1、军团菌检验军团菌检验九江市九江市CDC 金盛楠金盛楠2011.09军团菌的发现军团菌的发现 1976年年7月美国费城斯特拉福宾馆召开月美国费城斯特拉福宾馆召开58届退伍军人大届退伍军人大会（会（American Legion Convention）,会后短期内，发生不明原会后短期内，发生不明原因以呼吸道为主的疾病爆发，数百人中共发病因以呼吸道为主的疾病爆发，数百人中共发病182人，死亡人，死亡29人。共发病人。共发病221人，死亡人，死亡34人。人。这种细菌很可能通过空气传播，当时未查明传染源，这种细菌很可能通过空气传播，当时未查明传染源，按流行病学分析，可能是聚会宾馆。按流行病学分析，可能是
2、聚会宾馆。人与人之间的传播证据不明确。人与人之间的传播证据不明确。许多宾馆工作人员具有免疫力。许多宾馆工作人员具有免疫力。证明是一种细菌性肺炎，进行豚鼠接种，分离到一株证明是一种细菌性肺炎，进行豚鼠接种，分离到一株革兰阴性杆菌，该细菌可以接种于鸡胚的卵黄囊。革兰阴性杆菌，该细菌可以接种于鸡胚的卵黄囊。Gram-stained micrograph of Legionella pneumophila bacteria from a victim of the 1976 Legionnaires disease outbreak in Philadelphia.证明分离到的革证明分离到的革兰阴性菌
3、为军团兰阴性菌为军团病的病原体。病的病原体。（科赫原则）（科赫原则）军团菌的命名军团菌的命名 1979年在第一次国际军团病会议上正式命名为嗜肺军团菌年在第一次国际军团病会议上正式命名为嗜肺军团菌（legionella pneumonphila,Lp）。此次为新的呼吸道细菌性传染）。此次为新的呼吸道细菌性传染病暴发，会议命名为军团病（病暴发，会议命名为军团病（Legionnaires Disease）。）。Scientific classificationDomain:BacteriaPhylum:ProteobacteriaClass:GammaproteobacteriaOrder:Legi
4、onellalesFamily:LegionellaceaeGenus:LegionellaSpecies病原学病原学形态染色：革兰阴性杆菌，中等大小。形态染色：革兰阴性杆菌，中等大小。菌体呈多形性，因培养条件而异。有时呈现菌体呈多形性，因培养条件而异。有时呈现820m或更长丝状相互缠绕。或更长丝状相互缠绕。无荚膜，无芽孢，有端生鞭毛能运动。无荚膜，无芽孢，有端生鞭毛能运动。细胞壁内含有大量的侧链脂肪酸可做军团菌分型的依据，占菌体总脂肪酸细胞壁内含有大量的侧链脂肪酸可做军团菌分型的依据，占菌体总脂肪酸量的量的68%以上。以上。Transmission electron micrograph o
5、f Legionella 军团菌在自然界广泛存在，主要由表层水体、泥巴、有一军团菌在自然界广泛存在，主要由表层水体、泥巴、有一定温度的湖泊溪流中分离到，主要自然界真核细胞胞内寄生。定温度的湖泊溪流中分离到，主要自然界真核细胞胞内寄生。目前报道了超过目前报道了超过50个种与个种与70个血清型。个血清型。80%水环境样品水环境样品PCR能检测到军团菌特异性核酸，能检测到军团菌特异性核酸，40%水水环境样品能分离到军团菌。环境样品能分离到军团菌。影响水环境中军团菌的主要因素影响水环境中军团菌的主要因素1、细菌的存在、细菌的存在2、较高的水温、较高的水温3、周围环境中阿米巴原虫、周围环境中阿米巴原虫4
6、、Fe2+The pattern of Legionella grows in Amoeba军团菌生长特性军团菌生长特性耐酸耐酸 PH3.0PH3.0存活数小时。存活数小时。耐热耐热嗜铁性嗜铁性 培养基需加入焦磷酸铁培养基需加入焦磷酸铁对对NA+NA+敏感敏感 NA+NA+抑制生长抑制生长根据根据WHOWHO官方网站的数据，温度对军团菌生长的影响如下：官方网站的数据，温度对军团菌生长的影响如下：Above 70 C(158 F)-几乎立即死亡几乎立即死亡 At 60 C(140 F)-90%在在2 2分钟内死亡分钟内死亡(Decimal reduction time(D)=2)At 50 C(
7、122 F)-90%在在 80-124 80-124 分钟内死亡分钟内死亡,根据菌株不同而有所根据菌株不同而有所区别区别(Decimal reduction time(D)=80-124)48 to 50 C(118 to 122 F)能够生存，但不能繁殖能够生存，但不能繁殖 32 to 42 C(90 to 108 F)理想生长温度理想生长温度 25 to 45 C(77 to 113 F)生长温度范围生长温度范围 Below 20 C(68 F)能生存，处于休眠状态，即使在冰冻条件下能生存，处于休眠状态，即使在冰冻条件下 军团菌增殖的条件和场所军团菌增殖的条件和场所能产生气溶胶的场所：能产
8、生气溶胶的场所：淋浴花洒，龙头淋浴花洒，龙头温泉，水浴池温泉，水浴池蒸气浴、桑拿蒸气浴、桑拿空调系统冷却塔、冷凝器空调系统冷却塔、冷凝器室内观赏性喷泉室内观赏性喷泉热水和冷水塔或储水罐热水和冷水塔或储水罐 2045热水热水水流静止或缓慢的管道中水流静止或缓慢的管道中黏土（管道不清洁，淋浴花洒堵黏土（管道不清洁，淋浴花洒堵 塞，塞，龙头污垢）龙头污垢）含有天然橡胶或天然纤维的洗衣机含有天然橡胶或天然纤维的洗衣机水加热器水加热器宾馆饭店军团菌感染潜在的危险因素宾馆饭店军团菌感染潜在的危险因素军团菌卫生学指标军团菌卫生学指标美国：美国：冷却塔水军团菌浓度应冷却塔水军团菌浓度应100cfu/mL；冷热
9、水系统水应冷热水系统水应10cfu/mL；加湿器水应加湿器水应1cfu/mL澳大利亚、新加坡澳大利亚、新加坡:冷却塔水军团菌浓度应冷却塔水军团菌浓度应10cfu/mL；其他不能检出其他不能检出我国我国:集中空调通风系统冷却水和冷凝水中不得检出嗜肺军团菌。（？）集中空调通风系统冷却水和冷凝水中不得检出嗜肺军团菌。（？）广泛分布的多灶性纤维素化脓性炎症，常伴有纤维蛋白性胸膜炎和广泛分布的多灶性纤维素化脓性炎症，常伴有纤维蛋白性胸膜炎和少量粘液性渗出胸膜炎。少量粘液性渗出胸膜炎。受感染的人或动物由呼吸道分泌物、痰、血液与胸水中分离到军团受感染的人或动物由呼吸道分泌物、痰、血液与胸水中分离到军团菌，均
10、可查到军团菌抗体。菌，均可查到军团菌抗体。未进行有效抗生素治疗，病死率很高。未进行有效抗生素治疗，病死率很高。治疗治疗 公认首选药物为红霉素，疗效可靠公认首选药物为红霉素，疗效可靠 阿奇霉素、克拉霉素可能有效，不确定。阿奇霉素、克拉霉素可能有效，不确定。利福平有效，但易产生耐药菌株，只能作为辅助药物利福平有效，但易产生耐药菌株，只能作为辅助药物 氨基甙类、青霉素、头孢类抗生素对本病无效。氨基甙类、青霉素、头孢类抗生素对本病无效。军团菌肺炎的主要病理特征军团菌肺炎的主要病理特征Two clinical syndromes:Legionnaires disease and Pontiac feve
11、r.军团菌感染的两种临床症状：军团菌肺炎与庞蒂亚克热 Legionnaires diseasePontiac fever Clinical features Pneumonia:cough,fever,chest pain Flu-like illness(fever,chills,malaise)without pneumonia Radiographic pneumonia Yes No Incubation period 2-14 days after exposure 24-48 hours after exposure Etiologic agent Legionella speci
12、es Legionella species Attack rate*90%Isolation of organism Possible Virtually never Outcome Hospitalization commonCase-fatality rate:5-30%*Hospitalization uncommonCase-fatality rate:0%*Percent of persons who,when exposed to the source of an outbreak,become ill.*Percent of persons who die from Legion
13、naires disease or Pontiac fever.流行病学特点流行病学特点1 1、传染源、传染源 兼性厌氧保内寄生菌，广泛存在于自然界水源与人工管道水源中，兼性厌氧保内寄生菌，广泛存在于自然界水源与人工管道水源中，空调系统冷却塔、循环蓄水池等是军团菌的常住地。主要寄生在原核空调系统冷却塔、循环蓄水池等是军团菌的常住地。主要寄生在原核生物细胞体内，如阿米巴。原核生物不但提供各种军团菌所需要的营生物细胞体内，如阿米巴。原核生物不但提供各种军团菌所需要的营养成分，在环境不利的情况下也为军团菌提供了一个庇护的场所，也养成分，在环境不利的情况下也为军团菌提供了一个庇护的场所，也是军团菌转移
14、、迁徙与感染高等动物与人的载体。原虫被军团菌裂解是军团菌转移、迁徙与感染高等动物与人的载体。原虫被军团菌裂解后大量的菌体被释放到水体、环境中，通过宾馆一些能产生气溶胶的后大量的菌体被释放到水体、环境中，通过宾馆一些能产生气溶胶的器件而被人体吸入感染。器件而被人体吸入感染。2 2、传播途径、传播途径 呼吸道的吸入是最可能的传播途径，含有军团菌的气溶胶颗粒通过空气由呼吸道的吸入是最可能的传播途径，含有军团菌的气溶胶颗粒通过空气由人直接吸入肺泡而致病。经口或消化道感染军团病的可能性很小。已证实在开人直接吸入肺泡而致病。经口或消化道感染军团病的可能性很小。已证实在开挖土壤、沟渠时可能有军团病的暴发流行
15、。挖土壤、沟渠时可能有军团病的暴发流行。人由肺泡感染军团菌后，似乎军团菌的传染就停止了。至今未发现人与人之间人由肺泡感染军团菌后，似乎军团菌的传染就停止了。至今未发现人与人之间的传播。（？）的传播。（？）3 3、易感人群、易感人群 人对军团菌普遍易感，以中老年人多见，男性多于女性。基础免疫力人对军团菌普遍易感，以中老年人多见，男性多于女性。基础免疫力较低，长期吸烟者、长期从事宾馆、医院工作者、长期旅行者、糖尿病、较低，长期吸烟者、长期从事宾馆、医院工作者、长期旅行者、糖尿病、脏器衰竭或因病服用免疫抑制剂、类固醇激素等患者得病风险显著升高。脏器衰竭或因病服用免疫抑制剂、类固醇激素等患者得病风险显
16、著升高。在免疫缺陷人群中易导致严重感染至死亡。在免疫缺陷人群中易导致严重感染至死亡。HIVHIV感染合并军团菌感染而死感染合并军团菌感染而死亡的病例屡见报道。亡的病例屡见报道。4 4、季节性、季节性 全年均有发生。夏秋季节是军团病的高发季节。可能由于夏秋季温度全年均有发生。夏秋季节是军团病的高发季节。可能由于夏秋季温度较高，有利于军团菌生长繁殖，另外夏秋季节中央空调使用频率也高。较高，有利于军团菌生长繁殖，另外夏秋季节中央空调使用频率也高。军团菌胞内致病机制军团菌胞内致病机制manipulate host cell vesicular-trafficking pathways and esta
17、blish a membrane-bound replication vacuole,making it model for intracellular or,more specifically,intravacuolar pathogens.Regular phagocytosis vs.Legionella intracellular parasitism培养特性培养特性专性需氧，专性需氧，2.55%CO2能促进生长。能促进生长。最适生长温度最适生长温度35 36，最适，最适PH6.9。营养要求特殊，在普通培养基上不生长，生长需要营养要求特殊，在普通培养基上不生长，生长需要L-半胱氨酸和铁
18、盐。半胱氨酸和铁盐。生长缓慢，固体培养基生长缓慢，固体培养基2-14天。天。目前公认分离军团菌最好的培养基是缓冲炭粉酵母浸膏琼脂加入目前公认分离军团菌最好的培养基是缓冲炭粉酵母浸膏琼脂加入-酮戊二酮戊二酸（酸（BCYE-平板，平板，buffered chacoal yeast extract）。在此平板上一般需）。在此平板上一般需4天天能发育为白色或灰白色，光滑湿润，毛玻璃样的典型军团菌菌落。菌落直径能发育为白色或灰白色，光滑湿润，毛玻璃样的典型军团菌菌落。菌落直径可达可达2 3mm，接种针触之柔软。菌落在紫外灯下有荧光。，接种针触之柔软。菌落在紫外灯下有荧光。在不含在不含L-半胱氨酸的半胱氨
19、酸的BCYE或血平板上不生长。或血平板上不生长。Legionella sp.colonies cultivated on an BCYE-Legionella sp.colonies illuminated using ultraviolet light.Life cycle of LegionellaLaboratory in vitro culture in broth Exponential phase bacteria Replicative(non-infectious)forms of bacteria in exponential growth stage,unflagellat
20、ed and sodium resistant Post-exponential (stationary)phase bacteria Infectious forms of bacteria,flagellated and motile;they appear when nutrients become sparse and the pathohens become overcrowdedNatural life cycle Intracellular form Non-infectious replicating form Bacteria actively replicating in
21、LCV Differentiating form Bacteria at last rounds of replication when daughter cells acquire virulent traits(flagellae,resistance to environmental stresses,etc.)Free-swimming form Transmissive virulent form of bacteria that escaped from the previous host and are ready to penetrate next one生化反应（了解）生化反
22、应（了解）军团菌可从有机化合物摄取营养，利用氨基酸作为能量和碳的来源，既军团菌可从有机化合物摄取营养，利用氨基酸作为能量和碳的来源，既不发酵也不氧化糖类，不还原硝酸盐。触酶阳性或弱阳性，尿素酶阴性，液不发酵也不氧化糖类，不还原硝酸盐。触酶阳性或弱阳性，尿素酶阴性，液化明胶。除血清型化明胶。除血清型4 4和和1515以外的各个菌株均有强烈的水解马尿酸盐的作用。以外的各个菌株均有强烈的水解马尿酸盐的作用。生化试验结果触酶-氧化酶-硝酸盐还原-尿素酶-明胶液化+水解马尿酸+糖类发酵-抵抗力抵抗力 军团菌在自然界中抵抗力很强，在自来水中可生存一年左右。对化学消军团菌在自然界中抵抗力很强，在自来水中可生
23、存一年左右。对化学消毒剂敏感，毒剂敏感，0.05%0.05%苯酚苯酚1min1min可致死，对酸有抵抗力。可致死，对酸有抵抗力。样本的采集和运输样本的采集和运输可感染人类的高致病性病原微生物菌可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒毒)种或样本运输管理规定种或样本运输管理规定病原菌名称危害程度分类实验活动所需生物安全实验室级别运输包装分类学名中文名大量活菌操作动物感染实验样本检测非感染性材料试验A/BUN编号Legionella pneumophila嗜肺军团菌第三类BSL-2ABSL-2BSL-2BSL-2 BUN3373标本采集标本采集环境标本采集环境标本采集 冷却塔：在冷却塔使用一段时间后（
24、一个月）采集。采样前需关闭冷却塔：在冷却塔使用一段时间后（一个月）采集。采样前需关闭冷却塔鼓风机，如不能关闭，应佩戴安全护目镜和呼吸道防护装备，带冷却塔鼓风机，如不能关闭，应佩戴安全护目镜和呼吸道防护装备，带橡胶手套。从池中采水，橡胶手套。从池中采水，200500mL200500mL，并测量记录水温。，并测量记录水温。生活热水（淋浴）系统：采样时，带上一次性橡胶手套，用无菌棉生活热水（淋浴）系统：采样时，带上一次性橡胶手套，用无菌棉签采热水（淋浴）喷头处涂抹一份放入无菌试管。然后关闭冷水龙头，签采热水（淋浴）喷头处涂抹一份放入无菌试管。然后关闭冷水龙头，打开热水龙头放打开热水龙头放3min3m
25、in后，采集后，采集200500mL200500mL放入无菌广口瓶，关闭龙头，放入无菌广口瓶，关闭龙头，记录采样时温度。如果水中含有消毒剂，则应添加相应浓度的中和剂。记录采样时温度。如果水中含有消毒剂，则应添加相应浓度的中和剂。临床标本采集临床标本采集 呼吸道分泌物：采集疑似军团菌肺炎病人包括痰、肺洗液、支气管灌呼吸道分泌物：采集疑似军团菌肺炎病人包括痰、肺洗液、支气管灌洗液（抽提物）肺组织等标本。洗液（抽提物）肺组织等标本。尿标本采集：采集可疑病人尿标本，放入可密封的采尿杯中。尿标本采集：采集可疑病人尿标本，放入可密封的采尿杯中。血清标本：采集病人静脉血血清标本：采集病人静脉血23mL23m
26、L，放入不带抗凝剂的采血管中，放入不带抗凝剂的采血管中，2000r2000r离心离心10min10min，吸取上层血清，放入，吸取上层血清，放入0.51mL0.51mL的带盖的小离心管中。的带盖的小离心管中。标本运送 环境标本放入采样箱，常温运送，不必冷冻，标本最好在两天内环境标本放入采样箱，常温运送，不必冷冻，标本最好在两天内送达实验室，可室温储藏于实验室（不超过送达实验室，可室温储藏于实验室（不超过2周）备检。周）备检。临床标本临床标本4运送立即送检，进行病原分离。血清标本如不能立运送立即送检，进行病原分离。血清标本如不能立即检测，可放即检测，可放4暂存（一周内）。暂存（一周内）。几种军团
27、菌培养基几种军团菌培养基:BCYE-GVPC VPC BCYE-Cys ABCYE medium Bovine serum albumin(fraction V)10g/LBuffered charcoal yeast extract(BCYE)agar Composition charcoal 2.0 g Yeast extract 10.0 g ACES buffer 10.0 g Ferric pyrophosphate(soluble)0.25 g L-cysteine HCl-H20 0.40 g Agar,bacto(Oxoid)17.0 gPotassium alpha-keto
28、glutarate 1.0 g Distilled water 1,000 ml Antibiodic components for media 1.GPCV medium Glycine 0.3%Polymyxin B 100 units/ml Vancomycin 5 ug/ml Cycloheximide 80 ug/ml2.PCV medium GPCV medium without glycine 1 1、临床标本处理、临床标本处理临床标本（痰、气管灌洗液等呼吸道分泌物或肺组织等）临床标本（痰、气管灌洗液等呼吸道分泌物或肺组织等）直接免疫荧光法镜检直接免疫荧光法镜检血清抗原抗体检测血
29、清抗原抗体检测尿抗原检测尿抗原检测无菌标本直接转种无菌标本直接转种GVPCGVPC或或BCYEBCYE平板平板污染样品进行酸处理或污染样品进行酸处理或热处理后转热处理后转GVPCGVPC平板平板取取5ml5ml血液接种血液接种BCYEBCYE双相培养基双相培养基第三天起挑选可疑菌落做鉴定第三天起挑选可疑菌落做鉴定365%CO2，714d环境标本（饮用水、空调系统水、天然水、沉积物等）环境标本（饮用水、空调系统水、天然水、沉积物等）0.450.45m m孔径滤膜过滤，剪碎孔径滤膜过滤，剪碎滤膜放于滤膜放于5mL5mL无菌水中，振荡无菌水中，振荡3min3min，制成浓缩样本，制成浓缩样本高速离心
30、浓缩法高速离心浓缩法直接免疫荧光等快速方法直接免疫荧光等快速方法浓缩液、酸处理、热处理后各取浓缩液、酸处理、热处理后各取0.1mL0.1mL用用L L棒在棒在GVPCGVPC上推种上推种第三天起可挑取可疑菌落做鉴定第三天起可挑取可疑菌落做鉴定2 2、环境标本处理、环境标本处理36，5%CO2，714d3 3、军团菌鉴定、军团菌鉴定将可疑菌落次代培养与将可疑菌落次代培养与BCYE-BCYE-，BCYE-cysBCYE-cys及血平板及血平板BCYE-BCYE-生长、生长、BCYE-cysBCYE-cys及血平板不生长及血平板不生长极可能是军团菌极可能是军团菌其他的生长模式其他的生长模式非军团菌非
31、军团菌免疫荧光方法确认免疫荧光方法确认血清确认、乳胶凝集试验确认血清确认、乳胶凝集试验确认生化鉴定生化鉴定36，5%CO2，714d标本浓缩Nucleopore filter funnel assembly for concentrating water samples.水样的离心 沉积物应重悬 6000r,10min或3000r,30min离心温度2535无菌操作去上清，留大约20mL，不要吸干沉积物应再重悬离心样品涂布军团菌选择性平板如果确定军团菌CFU105，原样品可可直接接种平板浓缩标本的酸处理与热处理酸处理：加入酸的体积应与浓缩样本的体积相同，轻晃混匀，处理酸处理：加入酸的体积应与浓
32、缩样本的体积相同，轻晃混匀，处理5min。Reagents for Acid Treatment Procedure KCl-HCl Acid （pH2.2）A.0.2 M KCl(14.9 g/L in distilled water)B.0.2 M HCl(16.7 g/L in distilled water)1.Mix 18 parts of(A)with 1 part of(B)2.Dispense into bottles and sterilze by autoclaving 热处理热处理向无菌试管内加入1mL左右的浓缩标本在501水浴中放置30min。一个一个GVPC平板上可以
33、接种平板上可以接种0.10.5mL样品样品用无菌的涂抹器均匀的涂抹在培养基表面用无菌的涂抹器均匀的涂抹在培养基表面用同样的方法尽快将热处理与酸处理的样品接种到第二块用同样的方法尽快将热处理与酸处理的样品接种到第二块和第三块培养基上和第三块培养基上接种过的培养基静置至接种物被完全吸收，然后将平板倒接种过的培养基静置至接种物被完全吸收，然后将平板倒置，置，36，2.5%CO2培养培养210天天培养箱内应放置盛水装置保持湿度培养箱内应放置盛水装置保持湿度平板检查平板检查：培养期间，每两天至少观察一次，因为军团菌生：培养期间，每两天至少观察一次，因为军团菌生长缓慢，可能会被其他菌所掩盖。可疑军团菌用记
34、号笔标记。长缓慢，可能会被其他菌所掩盖。可疑军团菌用记号笔标记。选择培养基的接种与培养选择培养基的接种与培养至少从每块至少从每块GVPCGVPC平板挑选出三个典型菌落，在平板挑选出三个典型菌落，在BCYE-BCYE-与与BCYE-CysBCYE-Cys培养基上同时进行传代培养培养基上同时进行传代培养培养培养210210天天凡是在凡是在BCYE-BCYE-生长而生长而BCYE-CysBCYE-Cys不生长的菌落可初步认定为不生长的菌落可初步认定为军团菌军团菌血琼脂可疑代替血琼脂可疑代替BCYE-CysBCYE-Cys军团菌传代培养 A water sample containing legion
35、ellae after culture on the four types of media.Plate 1,BCYE agar with numerous non-Legionella bacteria and a few Legionella colonies;Plate 2,PCV agar with numerous Legionella colonies and other bacteria;Plate 3,GPCV agar with Legionella,few,if any non-Legionella bacteria are present;Plate 4,PCV-with
36、out cysteine agar with some non-Legionella bacteria;no legionellae are present.A water sample containing legionellae after culture on the four types of media.Legionella colonies as seen through a dissecting microscope on primary isolation(4 days incubation).Note the white“cut-glass”appearance of the
37、 center of the colony and the purple iridescence which borders it.The iridescence can be one of several colors;the significance of the color is unknown.名称规格单位备注产地或品牌产地或品牌军团菌诊断血清军团菌诊断血清2ml10种套包含:嗜肺性军团菌16群、波兹曼军团菌、杜莫氏军团菌、高尔曼军团菌、麦克答德军团菌诊断血清日本生研所日本生研所军团菌的血清学鉴定军团菌的血清学鉴定军团菌的乳胶凝集实验军团菌的乳胶凝集实验观察凝集结果，按下表进行判断观察
38、凝集结果，按下表进行判断与与1 1群测试试剂反应群测试试剂反应与与2-152-15群测试试剂反应群测试试剂反应与种测试试剂反应与种测试试剂反应结果判断结果判断+-嗜肺军团菌血清嗜肺军团菌血清1 1群群-+-嗜肺军团菌血清嗜肺军团菌血清2-152-15群群-+存在军团菌存在军团菌-不存在军团菌不存在军团菌军团菌PCR检测用于临床和环境标本军团菌特异性核酸检测，快速鉴定军团菌。用于临床和环境标本军团菌特异性核酸检测，快速鉴定军团菌。引物序列引物序列扩增16SrRNA基因，检测军团菌属引物序列：Primer1:5GAGGGTTGATAGGTTAAGAGC3Primer2:5CGGTCAACTTATC
39、GCGTTTGCT3扩增产物片段430bp扩增Mip基因，检测嗜肺军团菌种序列Primer1:5GTCATGAGGAATCTCGCT3Primer2:5CTGGCTTCTTCCAGCTTC3扩增产物片段870bp细菌细菌DNA模板制备模板制备挑取单个菌落与100L裂解液中混匀，与100煮沸10min，冰浴5min。10000r/min离心5min，取上清液做PCR反应模板。扩增参数扩增参数94 5min94 30s 55 30s72 60s 扩增40循环72 5min短期保存：短期保存：将军团菌接种在将军团菌接种在BCYE-BCYE-斜面培养基上，能在斜面培养基上，能在44保存数周保存数周长期保存：长期保存：冷冻干燥冷冻干燥低温保存法：低温保存法：将已灭菌的含有将已灭菌的含有ACESACES、L-L-半胱氨酸和半胱氨酸和20%20%甘甘油的保存液分装至油的保存液分装至2mL2mL的螺帽冻存管中，每管的螺帽冻存管中，每管1mL1mL。用灭菌棉签从用灭菌棉签从BCYE-BCYE-平板上刮取适量细菌，放入以上装有平板上刮取适量细菌，放入以上装有保存液的冻存管中。冻存管必需耐受低温。保存液的冻存管中。冻存管必需耐受低温。将冻存管放入将冻存管放入-70-70保存。保存。菌种保存谢谢！
