1、荧光的原理及应用主要内容主要内容荧光光谱的基本原理荧光光谱的基本原理1荧光光谱仪的原理、操作及数据处理荧光光谱仪的原理、操作及数据处理2荧光光谱的应用荧光光谱的应用3参考资料参考资料4荧光光谱的基本原理荧光光谱的基本原理荧光定义荧光定义荧光是荧光是辐射跃迁辐射跃迁的一种，是物质从的一种，是物质从激发态激发态失活到失活到多重性多重性相同的低能状态时所释放的相同的低能状态时所释放的辐射。辐射。构造原理：电子在原子或分子中排布所遵循的规则。构造原理：电子在原子或分子中排布所遵循的规则。基态和激发态基态和激发态 能量最低原理能量最低原理 泡利不相容原理泡利不相容原理 洪特规则洪特规则基态：基态：当一个
2、分子中的所有电子的排布都遵从当一个分子中的所有电子的排布都遵从构造原理构造原理时，此分子被称为处于基态。时，此分子被称为处于基态。激发态：当一个分子中的电子排布不完全遵从激发态：当一个分子中的电子排布不完全遵从构造原理构造原理时，此分子被称为处于激发态。时，此分子被称为处于激发态。电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0或或1)；电子激发态的多重度电子激发态的多重度根据洪特规则根据洪特规则(平行自旋比成对自旋稳定平行自旋比成对自旋稳定)，三重态能级比相应单重态能级，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态；
3、低；大多数有机分子的基态处于单重态；分子能级比原子能级复杂；分子能级比原子能级复杂；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；分子能级与跃迁分子能级与跃迁激发：激发：基态基态(S S0 0)激发态激发态(S S1 1、S S2 2激发态振动能级激发态振动能级)：吸收吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；失活：失活：激发态激发态 基态基态：多种途径和方式：多种途径和方式(见能级图见能级图)；速；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；度最快、激发态寿命最短的途径占优势；第一、第二、第一、第二、电子激发电子激发单重态单重
4、态 S S1 1、S S2 2 ；第一、第二、第一、第二、电子激发电子激发三重态三重态 T T1 1、T T2 2 ；雅布隆斯基分子能级图雅布隆斯基分子能级图S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫跃迁规则跃迁规则跃迁前后跃迁前后原子核的构型原子核的构型没有发生改变、跃迁过程中没有发生改变、跃迁过程中电子自旋电子自旋没有没有改变、跃迁前后改变、跃迁前后电子的轨道电子的轨道在空间有较大的在空间有较大的重叠重叠和和轨道的对映性轨道的对映性发生了改变的跃迁是允许的；发生了改变的跃迁是允许的；跃
5、迁过程中跃迁过程中电子自旋电子自旋发生了改变、跃迁前后发生了改变、跃迁前后电子的轨道电子的轨道在空间不在空间不重叠重叠或或轨道的对映性轨道的对映性未发生改变的跃迁是禁阻的。未发生改变的跃迁是禁阻的。Franck-Condon原理原理：在电子跃迁完成的瞬间，分子中在电子跃迁完成的瞬间，分子中原子核的构型原子核的构型是来不及改是来不及改变的。变的。电子处于激发态是不稳定状态，容易返回基态，在这个过程中通过电子处于激发态是不稳定状态，容易返回基态，在这个过程中通过辐射跃迁辐射跃迁(发光发光)和和无辐射跃迁无辐射跃迁等方式失去能量，这个过程就称为失活。等方式失去能量，这个过程就称为失活。失活途径失活途
6、径辐射跃迁荧光磷光内转换外转换系间窜越振动弛豫无辐射跃迁 激发态激发态停留时间短、返回速度快停留时间短、返回速度快的途径，发生的的途径，发生的几率大几率大。失活的途径失活的途径 振动弛豫：同一振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间一般为间一般为10-12 s。无辐射跃迁失活的途径无辐射跃迁失活的途径通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。激发单重态的最低振动能级。内转换：多重度
7、相同的电子能级中等能级间的无辐射内转换：多重度相同的电子能级中等能级间的无辐射能级跃迁。能级跃迁。无辐射跃迁失活的途径无辐射跃迁失活的途径系间窜越：不同多重态系间窜越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行轨道耦合进行。外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级荧光发射：电子由
8、第一激发单重态的最低振动能级基态（基态（多为多为 S S1 1 S S0 0跃迁跃迁），），发射波长为发射波长为 l l2 2的荧光；的荧光；1010-7-71010-9-9 s s。辐射跃迁失活的途径辐射跃迁失活的途径磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（基态（多为多为 T T1 1 S S0 0跃迁跃迁）；）；发射波长为发射波长为 l l3 3 的磷光；的磷光；1010-4-4100 s 100 s。电子由电子由 S S0 0 进入进入 T T1 1 的可能过程：（的可能过程：（S S0 0 T T1 1禁阻跃迁）禁阻跃迁）S S0
9、0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转换内转换系间窜越系间窜越振动弛豫振动弛豫T T1 1 发光速度很慢，光照停止后，可持续一段时间发光速度很慢，光照停止后，可持续一段时间。由图可见，由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；l l2 2 l l 2 2 l l 1 1；荧光探针法测定胶束，囊胞等特殊环境的微极性和微黏度大多数有机分子的基态处于单重态；激发：基态(S0)激发态(S1、S2激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射；从下式可以得到F的粗略估计值(单位为秒)。,2007(129):10620-10621增加溶剂的极性，一般有利于荧光的产生。稀土
10、掺杂半导体纳米材料在绿色照明光源、纳米光电子器件、平板显示、纳米生物标记和传感器等方面有着广阔的应用前景。缺点：f-f禁阻，强度低由朗格-比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)另外，还会受环境（如温度、溶剂等）的影响，例如，降低温度可导致一个化合物的增大，提高温度可导致一个化合物的降低。跃迁过程中电子自旋发生了改变、跃迁前后电子的轨道在空间不重叠或轨道的对映性未发生改变的跃迁是禁阻的。S1T1S1S0+hf分子能级比原子能级复杂；通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。这种长寿命的延时发射的荧光，被称为延迟荧光或缓发荧光。影响荧光的主要因素有哪些？固定激发光
11、波长物质发射的磷光强度与发射光波长关系曲线，如右图中曲线III。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。重复3、4步循环扫描得到理想的光谱图。ItI0e-kt跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速率发生振动弛豫（其速率在1013/s数量级），散失部分能量，达到零振动能级，一般从零振动能级发射荧光；激发谱激发谱 固定发射波长固定发射波长(一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位)，扫描，扫描出的化合物的出的化合物的发射光强发射光强(荧光荧光/磷光磷光)与与入射光波长入射光波长的关系曲线。的关系曲线。主要光谱参量主要光谱参量发射谱发射谱 固定激发波
12、长固定激发波长(一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位一般将其固定于激发波段中感兴趣的峰位),扫描出扫描出的化合物的的化合物的发射光强发射光强(荧光荧光/磷光磷光)与与入射光波长入射光波长的关系曲线。的关系曲线。吸收谱吸收谱 化合物的化合物的吸收光强吸收光强与与入射光波长入射光波长的关系曲线的关系曲线。主要光谱参量主要光谱参量 吸收谱吸收谱反映出的是物质的基态能级与激发态能级之间所有的允许跃迁。反映出的是物质的基态能级与激发态能级之间所有的允许跃迁。通常状态下的物质的通常状态下的物质的表观颜色表观颜色大部分时候取决于其大部分时候取决于其吸收特性吸收特性。激发谱激发谱则反映的是基态与所有与该荧光发
13、射有关的能级之间的跃迁。其所则反映的是基态与所有与该荧光发射有关的能级之间的跃迁。其所呈现的关系比吸收谱要有选择性，但有时候又不如吸收谱来的直接。呈现的关系比吸收谱要有选择性，但有时候又不如吸收谱来的直接。电子跃迁到不同激发态能级电子跃迁到不同激发态能级时，吸收不同波长的能量时，吸收不同波长的能量(如如能级图能级图l l2 2 ,l l1 1)，产生不同吸，产生不同吸收带，但均回到第一激发单收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的回到基态，产生波长一定的荧光荧光(如如l l2 2 )。因此，。因此，发射发射谱的形状与激发波长无关谱的形状与
14、激发波长无关。斯托克位移斯托克位移一个化合物的发射光谱常常与其吸收光谱很类似，但总是较相应一个化合物的发射光谱常常与其吸收光谱很类似，但总是较相应的吸收光谱红移，这称为的吸收光谱红移，这称为斯托克位移斯托克位移（Stokes shift）。）。蒽在溶液中的吸收（虚线）蒽在溶液中的吸收（虚线）和发射（实线）光谱和发射（实线）光谱产生斯托克位移的主要原因：产生斯托克位移的主要原因：1.1.跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速率发生振动弛豫（其速率在率发生振动弛豫（其速率在10101313/s/s数量级），散失部分能量，数量级），散失部
15、分能量，达到零振动能级，一般从零振动能级发射荧光；达到零振动能级，一般从零振动能级发射荧光；2.2.激发态形成后，其分子的构型将很快进一步调整，以达到激发态形成后，其分子的构型将很快进一步调整，以达到激发态的稳定构型，这又损失了部分能量；激发态的稳定构型，这又损失了部分能量；3.3.发射荧光的激发态多为（发射荧光的激发态多为（，*）态，这种激发态较基态）态，这种激发态较基态时有更大的极性，因此将在更大程度上为极性溶剂所稳定，使时有更大的极性，因此将在更大程度上为极性溶剂所稳定，使激发态的能量进一步降低。激发态的能量进一步降低。斯托克位移斯托克位移不过，有时在高温下也可观察到不过，有时在高温下也
16、可观察到反斯托克位移反斯托克位移现象，即荧光光谱移向现象，即荧光光谱移向吸收光谱的短波方向。这是由于高温使更多的激发态分子处于高振动吸收光谱的短波方向。这是由于高温使更多的激发态分子处于高振动能级，荧光主要从激发态的高振动能级发出所致。能级，荧光主要从激发态的高振动能级发出所致。既没发生斯托克位移也没发生反斯托克位移的荧光称既没发生斯托克位移也没发生反斯托克位移的荧光称共振荧光共振荧光。反斯托克位移反斯托克位移荧光发射是光吸收的逆过程。荧光发射光谱与吸收光谱有类似镜影的荧光发射是光吸收的逆过程。荧光发射光谱与吸收光谱有类似镜影的关系。但当激发态的构型与基态的构型相差很大时，荧光发射光谱将关系。
17、但当激发态的构型与基态的构型相差很大时，荧光发射光谱将明显不同于该化合物的吸收光谱。明显不同于该化合物的吸收光谱。镜像规则镜像规则荧光光谱荧光光谱 固定激发光波长物质发射的荧光强度与发固定激发光波长物质发射的荧光强度与发射光波长关系曲线，如右图中曲线射光波长关系曲线，如右图中曲线II。荧光本身则是由电子在两能级间不发生自荧光本身则是由电子在两能级间不发生自旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。磷光光谱磷光光谱 固定激发光波长物质发射的磷光强度与固定激发光波长物质发射的磷光强度与发射光波长关系曲线，如右图中曲线发射光波长关系曲线，如右图中曲线III。磷光本身则是由电
18、子在两能级间发生自旋磷光本身则是由电子在两能级间发生自旋反转的辐射跃迁过程中所产生的光。反转的辐射跃迁过程中所产生的光。荧光光谱与磷光光谱荧光光谱与磷光光谱光谱图光谱图自吸收现象自吸收现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；光，如色胺酸中的重铬酸钾；内滤光作用和自吸收现象内滤光作用和自吸收现象200250300350400450500荧
19、光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱荧光寿命荧光寿命荧光寿命荧光寿命 是荧光强度衰减为初始时的是荧光强度衰减为初始时的1/e1/e所需要的时间，所需要的时间，常用常用 表示。表示。如荧光强度的衰减符合指数衰减的规律如荧光强度的衰减符合指数衰减的规律:I It t I I0 0e e-kt-kt 其中其中I I0 0是激发时最大荧光强度，是激发时最大荧光强度，I It t是时间是时间t t时的荧光强度，时的荧光强度，k k是衰减常是衰减常数。假定在时间数。假定在时间 时测得的时测得的I It t为为I I0 0的的1/e1/e，则，则 是
20、我们定义的是我们定义的荧光寿命荧光寿命。寿命寿命 是衰减常数是衰减常数k k的倒数。事实上，在瞬间激发后的某个时间，荧光强度的倒数。事实上，在瞬间激发后的某个时间，荧光强度达到最大值，然后荧光强度将按指数规律下降。从最大荧光强度值后任一达到最大值，然后荧光强度将按指数规律下降。从最大荧光强度值后任一强度值下降到其强度值下降到其1/e1/e所需的时间都应等于所需的时间都应等于。荧光寿命荧光寿命如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光如果激发态分子只以发射荧光的方式丢失能量，则荧光寿命与荧光发射速率的衰减常数成反比。寿命与荧光发射速率的衰减常数成反比。荧光寿命荧光寿命因此有因此有 F F
21、1/K1/KF F F F表示表示荧光分子的固有荧光寿命荧光分子的固有荧光寿命，k kF F表示表示荧光发射速率的衰减常数荧光发射速率的衰减常数。荧光发射速率荧光发射速率即为单位时间中发射的光子数。即为单位时间中发射的光子数。处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一处于激发态的分子，除了通过发射荧光回到基态以外，还会通过一些其它过程些其它过程(如淬灭和能量转移如淬灭和能量转移)回到基态，其结果是加快了激发态回到基态，其结果是加快了激发态分子回到基态的过程分子回到基态的过程(或称失活过程或称失活过程)，结果是荧光寿命降低。，结果是荧光寿命降低。寿命寿命 和这些过程的速率常数有关
22、，总的失活过程的速率常数和这些过程的速率常数有关，总的失活过程的速率常数k k可以可以用各种失活过程的速率常数之和来表示用各种失活过程的速率常数之和来表示:k k k kF F+k ki ik ki i表示各种非辐射过程的衰减速率常数。表示各种非辐射过程的衰减速率常数。则总的则总的寿命寿命 为为:1/k1/k 1/(k1/(kF F+k ki i)荧光寿命荧光寿命由于吸收几率与发射几率有关，由于吸收几率与发射几率有关，F F与与最大吸收位置的摩尔消光系数最大吸收位置的摩尔消光系数 maxmax(单位为单位为cmcm2 2molmol-1-1或或 (mol(mol dmdm-3-3)-1-1cm
23、cm-1-1)也密切相关。也密切相关。从下式可以得到从下式可以得到 F F的粗略估计值的粗略估计值(单位为秒单位为秒)。1/1/F F10104 4 maxmax注意注意：在讨论寿命时，不要把在讨论寿命时，不要把寿命寿命与与跃迁时间跃迁时间混淆起来。跃迁时间是跃迁混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数，而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。频率的倒数，而寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。通过测量寿命，可以得到有关分子结构和动力学方面的信息。通过测量寿命，可以得到有关分子结构和动力学方面的信息。荧光寿命荧光寿命,2009(131):13572-13573大多数有机分子的基态处于单重态；过渡
24、金属配合物很多能实现较强的红外波段宽带发射，可以有效避开组织体的吸收，可以穿透组织体实现红外成像，克服同位素原子示踪对人体的伤害；稀土金属-有机配合物（MOF）的发光机理可测量约60多种元素。缺点：应用范围小。M=2S+1改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。可用于研究大分子物质的性质和行为。稀土金属-有机配合物（MOF）的发光机理基质敏化的稀土离子发光降低体系温度可以提高荧光量子产率。金属-有机配合物（MOF）发光的影响因素带通滤光片、截止滤光片、分光滤光片、中性密度滤光片、反射滤光片；量子点探针较传统的有机荧光染料具有一定的优越性：它吸收光子发生多重性不变的跃迁时所吸收的能量小于断
25、裂其最弱的化学键所需要的能量。缺点：f-f禁阻，强度低=sIscs/(Isc)S1+S1T1+T1(T1T1)S0+S1S0+S0+hp跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速率发生振动弛豫（其速率在1013/s数量级），散失部分能量，达到零振动能级，一般从零振动能级发射荧光；时，此分子被称为处于基态。延迟荧光延迟荧光一般荧光寿命为一般荧光寿命为1010-8-8s s，最长可达，最长可达1010-6-6s s。但有时却可能。但有时却可能观察到长达观察到长达1010-3-3s s。这种长寿命的延时发射的荧光，被称。这种长寿命的延时发射的荧光，被称为为延迟荧光延迟荧光或缓发荧光。或缓发荧
26、光。延迟荧光与普通荧光的区别主要在于延迟荧光与普通荧光的区别主要在于辐射寿命不同辐射寿命不同。这种长寿命。这种长寿命的延迟荧光来源于从第一激发三重态（的延迟荧光来源于从第一激发三重态（T T1 1）重新生成的）重新生成的S S1 1态的辐射跃态的辐射跃迁。即延迟荧光产生的过程为：迁。即延迟荧光产生的过程为：S1T1S1S0+hf延迟荧光延迟荧光E E型延迟荧光型延迟荧光：当第一激发单重态当第一激发单重态S S1 1与第一激发三重态与第一激发三重态T T1 1能差较小时，能差较小时，T T1 1态有时可从态有时可从环境获取一定的热能后又达到能量更高的环境获取一定的热能后又达到能量更高的S S1
27、1态。即态。即T1S1这种现象首先从四溴荧光素（这种现象首先从四溴荧光素（eosin）观察到，故得名）观察到，故得名E型延迟荧光型延迟荧光。P P型延迟荧光型延迟荧光：当单重态（当单重态（S S1 1）与三重态（）与三重态（T T1 1）能差较大时，）能差较大时，T T1 1不可能靠从环境取不可能靠从环境取得热能而到达得热能而到达S S1 1态。这时有可能在两个三重态分子靠近时，通过两态。这时有可能在两个三重态分子靠近时，通过两个三重态分子的湮灭过程重新生成个三重态分子的湮灭过程重新生成S S1 1态。即态。即S1+S1T1+T1(T1T1)S0+S1S0+S0+hp这种现象首先从芘（这种现象
28、首先从芘（pyrene）和菲（）和菲（phenanthrence）观察到，故得名）观察到，故得名P型延迟荧光型延迟荧光。荧光荧光量子产率量子产率是物质荧光特性中最基本的参数之一，它表示物质发是物质荧光特性中最基本的参数之一，它表示物质发射荧光的效率。射荧光的效率。量子产率量子产率荧光量子产率通常用荧光量子产率通常用 来表示，定义为来表示，定义为荧光发射量子数荧光发射量子数与与被物质吸收被物质吸收的光子数的光子数之比，也可表示为之比，也可表示为荧光发射强度荧光发射强度与与被吸收的光强被吸收的光强之比，或表之比，或表示为示为荧光发射速率荧光发射速率与与吸收光速率常数吸收光速率常数之比，即：之比，即
29、：=荧光发射量子数荧光发射量子数/吸收的光子数吸收的光子数 =k=kf fSS1 1/吸光速率吸光速率 =I=If f/I/Ia a 量子产率量子产率一般情况下，荧光一般情况下，荧光量子产率量子产率（)不随激发光波长而改变，这被称为不随激发光波长而改变，这被称为Kasha-VavilovKasha-Vavilov规则规则。但如果形成的激发态会导致化学反应或系间窜越。但如果形成的激发态会导致化学反应或系间窜越与内转换的竞争，则可能使与内转换的竞争，则可能使 受到影响。例如，在低压气相以受到影响。例如，在低压气相以254 nm的光激发苯，的光激发苯，=0.4，而当以小于，而当以小于240 nm的光
30、激发苯时，则未检测的光激发苯时，则未检测到荧光。这是由于苯的高振动能级的到荧光。这是由于苯的高振动能级的S1态会使其转变为杜瓦苯。不同态会使其转变为杜瓦苯。不同化合物的化合物的 差别可以很大。差别可以很大。另外，另外，还会受环境（如温度、溶剂等）的影响，例如，降低温度可还会受环境（如温度、溶剂等）的影响，例如，降低温度可导致一个化合物的导致一个化合物的 增大，提高温度可导致一个化合物的增大，提高温度可导致一个化合物的 降低。降低。量子产率量子产率由于荧光的非单色性、各向的不均匀性和二级发射等原因，荧光量由于荧光的非单色性、各向的不均匀性和二级发射等原因，荧光量子产率的直接测定的重复性往往较差。
31、因此，实际测量中大多采用的子产率的直接测定的重复性往往较差。因此，实际测量中大多采用的是是相对法相对法，即用一已知其荧光量子产率的参比化合物在相同条件下对，即用一已知其荧光量子产率的参比化合物在相同条件下对照测定，并可通过公式计算目标化合物的荧光量子产率：照测定，并可通过公式计算目标化合物的荧光量子产率：=sIscs/(Isc)s、s、cs和和Is分别是参照物的荧光量子产率（已知）、摩尔消光系数、溶分别是参照物的荧光量子产率（已知）、摩尔消光系数、溶液浓度和荧光强度；液浓度和荧光强度；、c和和I分别是被测物的荧光量子产率（未知）、摩分别是被测物的荧光量子产率（未知）、摩尔消光系数、溶液浓度和荧
32、光强度。尔消光系数、溶液浓度和荧光强度。参照物应是参照物应是 已知已知、无自吸收无自吸收、无浓度猝灭无浓度猝灭、在被测物所用溶剂中可溶在被测物所用溶剂中可溶、易易纯化纯化、稳定稳定和和对杂质不敏感对杂质不敏感的物质。常用的参照物如罗丹明的物质。常用的参照物如罗丹明B和喹啉硫酸氢盐和喹啉硫酸氢盐等。等。荧光产生的条件荧光产生的条件化合物能够产生荧光的必要条件是：化合物能够产生荧光的必要条件是：它它吸收光子发生多重性不变的跃迁时所吸收的能量小吸收光子发生多重性不变的跃迁时所吸收的能量小于断裂其最弱的化学键所需要的能量于断裂其最弱的化学键所需要的能量。另外，化合物要能发生荧光，其结构中必须有另外，化
33、合物要能发生荧光，其结构中必须有荧光基团荧光基团。荧光基团都是荧光基团都是含有不饱和键含有不饱和键的基团，当这些基团是分子的的基团，当这些基团是分子的共轭体系的一部分时，则该化合物可能产生荧光。共轭体系的一部分时，则该化合物可能产生荧光。影响荧光的主要因素影响荧光的主要因素1.1.荧光助色团与荧光消色团：荧光助色团与荧光消色团：可使化合物荧光增强的基团被称为可使化合物荧光增强的基团被称为荧光助色团荧光助色团。一般。一般为为给电子取代基给电子取代基，如，如-NH-NH2 2、-OH-OH等。相反，等。相反，吸电子基团吸电子基团如如-COOH-COOH、-CN-CN等将减弱或抑制荧光的产生，被称为
34、等将减弱或抑制荧光的产生，被称为荧荧光消色团光消色团。影响荧光的主要因素影响荧光的主要因素增加共平面的稠合环的数目，特别是当稠合环以线型排列时，将增加共平面的稠合环的数目，特别是当稠合环以线型排列时，将有利于体系内有利于体系内 电子的流动，从而使体系发生跃迁所需吸收的能量电子的流动，从而使体系发生跃迁所需吸收的能量降低，进而有利于荧光的产生。降低，进而有利于荧光的产生。2.2.增加稠合环可增强荧光：增加稠合环可增强荧光：刚性增强后，将减弱分子的振动，从而使分子的激发能不易因振刚性增强后，将减弱分子的振动，从而使分子的激发能不易因振动而以热能形式释放；另外，分子刚性的增加常有利于增加分子动而以热
35、能形式释放；另外，分子刚性的增加常有利于增加分子的共平面，从而有利于增大分子内的共平面，从而有利于增大分子内 电子的流动性，也就有利于荧电子的流动性，也就有利于荧光的产生。光的产生。3.3.提高分子的刚性可增强荧光：提高分子的刚性可增强荧光：影响荧光的主要因素影响荧光的主要因素根据电子跃迁规则，根据电子跃迁规则，S S1 1态的电子组态是（态的电子组态是（，*）态时，有利于荧）态时，有利于荧光的产生，当光的产生，当S S1 1态的电子组态是（态的电子组态是（n n，*）态时，不利于荧光的产）态时，不利于荧光的产生。生。4.4.激发态电子组态的影响：激发态电子组态的影响：重原子具有增强系间窜越的
36、作用，将增大从重原子具有增强系间窜越的作用，将增大从S S1 1态向态向T T1 1态的系间窜态的系间窜越的速率常数和量子产率，从而导致降低荧光量子产率。越的速率常数和量子产率，从而导致降低荧光量子产率。5.5.重原子将导致荧光量子产率的降低：重原子将导致荧光量子产率的降低：通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。研究较多的有CdSe、CdTe、ZnS 等。分子失活的途径有哪些？Hong,et al.内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；根据吸收谱中感兴趣的峰确定激发波长，选择合适的发射谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描
37、速度等进行发射谱的扫描。金属-有机配合物发光机理示意图ki表示各种非辐射过程的衰减速率常数。比如红外截止滤光片，IBG-650。改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行。Bauer,et al.金属-有机配合物（MOF）发光的影响因素增加溶剂的极性，一般有利于荧光的产生。如果光路狭缝太大，荧光信号太强，容易超出仪器检测范围，损伤仪器；荧光发射速率即为单位时间中发射的光子数。既没发生斯托克位移也没发生反斯托克位移的荧光称共振荧光。荧光光谱仪的原理、操作及数据处理提高分子的刚性可增强荧光：稀土离子是一类核酸探针的检测试剂。荧光是辐射跃迁的一种，是物质从激发态失活到多重性相同的低能状态时所释放的
38、辐射。缺点：f-f禁阻，强度低影响荧光的主要因素影响荧光的主要因素增加溶剂的极性，一般有利于荧光的产生。增加溶剂的极性，一般有利于荧光的产生。6.6.溶剂极性的影响：溶剂极性的影响：降低体系温度可以提高荧光量子产率。降低体系温度可以提高荧光量子产率。7.7.温度的影响：温度的影响：如氢键、吸附、溶剂粘度增加等均可提高荧光的量子产率，这都如氢键、吸附、溶剂粘度增加等均可提高荧光的量子产率，这都可用减少了分子的热振动和增加了分子的刚性来解释。可用减少了分子的热振动和增加了分子的刚性来解释。8.8.其它影响因素：其它影响因素：荧光光谱仪的原理、操作及数据处理荧光光谱仪的原理、操作及数据处理在实验样品
39、受到激发的在实验样品受到激发的情况下，通过选择合适情况下，通过选择合适的探测器和工作模式，的探测器和工作模式，记录下发射光强与激发记录下发射光强与激发源特性、样品特性以及源特性、样品特性以及温度、时间、空间、能温度、时间、空间、能量等相关特性之间的关量等相关特性之间的关系，以此来更好的研究系，以此来更好的研究或利用发光过程。或利用发光过程。荧光光谱仪的基本原理荧光光谱仪的基本原理4005006007000501001505D07F35D07F15D07F2 Intensity(a.u.)Wavelength(nm)ExcitationEmissionsite Bsite A7F05D2VBCB
40、(a)(b)样品准备样品准备块状固体块状固体 为了获取尽可能理想的光谱，减小内外表面因素的干扰，最好为了获取尽可能理想的光谱，减小内外表面因素的干扰，最好切切成规则形状，并进行抛光成规则形状，并进行抛光。2.2.如果要做系列样品特性的对比，应尽量在如果要做系列样品特性的对比，应尽量在尺寸和光洁度尺寸和光洁度上将其制为上将其制为同一规格同一规格。4.4.对于与各项异性有关的测试，务必要注意对于与各项异性有关的测试，务必要注意光轴（或光轴（或 x,y,z x,y,z 轴）的轴）的位置位置。5.5.对于有对于有自吸收自吸收特性的样品要注意其对测试结果的影响。特性的样品要注意其对测试结果的影响。样品准
41、备样品准备粉体和微晶粉体和微晶 避免混入诸如滤纸纤维、胶水等杂质避免混入诸如滤纸纤维、胶水等杂质，以免其发光对测试结果产生，以免其发光对测试结果产生影响。影响。2.2.样品应尽量保存在样品应尽量保存在不会引入杂质又防潮避光不会引入杂质又防潮避光的样品管（盒）中。的样品管（盒）中。3.3.对于强光下不稳定的化合物，测试时应特别注意对于强光下不稳定的化合物，测试时应特别注意控制入射光的强度控制入射光的强度，避免破坏样品。避免破坏样品。4.4.粉体和微晶样品一般夹在粉体和微晶样品一般夹在石英玻璃片石英玻璃片进行测试。进行测试。液体液体样品准备样品准备1.1.溶液样品尽量使用溶液样品尽量使用透明的玻璃
42、化溶液透明的玻璃化溶液，避免在这种汇聚式光路中，避免在这种汇聚式光路中由于比色皿中溶液的前后吸收不均导致的光谱失真问题。由于比色皿中溶液的前后吸收不均导致的光谱失真问题。2.2.为安全起见，对于使用挥为安全起见，对于使用挥发性剧毒溶剂发性剧毒溶剂的测试，一定要有合适的的测试，一定要有合适的防护防护。3.3.易挥发、易变质易挥发、易变质的溶液最好的溶液最好现配现测现配现测。4.4.液体样品一般放在液体样品一般放在带盖石英比色皿带盖石英比色皿（与紫外测试所用比色皿不同，（与紫外测试所用比色皿不同，为侧面全透明型）中进行测试。为侧面全透明型）中进行测试。测试准备测试准备 由于物质的发射特性和吸收特性
43、是紧密相关的，所以提前做好由于物质的发射特性和吸收特性是紧密相关的，所以提前做好吸收谱可以有效缩短荧光测试的摸索时间。吸收谱可以有效缩短荧光测试的摸索时间。对于不知道相关特性的样品，吸收谱的测试比荧光光谱的测试对于不知道相关特性的样品，吸收谱的测试比荧光光谱的测试要容易很多。要容易很多。所以，建议大家所以，建议大家先测一下样品的吸收谱，并从中找出感兴先测一下样品的吸收谱，并从中找出感兴趣的吸收峰和特性趣的吸收峰和特性，在荧光测试时以便参考。，在荧光测试时以便参考。光谱测试光谱测试 开机开机 电源电源灯源灯源2.2.发射谱发射谱 根据吸收谱中感兴趣的峰确定激发波长，选择合适的发射谱波长根据吸收谱
44、中感兴趣的峰确定激发波长，选择合适的发射谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行发射谱的扫描。范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行发射谱的扫描。3.3.激发谱激发谱 根据发射谱中感兴趣的峰确定发射波长，选择合适的激发谱波长根据发射谱中感兴趣的峰确定发射波长，选择合适的激发谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行激发谱的扫描。范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行激发谱的扫描。4.4.发射谱发射谱 根据激发谱中感兴趣的峰确定激发波长，选择合适的发射谱波长根据激发谱中感兴趣的峰确定激发波长，选择合适的发射谱波长范围、滤光片、光路狭缝、扫描速度等进行发射谱的扫描。范围、滤光片、光路狭缝、扫
45、描速度等进行发射谱的扫描。5.5.重复重复3 3、4 4步循环扫描得到理想的光谱图。步循环扫描得到理想的光谱图。7.7.关机关机 光源光源电源电源6.6.保存数据保存数据光谱测试光谱测试电子跃迁到不同激发态能级时，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如2)。从最大荧光强度值后任一强度值下降到其1/e所需的时间都应等于。既没发生斯托克位移也没发生反斯托克位移的荧光称共振荧光。荧光基团都是含有不饱和键的基团，当这些基团是分子的共轭体系的一部分时，则该化合物可能产生荧光。3 I0 l c =Kc激发谱扫描过程中
46、，通常选择比发射波长短，比激发谱最长波长长的长波通型截止滤光片。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；金属-金属到配体的电荷转移（MMLCT）等激发波长一定要小于发射波长。相反，吸电子基团如-COOH、-CN等将减弱或抑制荧光的产生，被称为荧光消色团。很多过渡金属与配体配合时能形成新的能级结构（HOMO/LUMO），基态与这些能级的跃迁较容易导致量子产率相对于配体的显著增强，同时可以通过改变配位中心或配体结构在很宽的波段内调控其发射波段。金属-有机配合物（MOF）发光的影响因素F表示荧光分子的固有荧光寿命，kF表示荧光发射速率的衰减常数。首先，荧光光谱范
47、围宽，通过改变纳米晶体材料和尺寸，获得的激光诱导荧光光谱范围在400nm2m；研究较多的有CdSe、CdTe、ZnS 等。稀土金属-有机配合物（MOF）的发光机理一个化合物的发射光谱常常与其吸收光谱很类似，但总是较相应的吸收光谱红移，这称为斯托克位移（Stokes shift）。这是由于高温使更多的激发态分子处于高振动能级，荧光主要从激发态的高振动能级发出所致。金属-有机配合物（MOF）发光的影响因素金属-有机配合物（MOF）发光的影响因素金属-有机配合物（MOF）发光的影响因素滤光片的选择滤光片的选择1.1.按光谱波段分：按光谱波段分：紫外滤光片、可见滤光片、红外滤光片；紫外滤光片、可见滤光
48、片、红外滤光片；2.2.按光谱特性分：按光谱特性分：带通滤光片、截止滤光片、分光滤光片、中性密度滤光片、带通滤光片、截止滤光片、分光滤光片、中性密度滤光片、反射滤光片；反射滤光片；带通型：带通型：选定波段的光通过，通带以外的光截止。选定波段的光通过，通带以外的光截止。短波通型短波通型(又叫低波通又叫低波通)：短于选定波长的光通过，长于该：短于选定波长的光通过，长于该波长的光截止。波长的光截止。比如红外截止滤光片，比如红外截止滤光片，IBG-650IBG-650。长波通型长波通型(又叫高波通又叫高波通)：长于选定波长的光通过，短于该：长于选定波长的光通过，短于该波长的光截止波长的光截止 比如红外
49、透过滤光片，比如红外透过滤光片，IPG-800.IPG-800.滤光片的分类滤光片的分类滤光片的选择滤光片的选择为了消除剩余入射光对荧光光谱产生影响，我们通常要选择合为了消除剩余入射光对荧光光谱产生影响，我们通常要选择合适的适的长波通型截止滤光片长波通型截止滤光片。激发波长一定要小于发射波长激发波长一定要小于发射波长。发射谱发射谱扫描过程中，通常选择扫描过程中，通常选择比激发波长长，比发射谱最短波比激发波长长，比发射谱最短波长短长短的长波通型截止滤光片。的长波通型截止滤光片。激发谱激发谱扫描过程中，通常选择扫描过程中，通常选择比发射波长短，比激发谱最长波比发射波长短，比激发谱最长波长长长长的长
50、波通型截止滤光片。的长波通型截止滤光片。光路狭缝和扫描速度的选择光路狭缝和扫描速度的选择如果光路狭缝太大，荧光信号太强，容易超出仪器检测范围，如果光路狭缝太大，荧光信号太强，容易超出仪器检测范围，损伤仪器；如果狭缝开的太小，荧光信号又太弱，检测比较困损伤仪器；如果狭缝开的太小，荧光信号又太弱，检测比较困难，所以要选择大小合适的狭缝。难，所以要选择大小合适的狭缝。如果扫描太快，容易跳峰，忽略特征性的峰信号；扫描太慢则如果扫描太快，容易跳峰，忽略特征性的峰信号；扫描太慢则浪费时间。所以只要能扫描得到平滑的光谱曲线就可以了。浪费时间。所以只要能扫描得到平滑的光谱曲线就可以了。光谱数据处理光谱数据处理
