1、许燕晴 08411441 摘要摘要 本文在筛选获得一批酒精发酵力较强的二倍体酿酒酵母菌株的基础上，优化产孢本文在筛选获得一批酒精发酵力较强的二倍体酿酒酵母菌株的基础上，优化产孢条件，应用筛选获得的高产酒精的单倍体菌株，经条件，应用筛选获得的高产酒精的单倍体菌株，经杂交育种杂交育种构建高产酿酒酵母菌株。构建高产酿酒酵母菌株。以以二倍体菌株二倍体菌株ZJD3ZJD3一一3 3、ZJD3ZJD3一一4 4、ZJD3ZJD3一一7 7、ZJD3ZJD3一一9 9和和ZJD3ZJD3一一11(11(称为称为ZJD3ZJD3系列系列)及非及非整倍体菌株整倍体菌株c19c19为实验菌株为实验菌株，经对产孢培
2、养基的优选，确认，经对产孢培养基的优选，确认McClaryMcClary产孢培养基产孢培养基为适宜为适宜的高产孢率培养基。在该培养基上经的高产孢率培养基。在该培养基上经2525、7 7天培养，酿酒酵母的产孢率可达到天培养，酿酒酵母的产孢率可达到47%47%。对对ZJD3ZJD3系列二倍体菌株进行单倍体分离，获得单倍体系列二倍体菌株进行单倍体分离，获得单倍体7171株株。对筛选所得单倍体菌株，。对筛选所得单倍体菌株，以及实验室原有单倍体菌株以及实验室原有单倍体菌株c36c36、c36c36一一8 8、c36c36一一9 9进行交配型和发酵性能测定，交配型进行交配型和发酵性能测定，交配型为为a a
3、型的单倍体与交配型为型的单倍体与交配型为的单倍体数目差异较大。得交配型的单倍体数目差异较大。得交配型a a的单倍体菌株的单倍体菌株3030株，株，交配型交配型的单倍体菌株的单倍体菌株1818株。从中筛选获得发酵性能较强的单倍体菌株株。从中筛选获得发酵性能较强的单倍体菌株4 4株，其中株，其中1 1株株为为a a型，型，3 3株为株为型，发酵性能最强的型，发酵性能最强的zs-5zs-5菌株其同等条件下酒精发酵后的酒度高出二菌株其同等条件下酒精发酵后的酒度高出二倍体亲株倍体亲株4.5%4.5%。以得到的以得到的4 4株强发酵菌株和单倍体菌株株强发酵菌株和单倍体菌株c36c36、c36c36一一8
4、8、c36c36一一9 9以及非整倍体菌株以及非整倍体菌株 C19C19为杂交亲株，分别进行群体杂交，发现不同交配型单倍体混合为杂交亲株，分别进行群体杂交，发现不同交配型单倍体混合2h2h后开始出现哑铃型后开始出现哑铃型细胞，平板分离培养细胞，平板分离培养48h48h后，经鉴定共获得杂合子后，经鉴定共获得杂合子124124株，经酒精发酵测验，从中筛选株，经酒精发酵测验，从中筛选获得发酵性能优良的酵母菌株获得发酵性能优良的酵母菌株6 6株。结果表明，株。结果表明，95%95%以上的杂合子酒精发酵性能优于杂以上的杂合子酒精发酵性能优于杂交亲株，最优者比杂交单倍体亲株提高交亲株，最优者比杂交单倍体亲
5、株提高 17.7%17.7%，比原始二倍体菌株高，比原始二倍体菌株高15.5%15.5%。经杂交育经杂交育种与重复酒精发酵测验，最终确认种与重复酒精发酵测验，最终确认zjzj一一1 1、zjzj一一2 2、zjzj一一3 3、zjzj一、一、zjzj一一5 5、zjzj一一6 6等等6 6株株高产酒精的菌株，为进一步选育构建超级工程菌株奠定了扎实基础。高产酒精的菌株，为进一步选育构建超级工程菌株奠定了扎实基础。前言前言 酒精生产用酒精生产用酿酒酵母酿酒酵母属于属于子囊菌亚门中的酵母菌科成员子囊菌亚门中的酵母菌科成员，主要，主要以出芽方式进行繁殖以出芽方式进行繁殖，属单细胞真核微生物属单细胞真核
6、微生物。利用酿酒酵母发酵糖类生产乙醇的历史非常悠久，。利用酿酒酵母发酵糖类生产乙醇的历史非常悠久，目前世界乙醇目前世界乙醇产量的产量的80%80%以上是通过酿酒酵母以淀粉质或其他糖质原料发酵生产的以上是通过酿酒酵母以淀粉质或其他糖质原料发酵生产的.酵母菌在厌氧条件下发酵己糖生成酒精，其生化途径主要由两个阶段组成。第一个酵母菌在厌氧条件下发酵己糖生成酒精，其生化途径主要由两个阶段组成。第一个阶段为己糖通过糖酵解途径阶段为己糖通过糖酵解途径(EMP(EMP途径途径)分解生成丙酮酸。第二个途径丙酮酸由脱羧酶催化分解生成丙酮酸。第二个途径丙酮酸由脱羧酶催化形成乙醛和二氧化碳，乙醛进一步被还原生成乙醇。
7、葡萄糖发酵生成乙醇的总反应简式形成乙醛和二氧化碳，乙醛进一步被还原生成乙醇。葡萄糖发酵生成乙醇的总反应简式为为:C6H206 C6H2062C2H50H+2C02+2C2H50H+2C02+能量能量 就理论而言，酿酒酵母行酒精发酵，每消耗就理论而言，酿酒酵母行酒精发酵，每消耗 1mol 1mol葡萄糖可产生葡萄糖可产生 2mol 2mol乙醇，即乙醇，即180180克克葡萄糖产生葡萄糖产生9292克乙醇，理论得率为克乙醇，理论得率为51.n%51.n%。可在生产实际中，远未达到此得率。原因是酵。可在生产实际中，远未达到此得率。原因是酵母发酵过程中除主要生成乙醇外，还生成少量的其他副产物，包括甘
8、油、有机酸母发酵过程中除主要生成乙醇外，还生成少量的其他副产物，包括甘油、有机酸(乙酸、乙酸、乳酸、墟拍酸等乳酸、墟拍酸等)、杂醇油、杂醇油(高级醇高级醇)、醛类等，大约有、醛类等，大约有4 4一一10%10%的碳源将被用于形成副物，的碳源将被用于形成副物，加之工艺条件与其他环境因素的影响，实际可发酵性糖的利用率更低。我国目前工业规加之工艺条件与其他环境因素的影响，实际可发酵性糖的利用率更低。我国目前工业规模的酒精生产因不同地区、企业、所用原料与酵母种类、工艺条件等方面的差异，糖醇模的酒精生产因不同地区、企业、所用原料与酵母种类、工艺条件等方面的差异，糖醇转化率一般在转化率一般在8585一一9
9、0%90%之间。之间。自改革开放以来，由于我国经济与社会的持续快速发展，能源需求快速增长与供给自改革开放以来，由于我国经济与社会的持续快速发展，能源需求快速增长与供给能力严重不足的矛盾日益突出，环境空气污染的日益加剧，己经成为制约社会可持续健能力严重不足的矛盾日益突出，环境空气污染的日益加剧，己经成为制约社会可持续健康发展的瓶颈之一。康发展的瓶颈之一。20002000年后，国家开始具体实施发展可再生、替代性、环保型能源战年后，国家开始具体实施发展可再生、替代性、环保型能源战略，先后在我国黑龙江、吉林、河南、安徽四省布局建设以农作物所含有淀粉或糖质原略，先后在我国黑龙江、吉林、河南、安徽四省布局
10、建设以农作物所含有淀粉或糖质原料生产可再生、环保型、替代性能源料生产可再生、环保型、替代性能源-燃料乙醇的定点生产基地，燃料乙醇的定点生产基地，20062006年生产规模已年生产规模已达到达到100100余万吨，并以较快速度发展至本五年计划末达到近余万吨，并以较快速度发展至本五年计划末达到近500500万吨万吨/年的生产规模。年的生产规模。由于燃料乙醇的大规模生产消耗了数量比较巨大的淀粉与糖质原料，导致相应原料由于燃料乙醇的大规模生产消耗了数量比较巨大的淀粉与糖质原料，导致相应原料的市场价格较快速上扬，燃料乙醇生产成本不断上升，虽然现燃料乙醇定点生产得到国的市场价格较快速上扬，燃料乙醇生产成本
11、不断上升，虽然现燃料乙醇定点生产得到国家一定的财政补贴，但目前原料价格上涨幅度已使燃料乙醇生产企业濒临亏损边缘。因家一定的财政补贴，但目前原料价格上涨幅度已使燃料乙醇生产企业濒临亏损边缘。因此，构建酒精高产酵母，对于降低燃料乙醇生产成本，确保燃料乙醇生产企业利润，促此，构建酒精高产酵母，对于降低燃料乙醇生产成本，确保燃料乙醇生产企业利润，促进其自身稳定发展，顺利实现国家新能源战略目标，保持社会与经济可持续健康发展等进其自身稳定发展，顺利实现国家新能源战略目标，保持社会与经济可持续健康发展等均具重要的意义。均具重要的意义。长期以来，提高酵母酒精发酵的得率不外乎探索新发酵工艺和选育高产长期以来，提
12、高酵母酒精发酵的得率不外乎探索新发酵工艺和选育高产酿酒酵母菌株。高产菌株的选育主要是从自然界或已知能产酒精的酵母中分离酿酒酵母菌株。高产菌株的选育主要是从自然界或已知能产酒精的酵母中分离筛选。从自然界筛选的野生酵母一般很难具有用于发酵工业生产的理想特性，筛选。从自然界筛选的野生酵母一般很难具有用于发酵工业生产的理想特性，需要进一步的驯化培养和利用育种技术进行改良，使其达到工业大生产的要求。需要进一步的驯化培养和利用育种技术进行改良，使其达到工业大生产的要求。诱变育种是菌种选育的重要方法之一，通过各种物理和化学因子诱变，能够得诱变育种是菌种选育的重要方法之一，通过各种物理和化学因子诱变，能够得到
13、性能增强的酵母菌株。随着原生质体融合和基因工程技术的不断成熟，采用到性能增强的酵母菌株。随着原生质体融合和基因工程技术的不断成熟，采用原生质体融合和重组原生质体融合和重组DNADNA技术实现高产酒率酿酒酵母菌株的构建，其研究报道技术实现高产酒率酿酒酵母菌株的构建，其研究报道屡见不鲜。通过代谢工程手段阻断酿酒酵母甘油的合成或降低甘油的合成量，屡见不鲜。通过代谢工程手段阻断酿酒酵母甘油的合成或降低甘油的合成量，以提高乙醇发酵的糖醇转化率，也已有实验室条件下获得成功的报道。可见工以提高乙醇发酵的糖醇转化率，也已有实验室条件下获得成功的报道。可见工业微生物优良菌株的选育从自然选择、驯化育种业微生物优良
14、菌株的选育从自然选择、驯化育种 、诱变育种、诱变育种 、杂交育种、杂交育种 、代谢调节育种代谢调节育种 发展到基因工程育种发展到基因工程育种 ，在减少盲目性、省时、降低工作量、提，在减少盲目性、省时、降低工作量、提高选育效率等方面已取得长足的进步。高选育效率等方面已取得长足的进步。工业微生物遗传育种，选用哪种或先后采用哪几种方法为宜，应根据所工业微生物遗传育种，选用哪种或先后采用哪几种方法为宜，应根据所用菌株的特性，目的产物生成的代谢途径与调控模式、工业化实际应用时的工用菌株的特性，目的产物生成的代谢途径与调控模式、工业化实际应用时的工艺条件等因事制宜，具体把握。艺条件等因事制宜，具体把握。酿
15、酒酵母属真核生物酿酒酵母属真核生物，结构组成与代谢调控体系复杂结构组成与代谢调控体系复杂。酿酒酵母酒精发。酿酒酵母酒精发酵的代谢，属细胞基础代谢范畴，酵母细胞高效率吸收利用可发酵性糖生长代酵的代谢，属细胞基础代谢范畴，酵母细胞高效率吸收利用可发酵性糖生长代谢生成乙醇的效率受细胞全能性调控网络协调控制，属本源性多基因、多步骤、谢生成乙醇的效率受细胞全能性调控网络协调控制，属本源性多基因、多步骤、全局性高度协调的基因表达调控模式。因此，要人为地方向明确地提升其代谢全局性高度协调的基因表达调控模式。因此，要人为地方向明确地提升其代谢水平，又要使其良好适应环境多变的大规模工业生产条件并收到实效，技术难
16、水平，又要使其良好适应环境多变的大规模工业生产条件并收到实效，技术难度极其大。作者所在实验室曾用高温热击、多级诱变为主的技术途径，在技术度极其大。作者所在实验室曾用高温热击、多级诱变为主的技术途径，在技术创新上有所突破，成功选育耐高温、高转化率酒精生产菌株，并在酒精工业上创新上有所突破，成功选育耐高温、高转化率酒精生产菌株，并在酒精工业上实际应用，取得较显著的经济与社会效益。该技术体系虽目前与今后仍不失为实际应用，取得较显著的经济与社会效益。该技术体系虽目前与今后仍不失为一种行之有效的高产酵母选育方法，但该研究成果的问世几近十年，工耗大、一种行之有效的高产酵母选育方法，但该研究成果的问世几近十
17、年，工耗大、费时多、周期长和效率低。费时多、周期长和效率低。现尚未见通过基因或代谢工程获得工业化高效率酒精生产菌株的报道。这现尚未见通过基因或代谢工程获得工业化高效率酒精生产菌株的报道。这主要是由于基因工程技术在工业微生物育种方面虽已取得不少成果，但目前的主要是由于基因工程技术在工业微生物育种方面虽已取得不少成果，但目前的技术水平主要适用于新增受外源基因及其调控系统调控的代谢类型，或内源性技术水平主要适用于新增受外源基因及其调控系统调控的代谢类型，或内源性单基因、寡基因控制的代谢水平的提高。单基因、寡基因控制的代谢水平的提高。酵母杂交酵母杂交在基础研究与酒精高产酵母选育方面，有关专著与论文中可
18、见报在基础研究与酒精高产酵母选育方面，有关专著与论文中可见报道，道，它是一种相对传统的微生物育种手段，通过杂交可以把不同菌株的优良经它是一种相对传统的微生物育种手段，通过杂交可以把不同菌株的优良经济性状集于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷济性状集于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷;通通过杂交可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种，实践过杂交可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种，实践中已取得不少成果。中已取得不少成果。例如，日本的小田等人用酒精酵母和卡尔斯伯酵母杂交获例如，日本的小田等人用酒精酵母和卡尔斯伯酵母
19、杂交获得的杂交株，其乙醇产量和菌体生长量都比亲本有显著的提高，且发酵麦芽糖得的杂交株，其乙醇产量和菌体生长量都比亲本有显著的提高，且发酵麦芽糖的能力比亲株明显增强。但止目前尚未见较为系统地探索研究酒精生产工业菌的能力比亲株明显增强。但止目前尚未见较为系统地探索研究酒精生产工业菌株的杂交育种规律，成功构建工业化规模应用的高性能酒精酵母菌株的报道。株的杂交育种规律，成功构建工业化规模应用的高性能酒精酵母菌株的报道。本文试图结合工业化高产酒精酵母构建课题的研究内容，对现有优良的工业化本文试图结合工业化高产酒精酵母构建课题的研究内容，对现有优良的工业化应用的酒精生产菌株的产孢条件、子囊发育、产孢率、交
20、配型分布规律、杂交应用的酒精生产菌株的产孢条件、子囊发育、产孢率、交配型分布规律、杂交与及其子代中高产株的分布与产酒优势性状的分离组合规律等进行较为系统地与及其子代中高产株的分布与产酒优势性状的分离组合规律等进行较为系统地研究，为建立相对高效率的通过杂交选育构件酒精高产酵母菌株的技术体系莫研究，为建立相对高效率的通过杂交选育构件酒精高产酵母菌株的技术体系莫定基础，同时为促进遗传学理论与技术的发展做出新的贡献定基础，同时为促进遗传学理论与技术的发展做出新的贡献材料与方法材料与方法1.菌株 酵母二倍体：ZJD3-3 ZJD3-4 ZJD3-7 ZJD3-9 ZJD3-11 非整倍体：C19 单倍体
21、：C36 C36-8 C36-9 Z2-3 Hs25 Hs27培养基培养基固体斜面完全培养基固体斜面完全培养基(YPD(YPD）1%酵母提取物 2%葡萄糖 2%蛋白胨 1.5%琼脂 pH自然115C湿热灭菌30min，用于制备斜面和平板。产孢培养基产孢培养基(McClary)葡萄糖 0.1%KCI 0.18%NaAC 0.82%酵母膏 0.25%琼脂 2%产孢培养基产孢培养基(SPM)(SPM)葡萄糖 0.1%KCl l%KH2P04 5mmol/L 酵母膏0.25%琼脂 2%基本培养基基本培养基葡萄糖 2%KH2PO4 0.1%MgSO4.7H2O 0.05%(NH4)2SO4 0.5%琼脂
22、 2%PH 6.0酒母培养基酒母培养基玉米面粉糖化缪，加糖化酶过夜(2024h)后，缪液用两层纱布过滤，取滤过液，加水调整其糖度为14Bx。115C湿热灭菌30min。如暂不使用，则置于-20冰箱中冷藏，化冻后再灭菌使用。发酵培养基发酵培养基23一26Bx的玉米面粉糖化缪，不需要糖化过夜与过滤。加压闷煮lh后，直接使用。无需灭菌。甘油保种培养基甘油保种培养基50%甘油十50%YPD（加琼脂的固体培养基)，分装至甘油管中。115C湿热灭菌3Omin，用于保种。试剂试剂斐林试剂斐林试剂甲液:精确称取分析纯硫酸铜(CuSO45H2O)69.278克，加水溶解后，稀 释定容至1000毫升。乙液:称取酒
23、石酸钾钠(KNaC4H4O64H2O)346克和氢氧化钠(NaOH)100 克，加水溶解后，稀释定容至1000毫升。0.2%0.2%标准葡萄糖溶液标准葡萄糖溶液取分析纯葡萄糖置105一110C干燥1.5一2h，冷却后，精确称取2.000克，溶于水后，稀释定容至1000毫升。液化酶液化酶2000020000u/u/mlml，糖化酶糖化酶100000100000u/u/mlml，O.O.1N1N氢氧化钠氢氧化钠称取4克分析纯氢氧化钠(NaOH)，溶于少量已煮沸并冷却的蒸馏水中，弃去下面碳酸钠沉淀物，取上层清液，用上述蒸馏水稀释至1000毫升。1%1%次甲级蓝溶液次甲级蓝溶液称取次甲级蓝1克加水溶解
24、，稀释至100毫升。1%1%酚酞指示剂酚酞指示剂称取酚酞1克，溶解于100毫升95%酒精中。0.85%0.85%氯化钠溶液氯化钠溶液(生理盐水生理盐水)0.8一0.9Kg/cm压力下高压蒸汽灭菌 20minSNSN浓硫酸浓硫酸 量取比重为1.84的分析纯浓硫酸135毫升，缓缓注入已盛有800毫升水的1000毫升容量瓶中，待冷却至常温后，加水稀释至刻度。柠檬酸一磷酸缓冲液柠檬酸一磷酸缓冲液(C CPB)PB)0.lmol/L 柠檬酸0.2mol/L NaHPo4(0.8一0.9Kg/cm压力下高温蒸汽灭菌)10%10%蜗牛酶蜗牛酶，使用前用高渗CPB缓冲液配置，0.45um滤膜抽虑灭菌 10%1
25、0%琉基乙醇琉基乙醇 主要设备与器材主要设备与器材台式离心机，台式离心机，TGLTGL一一 16C 16C，糖液计，一糖液计，一2525，010010，10201020，20302030，酒精计，酒精计，010010，10201020，电热恒温水槽，电热恒温水槽，DK-8BDK-8B，电子天平，电子天平，MettlerPM460 MettlerPM460显微镜，显微镜，XSJXSJ一一l l血球计数板，血球计数板，XBXB一一K-25,K-25,灭菌锅，灭菌锅，ZDXZDX一一35BI35BI，振荡器，振荡器，HZHZ一一931IK931IK、HzHz一一2010K2010K，磁力搅拌器，磁力
26、搅拌器，电热恒温培养箱，电热恒温培养箱，DHPDHP一一908908，冷冻摇床，冷冻摇床，HZHZ一一 93IOK 93IOK，pHpH计，计，烘箱，烘箱，单倍体的获得单倍体的获得诱导孢子形成的方法诱导孢子形成的方法 将酿酒酵母菌株于YPD固体斜面上28培养48h活化，活化两次后接入产孢培养基，25培养3一7天，在显微镜下观察子囊孢子形成情况，计算一个视野内酵母总数和子囊孢子数，并计算产孢率。产孢率(%)=子囊孢子数量/总细胞数子囊孢子分离和单倍体的获得子囊孢子分离和单倍体的获得 菌株活化后接入产孢培养基，3天后镜检观察，无菌水(2ml)倾于斜面上，用接种环刮下菌体，收集菌悬液于7ml离心管中
27、，6000rpm离心 10min收集菌体。0.85%生理盐水悬浮洗涤12次，分别加入 0.7mlTris一Hcl(pH8.0，0.01M);200ul 10%蜗牛酶(终浓度为0.02):l00ul 10%琉基乙醇(终浓度为0.01)，120rpm(缓慢振荡)培养16h破子囊壁，使孢子释放。利用孢子比营养细胞耐热特性，采用58高温致死处理营养细胞，离心收集孢子，并用Tris一HCI(pH8.0，0.01M)洗涤两次。取适当稀释倍数，涂布于YPD平板上，28培养2一3d。单倍体的鉴定单倍体的鉴定 培养后挑取小菌落，镜检观察是否为单倍体。将获得的疑是单倍体再接入产孢培养基，培养7天左右观察子囊形成，
28、以确定是否为真正的单倍体。有子囊形成者基本确认为二倍体，不形成子囊者基本确认为单倍体。把确定为单倍体的菌株分别保种(YPD斜面、甘油管)。单倍体交配型的确定单倍体交配型的确定 单倍体菌株与标准菌株在YPD斜面活化后，分别接种到装有10mlYPD液体培养基的250ml三角瓶中培养，30C，200rpm/min，24h。取lml待测的单倍体菌株菌液和lml标准菌株菌液接种到新鲜的10mlYPD液体培养基中，30，200rpm/min镜检观察哑铃形细胞产生，混合菌液培养过夜后离心(300rpm/min，5min)，菌体沉淀后接种到产孢培养基中培养3一7天，镜检观察有无子囊产生，确定交配型，能与a型标
29、准菌株杂交并且产孢的菌株交配型为；能与型标准菌株杂交并且产孢的菌株交配型为a。单倍体杂交与二倍体的检出单倍体杂交与二倍体的检出 将a型与型单倍体菌株混合接种于YPD液体培养基中，30摇床培养，镜检观察接合子的形成情况。镜检杂交完成后吸取适量菌液，涂布于基本培养基平板，30C培养。挑取较大的单菌落，在产孢培养基上鉴定菌株的产孢能力，能够产孢的菌株确定是经杂交形成的二倍体菌株，编号保存。菌株酒精发酵转化率的测定菌株酒精发酵转化率的测定玉米面粉糖化酪的制作玉米面粉糖化酪的制作(双酶法双酶法)将水的pH值调至5左右，将玉米与面粉以3:7混合，按照1:2.6的料水比搅拌混合均匀，浸泡30min。高温蒸煮
30、且不断搅拌，使淀粉初步糊化而不至于结块，当温度升至50-60C时每克淀粉加5ug淀粉的液化酶。继续蒸煮，加压使温度达到115c，蒸煮lh使淀粉完全糊化。冷却至95C后再加液化酶5u/g淀粉，彻底搅拌均匀，冷却至60c时加糖化酶200u/g淀粉，并在55c水浴条件下糖化，用于培养酒母的糖化缪，糖化18一24h，两层纱布过滤得滤液即玉米面粉糖化液。用于酒精发酵的糖化缪不需要糖化过夜与过滤，在加糖化酶200u/g淀粉糖化30min后直接分装三角瓶接种发酵。发酵工艺流程发酵工艺流程将待测菌株经过斜面传代培养验证稳定性后，接种于新鲜斜面培养基培养，再转接至种子培养基培养，当细胞生长至对数生长期、细胞数目
31、达到 1x10/m1以上时，按发酵培养基体积的15%的接种量，接种到发酵培养基中，发酵72h左右，测定发酵成熟缪外观糖度、酒精度、酸度、残余还原糖等相关参数值。具体操作如下:(l)菌种于YPD斜面上30c活化两次，接种至装有8mll4一15Bx种子糖化液的 2 x 20大试管中，30C培养16一20h(2)菌液接入装有100ml 14-15Bx的种子糖化液的250ml三角瓶中，30C，200rpm 培养10一12h。(3)发酵使用500ml三角瓶，内分装255g发酵培养基，接入二级种子液45g，装上发酵拴，31C静置培养。(4)8一12小时后注入5N浓硫酸于发酵拴小瓶中封口，发酵培养的温度每隔
32、2h升高1C直至升温达35C，静置发酵72h左右。5)发酵完成后测定发酵成熟缪的酒精度、外观糖度、残余还原糖与酸度等参数值，供结果分析。酒精发酵相关参数的测定酒精发酵相关参数的测定发酵曲线的测定发酵曲线的测定将酵母接入发酵培养基发酵静止培养以后，每隔12h测定CO2失重量，并计算发酵效率。发酵效率(%)=CO2失重量/(培养基中葡萄糖量X 0.49)X 100酒精度的测定酒精度的测定将发酵后的成熟缪100ml与水100ml混合后置于500ml三角瓶或蒸馏烧瓶中，电炉上蒸馏出10Oml的酒精水溶液，用酒精计温度计测量该溶液的酒精度(V/V)与温度，查温度酒度校正表，求出在温度20时以容量百分数表
33、示的酒精水溶液的酒精浓度。外观糖度的测定外观糖度的测定量取过滤后的滤液 100ml，用糖度计和温度计直接测量出外观糖度和温度，然后查糖度温度校正表校正为20C时的糖度。酸度的测定酸度的测定取用两层纱布过滤后的发酵成熟缪滤过液lml，放入1O0ml三角瓶中，加中性蒸馏水50ml，加入酚酞指示剂2滴，用 0.1N NAOH滴定至微红色在30秒内不消失为终点。每lml糖化缪过滤液用上述NaOH溶液滴定至终点，每消耗0.lmlNaoH溶液计为一个酸度。还原糖的测定还原糖的测定称取试样50g，用水洗入250ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，过滤后用。空白试验:吸取斐林氏甲、乙液各5ml，入150ml三
34、角瓶中，加水20ml，由滴定管加入0.2%葡萄糖溶液24ml，置电炉上加热煮沸2min，加入1%次甲级蓝溶液一滴，继续用0.2%葡萄糖液在一分钟内滴定至蓝色完全消退即为终点。记录消耗糖液毫升数V1正式滴定:吸取斐林氏甲、乙液各5ml，入150ml三角瓶中，加入前述备用过滤液V3ml，加水20ml，再加入0.2%葡萄糖液适量，置电炉上加入煮沸2min，加入1%次甲级蓝溶液一滴，继续用0.2%葡萄糖液滴定至终点。记录消耗糖液毫升数V2。还原糖(%)=(vl一v2)x0.002x250/(V3x50)X100%数据处理数据处理 所获得的基本测定数据，采用excel自带的单因素方差分析进行处理，此工具
35、可对两个或更多样本的数据执行简单的方差分析。此分析可提供一种假设测试，该假设的内容是:每个样本都取自相同基础概率分布，而不是对所有样本来说基础概率分布都不相同。结果与分析结果与分析高产孢率培养基的筛选高产孢率培养基的筛选 5株二倍体菌株在两种产孢培养基(SPM和McClary)中25c培养3一7天，显微镜下观察产孢情况，计算产孢率。从表中可以看出，不同的菌株在产孢培养基中产孢率不同。SPM培养基中ZJD3一3的产孢率最低，只有4.67%，ZJD3一9的产孢率最高，为 13.27%左右。在McClary培养基中，ZJD3一9的产孢率最低，为37.89%，ZJD3一11的产孢率最高，达到46.58
36、%。ZJD3系列菌株在SPM产孢培养基培养的总产孢率为4一13%，在McClary产孢培养基培养的总产孢率为37一46%，就各个菌株言，不同菌株在不同的产孢培养基中，产孢率各不相同，而从总体看，在McClary产孢培养基中产孢率较高。由此可见，McClary培养基是酿酒酵母的高产孢率培养基，故本研究中选取McClary培养基为产孢培养基。单倍体菌株的获得单倍体菌株的获得 利用最佳产孢培养基对菌株ZJD3一3、ZJD3-4、ZJD3一7、ZJD3一9、ZJD3-11进行产孢培养并对子囊进行破壁释放子囊孢子，根据子囊孢子比二倍体营养细胞更耐热的特性，对营养细胞与子囊孢子的混合物进行58、10min
37、热处理，稀释涂布YPD平板，然后挑取YPD平板上长出的小菌落，经过活化并再次对挑出的单菌落进行产孢培养，经镜检观察细胞形态较小，具有凝聚性，并且不产孢的即为单倍体。ZJD3系列一共得到71株单倍体。这些菌株分别编号为ZJD3一3一lZJD3一3一15，ZJD3一4一lZJD3一14，ZJD3一7一lZJD3一7一18，ZJD3一9一lZJD3一9一15，ZJD3一11一lZJD3一11一9。对得到的单倍体进行交配型测定，其中交配型为a的菌株占44%，型的菌株占24%，这可能与二倍体带有隐性致死基因或带有孢子发育关键基因的突变基因，从而导致部分子囊孢子不能正常发育有关。实验中发现，部分菌株的形态
38、特征为单倍体，但不能与a型或型标准单倍体菌株杂交，表现出既不是a型又非型的有待进一步鉴定的性状。单倍体菌株酒精发酵力分析单倍体菌株酒精发酵力分析 对分离得到的71株单倍体进行发酵能力测试，以ZJD3一3，C19，以及各自的亲株为对照，经初步发酵试验，获得发酵力较高的单倍体菌株30株。上述单倍体菌株经酒精发酵力测定，发现它们的发酵能力高低不一，暗示酿酒酵母的发酵性能受多基因调控。在30株发酵力较高的菌株中，有12株单倍体的发酵性能高于或等于它们各自的亲株，23株单倍体的发酵力高于对照菌ZJD3一3，9株单倍体的发酵力高于对照菌株C19.在这30株菌株中，分离自ZJD3一3的单倍体7株，分离自ZJ
39、D3一4的单倍体2株，分离自ZJD3一7的单倍体6株，分离自ZJD3一9的单倍体7株，分离自ZJD3一11的单倍体8株。对这些菌株多次发酵，比较它们与对照菌株ZJD3一3和C19以及亲株之间酒精发酵性能的差别，结果如图1所示。其中ZJD3一3系列单倍体中有6株单倍体菌株的发酵性能高于对照菌株ZJD3一3，占ZJD3一3系列单倍体的85.7%，两株菌株的发酵性能高于C19，占该系列的28.6%;ZJD3一4系列单倍体菌株中，有 100%的菌株发酵性能高于对照菌株ZJD3一3，50%菌株发酵高于对照菌株C19，没有菌株的发酵性能超出亲株ZJD3-4。ZJD3一7系列单倍体中，有4株菌株的发酵性能超
40、过对照菌株ZJD3一3和C19以及亲株ZJD3一7。ZJD3一9系列的7株菌株中，4株菌株超过对照菌株ZJD3一3，1株菌株超过亲株ZJD3一9，但没有超过C19的。ZJD3一11系列的单倍体中，7株菌株超过对照菌株ZJD3一3，2株菌株超过C19，1株菌株超过亲株ZJD3一11.最终从ZJD3系列的单倍体中挑出4株发酵性能最高且具有明确交配型的菌株，其中1株a型，3株型。这4株单倍体重新编号为zs一5(，ZJD3一3系列)、zs一11(a，ZJD3一7系列)、zs一13(，ZJD3一7系列)、zs一14(，ZJD3一11系列)，发酵性能见表5。这4株单倍体菌株发酵终了的酒精度与它们的亲株相比
41、，分别增长为zs一 5 4.5%，zs一 11 3.2%，zs一 13 3.2%，zs一 14 3.2%.上述4株最高产的单倍体菌株与实验室原有单倍体C36，C36一8，C36-9和z2一3以及一株非整倍体C19进行杂交(这些原有单倍体菌株的交配型均为a型)，以求获得更高产的杂合后代。杂交及其后代二倍体菌株的检出杂交及其后代二倍体菌株的检出 单倍体细胞具有接合能力，在杂交过程中，不同交配型的两个单倍体在营养等条件适宜时，两个细胞相互识别，相互接触，通过质配、核配，最后融合成一个完整的二倍体合子。在两个细胞杂交融合的过程中往往会出现哑铃形细胞，可在显微镜下辨认，故哑铃形细胞的检出成为检查有无杂交
42、的一个方法。单倍体混合培养2h之后少数混合菌株开始出现哑铃形细胞(见图2)，随后，哑铃形细胞逐渐增多，至48h时，镜检混合菌液发现哑铃形细胞数目变少，出现个体较大的细胞，视为杂交基本完成。因此在混合培养48h后吸取菌液涂布，基本培养基平板培养。将来源于不同亲本的a型单倍体和单倍体菌株进行杂交试验，基本培养基平板培养。在基本培养基平板培养过程中，二倍体的生长速度比单倍体的生长速度快，所以杂交菌株的单菌落会最早出现且较大，选取这样的菌落来进行检测。但单倍体菌株zs一14的生长速度比较快，杂交菌不容易被挑出。单菌落再接种到产孢培养基中培养，最后挑选出具有产孢能力的杂交二倍体菌株共124株，接入YPD
43、斜面保种。杂交菌株发酵性能测验杂交菌株发酵性能测验 获得的 124株杂交二倍体菌株和单倍体亲株以及原始二倍体亲株一同进行发酵性能试验，试验结果见表7。只有5个杂交后代的发酵力低于两个单倍体亲株，42株杂交二倍体菌株的发酵力比亲株提高不到5%，而有66株杂交二倍体菌株的发酵力比亲株高5%以上。这里表现出一种趋势，即绝大部分菌株的发酵性能比原始的二倍体亲株要高。最后挑选出6株发酵力最高以及产酒精最多的杂交菌株，将它们编号为zj一1、zj一2、zj一3、zj一4、zj一5、zj一6。这6个菌株的发酵能力见表8，最多可比单倍体亲株高出7一17.7%，也比原始的二倍体亲株高出 11.3%15，3%。其中
44、zj一4产酒精能力最强，酒精度达到13.95，分别比亲株c36一8和zs一13高出8.6%和17.7%，比原始的二倍体亲株ZJD3一7高出巧15.5%。利用CO2失重法，对这6株杂交菌株在35条件下的葡萄糖发酵率进行测定，图3显示了在发酵初始阶段，杂合子与亲株对比，它们的发酵能力没有多大差别，但这表明杂交二倍体菌株获得了亲株高产酒精的性状。但发酵48h以后，单倍体亲株和原始二倍体亲株的CO2失重量减小，也就是说，葡萄糖转化为酒精的量减少，但杂合子的转化率相对较高。从最后选出的6株杂交菌株看，发酵力比较高的都是实验室原有高产单倍体菌株c36一8、c36一9以及非整倍体C19与选出的单倍体zs一5
45、和zs一13杂交的后代。而另外的两株单倍体菌株zs一11和zs一14相关的杂交菌株发酵力比较低，这可能是由于zs一11和zs一14这两株菌株本身的发酵性能不及zs一5和zs一13造成的。讨论讨论 对于工业微生物行业而言，微生物菌株生产性能的优劣直接影响到原料转化为产物的转化率、产品质量、设备利用率等重要的经济技术指标，是企业经济与社会效益的重要决定性因素之一。就酒精生产企业而言，作为关键技术的酿酒酵母的性能是反映其生产技术水平的一个重要方面。因此，性能优良的酿酒酵母高产菌株的选育构建的有关研究，对维护和提升一个酒精生产企业的技术水平与经济效益均具十分重要的意义。孢子形成孢子形成 酿酒酵母子囊孢
46、子的形成有两个条件:一、其营养环境中较缺乏氮源和可发酵性碳源;二、菌株是二倍体。第一个条件与培养基的成分及培养条件是相关的，产孢前培养于营养丰富的完全培养基中，然后过渡到含醋酸盐为碳源的贫乏培养基中生长的酵母细胞可获得高水平的产孢率。葡萄糖为孢子形成提供碳源骨架和其他前体物质，同时也提供细胞进行减数分裂的能源，但葡萄糖浓度过高会抑制孢子形成，大大降低孢子的形成能力。适量的氮源可增加产孢率，过量氮源会导致菌株营养体的生长，同样大大降低孢子的形成能力。用于工业生产的酿酒酵母菌株，产孢能力十分弱，有的几乎不形成子囊孢子，3一4孢率很低，孢子难以萌发，所以产孢条件复杂。SPM与McClary是两种比较
47、常用的酵母产孢培养基。但没有一种产孢培养基(包括以乙酸盐为唯一碳源的培养基)能够适用于所有的酵母产孢。曾云中等人的研究表明，用SPM培养基培养二倍体酿酒酵母，产孢率最高。而肖冬光等人曾用McClary产孢培养基得到98.5%的产孢率。在本研究中，ZJD3系列二倍体酿酒酵母菌株产孢率相对较低，用SPM产孢培养基培养后发现仍有少量出芽现象且产孢率只有4%一13%，而McCIary产孢培养基培养的产孢率为37%一46%。这两种产孢培养基培养产生的子囊孢子多为二孢子和三孢子子囊，四孢子子囊较为少见。通常认为这是由于减数分裂形成的四个子核中，有部分核基因可能由于发育障碍而未能形成四个子囊孢子。得到的单倍
48、体中，a型占大多数，型相对较少。这可能与二倍体带有隐性致死基因或带有能使孢子不育的遗传因子有关。另外也可能是减数分裂过程中，染色体不等分裂，形成非整倍体型的结果。杂交育种杂交育种 酿酒酵母的杂交育种是指有性孢子或无性细胞相互联接，先是细胞质融合，接着细胞酿酒酵母的杂交育种是指有性孢子或无性细胞相互联接，先是细胞质融合，接着细胞核融合，随后细胞核进行分裂核融合，随后细胞核进行分裂(减数分裂和有丝分裂或有丝分裂减数分裂和有丝分裂或有丝分裂)把遗传性状按一定的规律把遗传性状按一定的规律传给子代。一般来说，杂交育种是通过来源于不同亲本的单倍体之间的杂交，以达到合并传给子代。一般来说，杂交育种是通过来源
49、于不同亲本的单倍体之间的杂交，以达到合并两种或多种工业菌株所需要的特性的目的。但也有从单一亲本分离单倍体进行杂交来优化两种或多种工业菌株所需要的特性的目的。但也有从单一亲本分离单倍体进行杂交来优化性状的。性状的。如从单一亲本的面包酵母中分离得到的单倍体进行杂交，最后选出耐低温性能和发酵性能均有提高的杂交菌株。为方便检出，杂交的单倍体亲株往往需要带有明显的遗传标记，酵母菌杂交育种的遗传标记可为营养缺陷型、呼吸缺陷型、抗药性等，最后利用特定的检出培养基检出。杂交育种可以与紫外诱变、超声波诱变等各种形式的诱变结合在一起，诱变提供了更多的基因突变，为挑选更多优良亲本提供更多样本。诱变育种从细胞接触诱变
50、剂至形成稳定遗传的突变，要经历一个复杂的过程，由于诱变剂对遗传物质的无选择的伤害性，得到的成活菌株或多或少存在遗传背景的损伤，常常使菌株的生产性能有所降低，因此要获得正变菌株的工作量非常大。而杂交育种是选用已知性状的供体菌和受体菌作亲本，因此在方向性方面比诱变育种前进了一大步。杂交育种还有利于消除某一菌株在经历长期诱变后所出现的产量难以提高的障碍。在本研究中，既有不同亲本来源的单倍体杂交，也有单一亲本来源的单倍体杂交。研究证明，同一亲本来源的单倍体杂交后，杂合子发酵能力较弱，一般低于亲本的发酵力。而不同亲本来源的杂合子发酵能力较强，发酵性能高于其亲本的杂合子出现的比例较大。本研究取得成功的关键
