1、第二讲 基因工程制药郑文云基因工程药物种类蛋白细胞因子药物蛋白类激素溶血栓药物治疗用酶可溶性受体和黏附分子其它核酸DNA药物反义RNA药物RNAi药物核酶第二讲 基因工程制药第二讲 基因工程制药第一节 概述第二节 基因药物生产的基本过程第三节 目的基因的获得及表达载体的构建第四节 基因表达第五节 基因工程菌的稳定性第六节 基因工程菌生长代谢的特点第七节 基因工程菌发酵第八节 基因工程药物的分离纯化第九节 基因工程药物的质量控制第十节 基因工程药物制造实例第一节 概述生物技术的核心就是基因工程，基因工程技术最成功的应用就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格
2、等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感感染染等问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物。基因工程技术可十分方便且有效地解决上述提到的问题，显示其在生物技术药物制备上的优势，使得生物药物从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断已可通过基因工程技术获得。利用基因工程技术生产药品的优点：（1）可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用提供有效的保障；（2）可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这
3、些物质的应用范围；（3）利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；利用基因工程技术生产药品的优点：（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除。如白细胞介素-2的第125位半胱氨酸是游离的，有可能引起-S-S-键的错配而导致活性下降，如将此半胱氨酸改为丝氨酸或丙氨酸，白细胞介素-2的活性以及热稳定性均有提高；（5）利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。基因工程技术可将不同种类和用途的基因，在原核细胞中表达的特性使其不仅在医药，而且在很多行业中都会有重要的应用。利用微生物、真核细胞生产基因药物促红细胞生成素(
4、EPO）乙肝疫苗人生长激素(HuGH)干扰素细胞集落刺激因子CSF 溶栓剂人胰岛素等利用转基因动物生产基因药物转基因鼠生产人生长激素转基因绵羊生产抗胰蛋白酶转基因山羊生产长效tPA（溶栓剂）转基因奶牛人的EPO转基因家禽产下防流感鸡蛋转基因植物生产基因药物转神经肽烟草 乙肝疫苗的西红柿含霍乱疫苗的香蕉 含麻疹疫苗的莴苣转基因植物基因工程药物的优缺点生产过程简便便于运输存储直接食用、不需要特殊加工表达量低免疫原性差基因逃逸的危险有口服耐受性第二节 基因工程药物生产的基本过程基因工程技术就是将目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建工程菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程
5、菌内进行复制和表达的技术。基因工程药物制造的主要程序是：目的基因的克隆，构建DNA重组体，将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌，工程菌的发酵，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验等。以上程序中的每个阶段都包含若干细致的步骤，这些程序和步骤将会随研究和生产条件的不同而改变。获得目的基因获得目的基因组建重组质粒组建重组质粒培养工程菌培养工程菌构建基因工程构建基因工程菌或细胞菌或细胞产物分离纯化产物分离纯化除菌过滤除菌过滤半成品检定半成品检定包装包装成品检定成品检定基因工程药物制备的一般过程基因工程药物制备的一般过程基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段：
6、上游阶段上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。此阶段的工作主要在实验室内完成。下游阶段下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。基因工程药物生产的基本过程基因工程药物生产的基本过程基因工程药物的上游技术：基因工
7、程药物的上游技术：1 1、基因制备技术：制备纯净、高质量的、基因制备技术：制备纯净、高质量的 载体载体DNADNA和待克和待克隆的隆的 核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。分子克隆操作。2 2、基因克隆载体、基因克隆载体:质粒载体质粒载体 3 3、重组、重组DNADNA技术的有关工具酶及其应用技术的有关工具酶及其应用基因工程的操作流程（1）获得目的基因和载体（2）切割、连接形成新的重组DNA分子（3）重组DNA分子导入受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传（4）对转化子筛选和鉴定（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得
8、所需的遗传性状或表达出所需要的产物基因制药下游程序下游阶段在产业化中是极其重要的下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。工程菌的发酵工艺不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于目的基因高效表达的发酵工艺，同时建立一系列相应的分离纯化、质量控制、产品保存等技术。第三节基因工程制药基本实验 所设计的实验技术：1。聚合酶链式反应（PCR）2。反转录P
9、CR3。DNA的化学合成，4。RE酶切反应5。连接酶的链接反应6。载体转化入宿主细胞技术7。转化子筛选技术一、目的基因的获得目的基因的获得需要根据目的基因的来源采取适当的方法。对于真核细胞来源的目的基因，是不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因仅是染色体DNA中的很小一部分，即使多拷贝基因也是极少的，因此从染色体中分离纯化目的基因是很困难的。另外，真核基因的内含子及基因的转录后修饰和编辑过程，。获得需要的目的基因常用的方法：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因文库(gene library)，从中调用目的基因（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段（3）利用聚合酶链式反应（P
10、CR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等（4）化学合成法 聚合酶链式反应（PCR）lPCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术l 加入4种物质：（1）作为模板的DNA序列（2）与被分离的目的基因两条链各自5端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）（3）TaqDNA聚合酶（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）l 加入4种物质：（1）作为模板的DNA序列（2）与被分离的目的基因两条链各自5端序列相互补的DNA引物（20个左右碱基的短DNA单链）（3）TaqDNA聚合酶（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）
11、聚合酶链式反应（PCR）二、逆转录法逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。为了克隆编码某种特异蛋白质多肽的DNA序列，可从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA（cDNA第一链），再以cDNA第一链为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶I（或者Klenow大片段）作用下，最终合成编码该多肽的双链DNA序列。cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。1、mRNA的纯化2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA克隆5、将重组体导入宿主细胞6、cDNA文库的鉴
12、定7、目的cDNA克隆的分离和鉴定二、逆转录法过程 三、化学合成法较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。方法方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，5060bp；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变；三是费用较高。四、构建重组
13、质粒和基因克隆四、构建重组质粒和基因克隆l基因重组和克隆操作最重要的工具是限制性内切酶、载体和宿主菌。1、限制性内切酶限制性内切酶DNA操作的分子手术刀限制性内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶，可以识别一小段特殊的核酸序列并将其在特定位点处切开。u Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开创性的工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。限制性核酸内切酶分类和命名分类：即、型酶主要特性型型型1、限制和修饰作用单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶具有一种共同亚基的双功能酶2、限制酶的蛋白结构3种不同的酶单一的成分2种不同的亚基3、限制作用所需辅助因子ATP、mg2+、S
14、-腺苷甲硫氨酸mg2+ATP、mg2+（S-腺苷甲硫氨酸）4、切割位点可能随机切割位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3端2426bp5、序列特异性的切割不是是是6、在DNA克隆中的用处无用非常有用有用II型限制性核酸内切酶的基本特性（1）在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子形成链的断裂；（2）2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；（3）断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端，但平末端例外。绝大多数的II型限制酶都能识别由4、5、6或7个核苷酸组成的特定核苷酸序列。该序列称为识别序列。2、DNA连接酶和DNA分子的体外连接可以用来
15、在体外连接DNA片段：第一种是用DNA连接酶：连接具有粘性末端的DNA 片段；第二种方法是用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段加上Poly（dA）-Poly(dT)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；第三种是，先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶连接。3、其它工具酶（1）大肠杆菌DNA聚合酶I（E.Coli DNA Pol I）DNA聚合酶I由两种亚基组成，带有3种酶活性。它的大亚基相对分子量为7900，带有聚合活性和3外切核酸酶活性，小亚基只有5外切核酸酶的活性。其它工具酶（2）DNA聚合酶I大片段（klenow酶）klenow酶的相对分
16、子量为7600。是经过Subtillisin（枯草杆菌）蛋白酶或胰蛋白酶分解DNA聚合酶，切除小亚基，只保留大亚基部分。所以这种酶具有DNA聚合酶的活性和3外切酶的活性，但是没有5外切核酸酶活性。其它工具酶（3）T4DNA连接酶此酶是从噬菌体T4感染的E.coli中分离的，和klenow大片段一样，具有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性。其外切酶活性比E.coli DNA聚合酶I的活性高200倍，此外，T4聚合酶有第三种活力取代反应。其它工具酶（4）逆转录酶这是一种有效的转录RNA为DNA的酶。又称为依赖RNA的DNA聚合酶。其产物DNA又称为cDNA，即互补DNA。最普遍使用的是来源于鸟类骨
17、髓母细胞瘤病毒（AMV）的逆转录酶，由和两条亚基组成，其相对分子质量分别为65000和95000，这种酶具有聚合酶活性和外切割酶活性。（外切活性：如从DNA-RNA杂交链中特异性地降解RNA链，进而保留新合成的DNA链。其它工具酶（5）末端脱氧核苷酰转移酶从小牛胸腺或髓细胞中分离得到的，它催化DNA片段上的3-OH端加接脱氧核苷酸。合成的方向是从底物的5端向3端进行。（6）核酸酶S1是从半曲霉菌中分离得到，可以降解单链DNA和RNA，产生5磷酸化单核苷酸或寡聚核苷酸。又称单链特异的核酸酶。其它工具酶（7）核酸酶BAL31从乳白短杆菌细胞中分离的。它能以渐进的方式从线型DNA分子的3、5两边同时
18、降解，形成小的寡聚核苷酸片段或单核苷酸。在基因工程中可被用于组建DNA的物理图谱以及造成克隆DNA分子的末端缺失。其它工具酶（8）外切核酸酶III从大肠杆菌中分离得到，功能是将带有3-OH末端的双链DNA从3到5端方向切除，产生5单核苷酸。此外该酶还带有内切核酸酶活性、RNaseH活性和3磷酸酶活性。在基因工程中制备单链DNA，以便用作DNA聚合酶反应的DNA模板；在基因工程中制备对DNA有特异性的探针。其它工具酶（9）T4多聚核苷酸激酶此酶能将ATP上的位磷酸转移到DNA或RNA的5-OH上，酶作用底物是 单链或双链带有5-OH末端的DNA或RNA。其它工具酶（10）碱性磷酸酶从细菌中分离得
19、到的碱性磷酸酶称为BAP酶，从小牛内脏中分离制备的酶称为CAP酶。该酶的功能是以单链或双链DNA、RNA为基质，将DNA或RNA片段5端的磷酸切除。其它工具酶（11）甲基化酶大部分大肠杆菌菌株中含有两种与DNA甲基化作用有关的酶，有dam甲基化酶和dcm甲基化酶。4 4、载体载体克隆载体克隆载体 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、噬菌体等。具，目前最常用的载体包括细菌质粒、噬菌体等。质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状自主复制的一段环状DNADNA分子。进入到宿
20、主细胞分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。基因工程中所用的载体，主要有基因工程中所用的载体，主要有5类：类：a、质粒，、质粒，主要指人工构建的质粒；主要指人工构建的质粒；b、噬菌体、噬菌体的衍生物；的衍生物；c、cosmid；d、单链、单链DNA噬菌体噬菌体M13；e、动物病毒。、动物病毒。载体的本质是载体的本质是DNA（少数为（少数为RNA）质粒细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体之外的一种遗传成分，它是由环形双链的DNA组成的复制子。除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid）是一种RNA质粒外，迄今已知的所有质粒否是这种类型
21、的DNA分子质粒命名一般为小写p代表质粒，后接两个大写字母代表发现者或实验室，数字代表编号。质粒以三种形式存在：超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋。环形质粒分子环形染色体DNA大肠杆菌细胞可移动质粒控制质粒DNA转移的基因抗菌素抗性基因（1）载体能独立地进行复制：分严紧型和松弛型，前者在宿主细胞中拷贝数仅13个，后者在宿主细胞中拷贝数可高达3000个。（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选，且克隆位点位于启动子序列后，以便外源基因表达。载体必须具备的条件表达载体必须具备的条件（3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA酶所识别。（4）应具有阻遏子，使启动子受
22、到控制，只有当诱导时才进行转录。阻遏子的阻遏作用可以由物理（如温度）、化学（如IPTG、IAA等）因素进行调节，因而可人为地选择启动子启始转录mRNA的时机，以获得外源蛋白质表达合成的最佳时机。外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。表达载体必须具备的条件（5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时，很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。诱导表达时，由于强启动子所致的高水平转录反过来还会影响质粒DNA本身的复制，从而引起质粒的不稳定或脱质粒现象，因此表达载体需在外源基因的下游安置一个强转录终止
23、子，以克服由质粒转录引进的质粒不稳定。表达载体必须具备的条件（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列（Shine-Dalgarno sequence），以便转录后能顺利翻译。两个基因工程药物研究中常用的表达载体：pBV220系统和pET系统。pBV220系统系统 中国预防医学科学院病毒学研究中国预防医学科学院病毒学研究所构建。已成功的用于表达所构建。已成功的用于表达 IL-2/3/4/6/8、TFN、TNF、TNF、G-CSF、GM-CSF等细胞因子等细胞因子。质粒质粒DNADNA制备方法制备方法 1 1）用碱抽提法分离质粒）用碱抽提法分离质粒DNADNA原理：
24、细胞原理：细胞pH12.0-12.6线状线状DNA变性，变性，cccDNA不变性，不变性，加酸恢复加酸恢复pH到中性，变性的染色体到中性，变性的染色体DNA交织成网而沉交织成网而沉淀，上清用酚处理使蛋白变性，用醇沉淀质粒淀，上清用酚处理使蛋白变性，用醇沉淀质粒DNA。A）质粒）质粒DNA的小量制备的小量制备 B）质粒）质粒DNA的大量制备的大量制备 小量制备大量制备挑单菌落接种在2ml含抗菌素的 LB中，过夜将1ml培养物用0.5ml 水和Solution I 100ul 悬浮Solution II 200ul冰浴裂解Solution III 150ul恢复pH 酚/氯仿抽提 乙醇沉淀DNA用
25、10ml过夜培养物接种500ml含抗菌素的 LB,37,振荡，使OD600为0.81.0。离心回收菌体，用50ml 水和Solution I 10ml 悬浮，加溶菌酶Solution II 20ml 冰浴裂解Solution III 15ml恢复pH 上清加0.6倍异丙醇，得沉淀 70乙醇洗DNA 酚/氯仿抽提 乙醇沉淀DNA2）染色体DNA的制备3）真核细胞RNA的制备4)DNA的凝胶(Agarose)电泳和 凝胶中DNA的 回收5)SDS-PAGE电泳和 凝胶中DNA的 回收 心 肝 脾 肺 肾 胃 脑 大肠睾丸 心 肝 脾 肺 肾 胃 脑 大肠卵巢（三）（三）转化受体细胞和转化子的筛选转
26、化受体细胞和转化子的筛选细菌：细菌：类似于前面所讲，由质粒携带目的类似于前面所讲，由质粒携带目的基因，转入相应的细菌细胞内并进行表达。基因，转入相应的细菌细胞内并进行表达。植物和动物：植物和动物：农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化 基因枪法基因枪法 微注射法微注射法 l转化的方法转化的方法-随宿主细胞的不同而不同随宿主细胞的不同而不同第十节 基因工程药物制造示例Discovery of insulin Banting&Best-extracted insulin from dogs&proved that it controls symptoms of diabetes in dogs 1921
27、1st patient to receive pancreatic extract-14-yr old Leonard Thompson.First patient to benefit from insulin saved from death.由於首次在人以胰島素成功地由於首次在人以胰島素成功地控制糖尿病控制糖尿病1923 1923 諾貝爾獎頒給諾貝爾獎頒給Banting Banting 與與 Macleod Macleod。1955 Frederick Sanger 1955 Frederick Sanger 闡明闡明胰島素結構胰島素結構 (A(A鍊鍊21 a.a.21 a.a.與與B
28、B 鍊鍊 30 a.a.)30 a.a.)，19581958因此獲得諾因此獲得諾貝爾獎。貝爾獎。1959 Solomon Beson 1959 Solomon Beson 與與 Rosalyn YalowRosalyn Yalow開發出免疫測定開發出免疫測定技術技術(immunoassay technique)(immunoassay technique)，Yalow Yalow 也於也於1977 1977 獲得諾貝獲得諾貝爾獎。爾獎。B-chainA-chainC-peptides-ss-ss-sManufacture of Insulin 1923-started manufacturin
29、g insulin(Eli Lilly,Novo)Most developments in insulin therapy have originated from the laboratories of Novo-Nordisk NPH insulin highly purified insulin monocomponent insulin semisynthetic insulin biosynthetic human insulin Currently Novo Nordisk manufactures human insulin from bakers yeast using rDN
30、A technology；Eli Lilly produces human insulin using E.coli.Problems with Early Preparations Crude high levels of non-insulin-like impurities Proinsulin,proinsulin intermediate,covalent insulin dimerAcidic pH 4-4.3-pain during injectionHigh incidence of allergic reactions Short duration of action(mor
31、e no.of injections)Better Purification methodsConventional:isoelectric precipitation and recrystallization,Imp:10000-30000ppmSingle peak:by gel-filtration chromatography,(Imp 300-3000ppm)Improved single peak:by ion-exchange chromatography,(50ppm)Highly purified:twice chromatographed insulin,(purifie
32、d to 10ppm)Monocomponent:Imp1ppmHistory of insulin preparations1922:Isolation of insulin1923:Novo Nordisk starts production of insulin1946:NPH(Neutral Protamine Hagedorn)or Isophane insulin1961:First neutral soluble insulin:Actrapid1964:First premixed insulin:Mixtard1973:Monocomponent(MC)purity1982:
33、Human Monocomponent HM1985:NovoPen with Penfill 1984:Research on analogues 胰岛素是由51个氨基酸组成的双链多肽激素，一种可溶性酸性蛋白，分子量为5734道尔顿；每个胰岛素单体包括两条肽链（A、B链），A链含有21氨基酸；B链含有30氨基酸并分别由两个胱氨酸的二硫键连接，多聚体必须裂解成单体才可吸收；呈酸性，等电点为5.3。胰岛素受pH值、温度、离子强度的影响产生聚合和解聚。速效胰岛素速效胰岛素-Lispro 赖脯胰岛素赖脯胰岛素Lispro由Lilly公司研发而成，是人胰岛素链上的第28 位的脯氨酸和第29 位的赖氨酸
34、位置互换，其他的氨基酸序列和结构没有变化，以单体的形式存在.速效胰岛素-Aspart门冬胰岛素 1999年，Aspart在欧洲上市；2002年在我国上市，是由诺和诺德公司研发的速效胰岛素类似物，人胰岛素链28 位的脯氨酸被天冬氨酸取代，使该胰岛素类似物不易形成六聚体。与Lispro相比，Aspart的吸收速度更快，对餐后血糖的控制、降低糖化血红蛋白效果更好。这种药代动力学的差异可能与它们的等电点不同有关。Aspart对酸化溶液沉淀蛋白的耐受度较高速效胰岛素速效胰岛素-Glulisine赖谷胰岛素 是Aventis 公司正在研发的一种新型快速作用的胰岛素类似物，链3 位的天冬酰胺被赖氨酸替代，而
35、B链29位的赖氨酸则被谷氨酸取代。长效胰岛素-Glargine甘精胰岛素 由Aventis 公司研发的长效胰岛素类似物，2000 年在美国和欧洲上市，于2003 年在我国上市。和人胰岛素的区别在于A 链羧基端的第21 位天冬氨酸被甘氨酸替代，B链C末端加上2个精氨酸残基，。结构改变的结果是改变了胰岛素的等电点，由pH54升至67，使Glargine在生理pH条件下更难溶解、吸收更为缓慢，六聚体的结合更加稳定，无分泌峰值.1115105510152020Asn2530G l yArg ArgSubst i t ut i onExt ensi on长效胰岛素-Detemir地特胰岛素 由诺和诺德公
36、司研制生产，结构上去除了人胰岛素B链29位赖氨酸E位以共价键结合一个N一16烷酸基的14碳游离脂肪酸，并去掉第30位的苏氨酸残基。与Glargine不同，Detemir 溶液在皮下不会形成沉淀，因此吸收速率恒定 人胰岛素生产工艺表达胰岛素原,胰岛素原复性,复性后的胰岛素原通过酶切得到有活性的胰岛素.其中胰岛素原的复性效率是决定最终收率的关键因素,正确折叠与错误折益胰岛素原的分子量完全相同,结构非常相似,采用RT-HPLC可对其进行分离检定.Sergeev等利用反相色谱建立了复性液中胰岛素原的检测方法.如果要对正确折叠与错误折叠胰岛素原的结构进一步说明,可将其用蛋白酶V8酶解,然后用RP-HPL
37、C-MS作肽图谱.Damn等用S.aureus protease V8酶解胰岛素原,然后用RFHPLC做肽谱图,并结合质谱法对重组胰岛素原的折叠过程进行了监测.整个生产工艺流程大致分为五大整个生产工艺流程大致分为五大步骤步骤17道工序：道工序：基因重组人胰岛素的主要生产步骤如下：工程菌发酵、提取包含体、包基因重组人胰岛素的主要生产步骤如下：工程菌发酵、提取包含体、包含体中含体中 分离融合蛋白、还原融合蛋白中的二硫键、融合蛋白复性、纯化分离融合蛋白、还原融合蛋白中的二硫键、融合蛋白复性、纯化融合蛋白、胰蛋白融合蛋白、胰蛋白 酶水解融合蛋白、纯化含胰岛素的肽段、按肽酶酶水解融合蛋白、纯化含胰岛素的
38、肽段、按肽酶B水水解含胰岛素的肽段、纯化人胰解含胰岛素的肽段、纯化人胰 岛素。岛素。1、发酵。发酵。整个发酵系统经过四级放大，从3.7升已嵌合表达了人类DNA大肠杆菌种子罐开始，到150升，再到1200升，最后到30吨。公司二期两个容量30吨的大发酵罐全球最大。用来自于人的大肠杆菌作表达载体，经过水、蛋白胨培养液，发酵4856小时，将胰岛素基因表达成胰岛素蛋白质。2、分离。分离。在高压匀浆机和离心机的作用下，收集包涵体，得到胰岛素前体分子。3、复性。复性。加复性液，得到有三级空间结构的、有生物学活性的、基因重组人胰岛素。通化东宝胰岛素的比活性，与诺和、礼莱等巨头一样，都达到了极限值2930IU
39、/mg。4、纯化纯化。经过直径1米的大柱子、多步柱层析纯化（有反向柱层析、离子交换柱层析等），胰岛素的纯度达到99%，完全可与诺和、礼莱等巨头媲美。5、冻干。冻干。两台进口冻干机，能充分满足生产所需。1982年年,美国美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素素,成为世界上第一个上市的基因工程药物。成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年年,Novo公司公司,成为世界上第一个上市的基因工程药物。成为世界上第一个上市的基因工程药物。1987年年,Novo公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新
40、工艺。七七.人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法基因工程法生产人胰岛素基因工程法生产人胰岛素l体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别素没有任何区别l具有无免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在具有无免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。生物医药领域中的巨大潜力。potentialimmunogenicPrinciples of Gene Manipulation by liuze
41、ngranHebei University of Economics and Business SHSHSHSHC C C C COO_SHSH N C CS.S.Pre-pro-insulinSSSSC C C C COO_SSC CS-SPro-insulin NSSSSC C C C COO_C CS SS-SinsulinNPrinciples of Gene Manipulation by liuzengranHebei University of Economics and Business 基因工程菌的构建战略：化学合成A链和B链的编码序列表达重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A
42、链和B链分别表达法1synthesisPrinciples of Gene Manipulation by liuzengranHebei University of Economics and Business Principles of Gene Manipulation by liuzengranHebei University of Economics and Business 由于由于A链和链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低硫键的正确配对率较低,通常只有通常只有10%-20%.采用这条工艺路线生产正确配对率较低采用这条工艺路
43、线生产正确配对率较低,采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。美元以上。A链和链和B链分别表达法链分别表达法 生产技术评价生产技术评价为了进一步降低生产成本为了进一步降低生产成本,美国美国Ely LiLi公司随后又建公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线Principles of Gene Manipulation by liuzengranHebei University of Economics and Business 基因工程菌的构建战略基因工程菌的构建战略 人胰岛素原表达
44、法人胰岛素原表达法proinsulinPrinciples of Gene Manipulation by liuzengranHebei University of Economics and Business 表达产物后处理路线 B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys,由于良好折叠的原因,对胰蛋白酶不敏感Principles of Gene Manipulation by liuzengranHebei University of Economics and Business 在人胰岛素原表达工艺中在人胰岛素原表达工艺中,由于由于C肽的存在肽的存在,胰岛素原能形成良胰岛素原能形成良好
45、的空间构象好的空间构象,三对二硫键的正确配对率也相应提高三对二硫键的正确配对率也相应提高,折叠率高折叠率高达达80%以上。以上。生产技术的评价生产技术的评价目前美国目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。虽然这条工艺路线不比虽然这条工艺路线不比AB链分别表达法更为简捷链分别表达法更为简捷,而且还要使而且还要使用两种高纯度的酶制剂用两种高纯度的酶制剂,但理想的折叠率在很大程度上弥补了但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷工艺繁琐的缺陷,使得每克最终产品的成本仅使得每克最终产品的成本仅50美元。美元。Principles of
46、 Gene Manipulation by liuzengranHebei University of Economics and Business 一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与岛素或胰岛素原编码序列与beta-內酰胺酶基因拼接內酰胺酶基因拼接,beta-內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性蛋白的优良特性,为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。负担。分泌型重组人胰岛素表达法分泌型重组人胰岛素表达法上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌素原编码序列与大肠杆菌beta-半乳糖苷酶基因拼接的半乳糖苷酶基因拼接的方法方法,所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强,但不能分泌但不能分泌,只要以包涵体的形式存在于胞质中。只要以包涵体的形式存在于胞质中。
