追求的目标。是需要全基因或包括上下游的调控区及内含子。需要全基因或包括上下游的调控区及内含子。从近期来说，可以期待实现的是在从近期来说，可以期待实现的是在cDNAcDNA水平水平加上部分内含子及调控元件，应用诱导的形加上部分内含子及调控元件，应用诱导的形式达到一定程度的可控性，这样部分基因，式达到一定程度的可控性，这样部分基因，导入体内后，可通过诱导来控制表达。导入体内后，可通过诱导来控制表达。913.3.治疗基因过少治疗基因过少 目前在已用于临床实验的治疗基因目前在已用
49、于临床实验的治疗基因仅集中于少数基因。尤其是，对大多数多仅集中于少数基因。尤其是，对大多数多基因疾病，如肿瘤、高血压、糖尿病、冠基因疾病，如肿瘤、高血压、糖尿病、冠心病、神经退行性疾病的致病基因还有待心病、神经退行性疾病的致病基因还有待阐明。这将有赖于人基因组计划，尤其是阐明。这将有赖于人基因组计划，尤其是功能基因组学的发展。这不仅限于这些致功能基因组学的发展。这不仅限于这些致病基因的发现，同时也包括已知和目前尚病基因的发现，同时也包括已知和目前尚未知功能基因的表达调控序列的确定，以未知功能基因的表达调控序列的确定，以及其相互作用规律的阐明。及其相互作用规律的阐明。924.4.安全性问题安全性
50、问题5.5.外源基因不能在体内长期稳定表达的问题外源基因不能在体内长期稳定表达的问题6.6.基因治疗的复杂性问题基因治疗的复杂性问题7.7.基因治疗中靶细胞生物学特性改变的问题基因治疗中靶细胞生物学特性改变的问题8.8.论理学方面的问题。论理学方面的问题。93 基因治疗的历史虽短，但所取得基因治疗的历史虽短，但所取得的成绩巨大。业已显示出令人鼓舞的的成绩巨大。业已显示出令人鼓舞的应用前景。随着分子生物学技术的不应用前景。随着分子生物学技术的不断完善和发展，人类后基因组计划的断完善和发展，人类后基因组计划的不断实施，对疾病复杂的分子机制有不断实施，对疾病复杂的分子机制有了清楚的认识，基因治疗将成
