1、质粒DNA的转化 及鉴定 原理 感受态细胞感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：受体细胞经过一些特殊方法（如： CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后等化学试剂法）的处理后 ，细胞膜的通透性发生变化，成为能容，细胞膜的通透性发生变化，成为能容 许多有外源许多有外源DNADNA的载体分子通过的感受的载体分子通过的感受 态细胞态细胞(competent cell) 。 转化（转化（transformation）： 是将异源是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体分子引入一细胞株系，使受体 细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因细胞获得新的遗传性状的一种手
2、段，是基因 工程等研究领域的基本实验技术。工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实分子通过复制表达，才能实 现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗 传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限 制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性 内切酶和甲基化酶的突变株。内切酶和甲基化酶的突变株。 转化的方法：转化的方法： 化学的方法化学的方法( (热击法热击法) )；使用化学试剂；使用化学试剂 （如（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过）制备的感受态细胞，通过
3、 热击处理将载体热击处理将载体DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞 ； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制 备的感受态细胞，通过高压脉冲的作备的感受态细胞，通过高压脉冲的作 用将载体用将载体DNADNA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。 克隆的筛选：克隆的筛选： 主要用不同抗生素基因筛选。常用主要用不同抗生素基因筛选。常用 的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉 素、氯霉素、四环素、链霉素等；素、氯霉素、四环素、链霉素等； 将经过转化后的细胞在将经过转化后的细胞在选择性培养基选择性培养基 中培养，才能较容易地中培养，才能较容易地筛选
4、出转化体筛选出转化体， 即带有异源即带有异源DNA分子的受体细胞。否分子的受体细胞。否 则，如果将转化后的菌液涂在则，如果将转化后的菌液涂在无选择无选择 性抗生素的培养基性抗生素的培养基平板上，会出现平板上，会出现成成 千上万的细菌菌落千上万的细菌菌落，将难以确认哪一，将难以确认哪一 个克隆含有转化的质粒。虽然只有那个克隆含有转化的质粒。虽然只有那 些含有被转化质粒的细菌才能在含有些含有被转化质粒的细菌才能在含有 抗生素的平板上生长和繁殖，但对于抗生素的平板上生长和繁殖，但对于 连接混合物而言，此时并不能确定哪连接混合物而言，此时并不能确定哪 个克隆含有插入片段。个克隆含有插入片段。 重组质粒
5、克隆的鉴定重组质粒克隆的鉴定 鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有 -互补、小规模制备质粒互补、小规模制备质粒DNA进行酶切进行酶切 分析、插入失活、分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的以及杂交筛选的 方法。最常用的方法是小规模制备质粒方法。最常用的方法是小规模制备质粒 DNA进行酶切分析，对于带有进行酶切分析，对于带有LacZ基因基因 的载体还可以结合的载体还可以结合 -互补现象互补现象来筛选。来筛选。 pBR322pBR322质粒质粒 4363 bp4363 bp 含一个复制点含一个复制点 含一个抗氨卞青霉素基因含一个抗氨卞青霉素基因 ( (ampampR
6、R) ) 一个抗四环素基因一个抗四环素基因 ( (tettetR R) ) ampampR R和和tettetR R抗性基因内各有抗性基因内各有 一些限制酶的酶切位点，供一些限制酶的酶切位点，供 外源基因插入外源基因插入 当外源基因插入抗药基当外源基因插入抗药基 因内后，抗药基因失活。因内后，抗药基因失活。 AmpAmpR RAmpAmp敏感敏感( (AmpAmpS S ) )、 TetTetR RTetTet敏感敏感( (TetTetS S).). 载体质粒和转化受体菌株 pBR322质粒： LacZ基因的调控序列基因的调控序列 和和头头146个氨基酸个氨基酸的编码信息的编码信息 Top10
7、菌株：带有-半乳糖苷酶C端部分 序列的编码信息 初步筛选：抗药性标志选择 载体质粒DNA pBR322上带有Ampr 基因 而外源片段上不带该基因,故转化受体菌 后只有带有质粒DNA pBR322的转化子 才能在含有Amp的LB平板上存活下来; 而只带有自身环化的外源片段的转化子 则不能存活。此为初步的抗性筛选 。 -互补现象：互补现象： 载体质粒载体质粒DNA（pBR322）带有一个）带有一个 LacZ基因的调控序列基因的调控序列和和头头146个氨基酸个氨基酸 的编码信息，编码的编码信息，编码 -互补肽，该肽段能互补肽，该肽段能 与宿主编码的与宿主编码的缺陷型缺陷型 -半乳糖苷酶实现半乳糖苷
8、酶实现 基因内互补（基因内互补（ -互补互补）。）。当这种载体转当这种载体转 入可编码入可编码 半乳糖苷酶半乳糖苷酶C端部分序列的端部分序列的 宿主细胞（宿主细胞（Top10菌株）中时，在菌株）中时，在异丙异丙 基基- -D硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，的诱导下， 宿主可同时合成这两种肽段，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们虽然它们 各自都没有酶活性，但它们可以融为一各自都没有酶活性，但它们可以融为一 体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这 种现象为种现象为 -互补现象。互补现象。 蓝蓝- -白筛选白筛选 利用蓝色化合物的形成作为利用蓝色化合物的
9、形成作为指示剂指示剂，筛选带重组质粒的细菌筛选带重组质粒的细菌。 载体：载体：编码编码- -半乳糖半乳糖 宿主：宿主： 编码编码- -半乳糖半乳糖 苷酶苷酶N端序列端序列 苷酶苷酶C C端序列端序列 - -互补互补 细菌表达：细菌表达： - -半乳糖苷酶活性半乳糖苷酶活性 5 5- -溴溴- -4 4- -氯氯- -3 3- -吲哚吲哚（ X-gal） 形成形成蓝色菌落蓝色菌落 当在质粒中当在质粒中插入外源插入外源DNADNA- -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的N N端基因失活端基因失活 不能与宿主不能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端端进行进行- -互补互补产生产生白色菌落白色菌落。 （IPTG
10、 存在下存在下） 蓝白筛选示意图蓝白筛选示意图 pBR322 4kb pBR322 4kb 试剂与器材试剂与器材 试剂试剂 LB培养基；培养基；0.1mol/LCaCl2；甘油；甘油；LB 抗生素平板（抗生素平板（均为灭菌的均为灭菌的） 器材器材 恒温培养箱恒温培养箱 实验步骤实验步骤 细菌感受态的制备：细菌感受态的制备： 1. Top10菌株培养过夜，以菌株培养过夜，以1:100比例接种培养比例接种培养3 小时，冰浴小时，冰浴30min，分装于，分装于EP管，管，2500rpm 4离心离心4min。 2. 弃上清，沉淀重悬弃上清，沉淀重悬于于1ml预冷预冷0.1mol/L CaCl2 ， 冰
11、浴冰浴15min，2500rpm 4 离心离心4min。 3. 弃上清，沉淀弃上清，沉淀轻悬轻悬于于0.2ml预冷预冷0.1mol/L CaCl2 (此时细菌易破碎此时细菌易破碎)，置冰浴。，置冰浴。 转化：转化： 1. 加入质粒加入质粒DNA 20 l，冰浴，冰浴30min。 2. 42热冲击热冲击2min ，迅速冰浴，迅速冰浴2min。 3. 加加1ml Amp LB培养基， 培养基，37振荡振荡培养培养1小时小时 （250rpm/min）。 4. 取取Amp+LB平板，用平板，用40 l -gal(20mg/ml)、4 l IPTG(200mg/ml)均匀涂于平板上。均匀涂于平板上。 5. 取取20-100 l培养产物涂培养产物涂Amp+平板。平板。 6. 倒置平板，倒置平板，37培养培养过过夜，观察蓝白菌斑夜，观察蓝白菌斑。 Blue White Screening
