1、细菌标本片的制备及染色法细菌标本片的制备及染色法实验目标实验目标 使学生掌握利用细菌病料、细菌培养物、血液等材料制备标本片的方法及常用染色法。进一步认识细菌的形态结构，会识别病料组织标本片上的细胞和细菌，能区分培养物标本片上的G+菌、G-菌。明确本技能在实践中的意义。初步养成无菌操作的习惯。实验内容实验内容1.实验器材2.用实验室常见的3种不同材料制作标本片：组织病料（肝脏）：组织病料（肝脏）：触片及美兰染色触片及美兰染色固体细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌）：固体细菌培养物（大肠杆菌、葡萄球菌）：涂片及革涂片及革兰氏染色兰氏染色液体病料：液体病料：血涂片及瑞士染色血涂片及瑞士染色3.镜检结果4
2、.注意事项实验器材实验器材 酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物(大肠杆菌、葡萄球菌等)、细菌病料、镊子、剪刀、标记笔等病料病料 标本片标本片 镊子镊子 剪刀剪刀 酒精灯酒精灯干燥2固定3美兰染色4触片触片1细菌病料触片及美兰染色细菌病料触片及美兰染色镊子、剪刀在酒精灯火焰上烧灼灭菌，用镊子夹持、剪刀剪取小块病料组织，以其新鲜切面在玻片上轻触35个压迹。干燥2固定3美兰染色4触片触片1室温下自然干燥或将标本片的涂面向上，置酒精灯火焰高处微烤加热干燥。细菌病料触片及美兰染色细菌病料触片及
3、美兰染色干燥2固定3美兰染色4触片1细菌病料触片及美兰染色细菌病料触片及美兰染色火焰固定方法：将干燥好的标本片涂面向上，在酒精灯火焰上通过34次，以手背触及玻片微烫手为宜。固定目的：1.使涂抹材料更好粘附于玻片，以免水洗时冲掉。2.易于着色。3.杀死标本片上的微生物。干燥2固定3美兰染色4触片1细菌病料触片及美兰染色细菌病料触片及美兰染色滴加美蓝染色液覆盖涂面，静置染色23min，水洗，用吸水纸吸干镜检。美兰染色镜检结果美兰染色镜检结果细菌（蓝色）细胞核（蓝色）干燥2固定3革兰氏染色4涂片涂片1细菌培养物涂片及革兰氏染色细菌培养物涂片及革兰氏染色(1)固体培养物 取洁净的玻片一张，把取洁净的玻
4、片一张，把接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌后，接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌后，取取1 12 2环的无菌生理盐水，放于载环的无菌生理盐水，放于载玻片的中央，再将接种环灭菌，冷玻片的中央，再将接种环灭菌，冷却后，从固体培养基上挑取菌落或却后，从固体培养基上挑取菌落或菌苔少许，与水混匀，作成直径菌苔少许，与水混匀，作成直径1cm1cm的涂面。接种环用后需灭菌。的涂面。接种环用后需灭菌。(2)液体培养物 可直接用灭菌接种环钩可直接用灭菌接种环钩取细菌培养液取细菌培养液1 12 2环，在玻片上作环，在玻片上作直径直径1cm1cm的涂面的涂面干燥2固定3革兰氏染色4涂片涂片1室温下自然干燥或将标本片的涂面向上
5、，置酒精灯火焰高处微烤加热干燥。细菌培养物涂片及革兰氏染色细菌培养物涂片及革兰氏染色干燥2固定3革兰氏染色4涂片1细菌培养物涂片及革兰氏染色细菌培养物涂片及革兰氏染色火焰固定：将干燥好的标本片涂面向上，在酒精灯火焰上通过34次，以手背触及玻片微烫手为宜。干燥2固定3革兰氏染色4涂片1细菌培养物涂片及革兰氏染色细菌培养物涂片及革兰氏染色1.草酸铵结晶紫水洗12min2.革兰氏碘液水洗12min3.95%酒精水洗0.51min4.稀释石炭酸复红水洗2030s革兰氏染色镜检结果革兰氏染色镜检结果葡萄球菌（G+菌，蓝紫色）大肠杆菌（G-菌，红色）干燥2瑞氏染色3推片推片1血涂片及瑞士染色血涂片及瑞士染
6、色取一张边缘整齐的载玻片，用其一端醮取血液等液体材料少许，在另一张洁净的玻片上，以45角均匀推成一薄层的涂面。45干燥2瑞氏染色3推片推片1室温下自然干燥血涂片及瑞士染色血涂片及瑞士染色干燥2瑞氏染色3推片1血涂片及瑞士染色血涂片及瑞士染色滴加瑞氏染色液于涂片上以固定标本，13min后，再滴加与染色液等量的磷酸缓冲液或中性蒸馏水于玻片上，轻轻摇晃使与染色液混和均匀，5min左右水洗，干后镜检注：瑞氏染液含甲醇，无需另行固定瑞氏染色镜检结果瑞氏染色镜检结果细胞细菌（蓝色）注意事项注意事项 标本片上的细菌涂面应薄而匀，否则不利于染色和观察。干燥及火焰固定时，切勿紧靠火焰，以免温度过高造成菌体结构破坏。标本片固定必须确实，以免水洗时菌被冲掉。水洗时，不要先弃去染液，应让水与染色液一并冲洗掉，以避免染色液中沉渣粘附于玻片影响染色效果。
