1、实验二实验二 人血清蛋白质含量测定人血清蛋白质含量测定 蛋白质测定的主要方法蛋白质测定的主要方法 根据蛋白质元素组成根据蛋白质元素组成凯氏定氮法；凯氏定氮法； 根据蛋白质组成特点建立的比色法根据蛋白质组成特点建立的比色法双缩脲法双缩脲法， lowry改良法，考马斯亮蓝染色法，改良法，考马斯亮蓝染色法，BCA法；法； 根据蛋白质的吸收特性建立的紫外分光光度法；根据蛋白质的吸收特性建立的紫外分光光度法； 蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收 1. 蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸。蛋白质分子中含有共轭双键的芳香族氨基酸。 它们具有吸收紫外光的性质。它们具有吸收紫外光的性质。 2. 其最高吸收峰在
2、其最高吸收峰在280nm波长处，且在此波长波长处，且在此波长 内吸收峰的光密度值与其浓度成正比。内吸收峰的光密度值与其浓度成正比。 Tyr Trp 双缩脲法测定蛋白质双缩脲法测定蛋白质 实验原理实验原理双缩脲反应双缩脲反应 180 C 双缩脲在碱性条件下可与铜结合成紫红色复合物双缩脲在碱性条件下可与铜结合成紫红色复合物 Cu2+ OH- 蛋白质具有双缩脲结构，在碱性条件下也能与铜结合成紫红蛋白质具有双缩脲结构，在碱性条件下也能与铜结合成紫红 色复合物在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正色复合物在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的浓度成正 比比1 1- -10mg10mg，因此通过比色法
3、可以测定蛋白质含量。，因此通过比色法可以测定蛋白质含量。 标准曲线的作用和绘制标准曲线的作用和绘制 根据LambertLambert- -BeerBeer定律，定律， A A与与C C成正比成正比 配制一系列标准液配制一系列标准液 C C1 1、C C2 2、C C3 3， 在在 max max下，测相应的 下，测相应的A A1 1、 A A2 2、A A3 3。 Ax Cx 判断测定误差，确定方法的可靠性。判断测定误差，确定方法的可靠性。 大批样品分析时，可省略多次计算，直接获得大批样品分析时，可省略多次计算，直接获得 样品测定结果。样品测定结果。 绘制曲线注意点：绘制曲线注意点： 1.横轴
4、与纵轴比例横轴与纵轴比例 2.各坐标点应与原点连成一条直线各坐标点应与原点连成一条直线 3.直线通过尽可能多的点，不在直线上的点均直线通过尽可能多的点，不在直线上的点均 量分布在直线两边量分布在直线两边 实验步骤实验步骤 1 2 3 4 5 6 7 标 准 管 测定管 空白管 试剂 蛋白质标准液（蛋白质标准液（ml） 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蛋白质测定液（蛋白质测定液（ml） 1.0 0.9%NaCL （ml） 0.8 0.6 0.4 0.2 1.0 双缩尿试剂双缩尿试剂 （ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 37 C水温育水温育20分钟，分钟，540nm比色，测定吸光值比色，测定吸光值 双缩尿法测定蛋白质浓度 1 2 3 4 5 6 7 A 实验数据实验数据 实验结果的计算实验结果的计算 1.1.绘制标准曲线，从标准曲线上查出待测绘制标准曲线，从标准曲线上查出待测 血清样品的蛋白质浓度，并求出人血清样血清样品的蛋白质浓度，并求出人血清样 品的蛋白质浓度。品的蛋白质浓度。 2.2.从标准管中选择一管与测定管从标准管中选择一管与测定管A A值接近者，值接近者， 根据根据LambertLambert- -beerbeer定律，求出人血清样品定律，求出人血清样品 的蛋白质浓度。的蛋白质浓度。
