1、HPV检测技术及临床应用 1 内容uHPV检测技术的诞生背景uHPV检测临床应用的进展uHPV检测主要的技术及特点u硕世21HPV分型定量检测的优势2HPV与宫颈癌关系的确立Professor Harald zur HausenNobel Prize for Medicine 20081976年：Harald zur Hausen在宫颈癌及疣体患者中发现了HPV DNA；1984年：Harald zur Hausen从宫颈癌患者中克隆了HPV16型和18型病毒。“The first one who demonstrated HPV-DNA sequences in cervical cance
2、r biopsies and cervical cancer cell lines.”3Year1975198019851989199319972001200520105-存活率68.1%67.9%66.4%71.0%70.9%71.6%70.4%68.0%67.9%Cytology Reduced Cervical Cancer Incidence but Unmet Cytology Reduced Cervical Cancer Incidence but Unmet Need Still ExistsNeed Still Existshttp:/seer.cancer.gov/arch
3、ive/csr/1975_2010/results_merged/sect_05_cervix_uteri.pdf:SEER 9 Incidence&U.S.Mortality 1975-2010,All Races,Females.Rates are Age-Adjusted.(accessed 3/25/14)细胞学减少了宫颈癌的发生率，但尚未满足的需求依然存在4对于CIN2及以上病变检测的敏感性，细胞学低于HPV DNA检测1精确性差：不同的细胞病理学医生之间或实验室之间对结果的判读，存在高度的变异2只能分辨已经处于癌或癌前病变的妇女，不能分辨具备发展为癌前病变的风险妇女1.Castle
4、 PE,et al.Lancet Oncol 2011;12:880890 plus supplementary tables.2.Wright TC et al.Int J Cancer.2013 Oct 7.doi:10.1002/ijc.28514.Epub ahead of print单独使用细胞学的局限性5细胞学假阴性率高女性确诊为浸润癌（ICC）的筛查史原因原因Kaiser1Swedish audit2近期没有筛查近期没有筛查464(56%)789(64%)细胞学漏检细胞学漏检263(32%)300(24%)异常细胞学随访时漏检异常细胞学随访时漏检106(13%)91(7%)1.L
5、eyden WA,et al.J Natl Cancer Inst 2005;97:675683;2.Andrae B,et al.J Natl Cancer Inst 2008;100:622629.6细胞学临床敏感性明显更低于HPV DNA检测Whitlock EP,et al.Ann Intern Med.2011;155:687697,W2145.Studies performed in developed countries in women 30 years and older.平均增加了平均增加了35.7%35.7%BigrasBigras(N=13,842)(N=13,842)
6、CardenasCardenas(N=1,850)(N=1,850)CosteCoste(N=3,080)(N=3,080)KulasingamKulasingam(N=774)(N=774)MayrandMayrand(N=9,977)(N=9,977)PetryPetry(N=7,908)(N=7,908)020406080100细胞学细胞学HPV DNA HPV DNA 检测检测 CIN2的检测敏感性的检测敏感性(%)7细胞学缺乏精确性细胞学的判读重复性差NILMNILMASCUSASCUSLSILLSILHSILHSILNILMNILM78%78%19%19%3%3%1%65岁近10
7、年有连续3次阴性细胞学结果或连续2 次阴性联合筛查结果且末次筛查在近5 年内的65 岁女性,停止筛查。13HPV检测联合细胞学筛查（30岁及以上）ASCCP，American Society for Colposcopy and Cervical Pathology：美国阴道镜和宫颈病理学会CSCCP，China Society for Colposcopy and Cervical Pathology：中国阴道镜和宫颈病理学会LSIL，Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion)：低度鳞状上皮内病变Saslow D et al,Journal of L
8、ower Genital Tract Disease,2012HPV检测+细胞学细胞学 LSILHPV+&NILMHPV-&ASC-USHPV-&NILMHPV+&ASC-US阴道镜间隔5年筛查ASCCP推荐：间隔3年筛查CSCCP推荐：间隔1年筛查HPV16/18+HPV16/18-HPV16/18分型 立即重复联合检测间隔12个月HPV+或 ASCHPV-&NILM阴道镜间隔3年筛查重复联合检测间隔12个月142.21岁及以上女性细胞学ASC-US的分流管理(2013年ASCCP指南推荐)意义不明的非典型鳞状上皮细胞（ASC-US）阴性ASC 常规筛查（3年内细胞学检查）阴道镜 不充分阴道
9、镜检查未观察到上皮病变，首选颈管取样 充分阴道镜检查转化区有上皮病变，可接受颈管取样HPV阳性HPV阴性重复联合检测间隔 3年参照ASCCP指南管理重复细胞学，间隔 1年（可接受）HPV检测（首选）L.Stewart Massad,et al,Journal of Lower Genital Tract Disease,2013.153.25岁及以上女性HPV检测宫颈癌一线初筛(2016年ACOG指南推荐)HPV初筛HPV16/18型阳性阴道镜其它12高危HPV+细胞学12个月后随访阴性常规筛查ASC-USNILMACOG，American Congress of Obstetricians
10、and Gynecologists：美国妇产科医师学会NILM，negative for intraepithelial lesion or malignancy：未见上皮内病变或恶性病变ASC-US，Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance：意义不明的非典型鳞状上皮细胞2016 ACOG practice bulletin，Number 157.16HPV 检测预防宫颈癌（欧洲试验结果）4 个欧洲随机试验，分别在瑞典、荷兰、英国和意大利进行 包括 176,464位20-64岁妇女 随访的中位年数为6.5 (1,214,415 人
11、-年)HPV 初筛相比细胞学，减少了宫颈癌的发生率Ronco et al.Lancet，2014 17HPV检测筛查宫颈癌的预防效果优于细胞学100908070605040302010002468累计检出率(每 105)随访时间(年)基线时妇女检测结果为阴性 细胞学筛查 HPV 检测筛查Ronco et al.Lancet，2014 汇总四个随机对照试验的宫颈癌发病率：细胞学（对照组）与HPV检测（试验组）18美国ATHENA研究 研究人群：美国46,887位接受常规筛查的妇女(其中32,260位 30 岁，41955位 25 岁)受检者同时妇科检查，液基细胞学检查，HPV检测和基因分型 所有
12、HPV(+)和/或 细胞学(+)；和选取部分HPV(-)/NILM（未见上皮内细胞病变）的人群行阴道镜检查19比较不同筛查策略效能（25岁及以上女性）策略筛查检测CIN3+基线CIN3+1-3年CIN3+漏检阴道镜 每检测1 个CIN3+所需的阴道镜数细胞学45,166143361681,93410.8混合策略*82,994143971073,09712.9HPV 初筛52,65119797533,76912.8权衡CIN3+的检出率和阴道镜转诊率Wright et al.Gynecol Oncol 2015*混合策略是指25-30岁细胞学筛查策略结合30岁及以上HPV检测联合细胞学筛查策略2
13、00 02 24 46 68 8101012121414161615-1915-1920-2420-2425-2925-2930-3430-3435-3935-3940-4440-4445-4945-4950-5450-5455-5955-5960-6460-6465-6965-6970-7470-7475-7975-7980-8480-8485+85+宫颈癌发生率（每100,000）年龄组*http:/seer.cancer.gov/csr/1975_2010/SEER SEER 肿肿瘤登瘤登记记(1975-2010)(1975-2010)*美国宫颈癌的发病率25 34 岁时快速上升期SEE
14、R（Surveillance,Epidemiology,and End Results）21Presented to FDA panel,12 March 2014Age GroupAge Group40%40%30%30%20%20%10%10%0%0%25-2925-2940-4940-4930-3930-39 5050CIN3CIN3病例（病例（%）21-2421-2428%28%17%17%10%10%37%37%8%8%25%25%N=22,006N=22,006WomenWomenN=6647N=6647Women Women 28%的CIN3 病例发生在25-29 岁年龄段225
15、7.346.738.327.80%20%40%60%80%100%25-2930-3940-495042.742.753.353.361.761.772.272.2细胞学漏检了25-29年龄段的大多数 CIN3病例 Percentages shown are for hrHPV+women with CIN3,N=252Huh W,et al.27th International Papillomavirus Conference,Berlin,Germany,September 1722,2011,OP-229.比率CIN3(%)年龄ASC-USNILM234.宫颈病变术后的追踪与管理诊断性
16、切除术或转化区消融术诊断性切除术阴道镜充分阴道镜不充分，CIN2,3复发，或颈管取样为CIN2,3HPV检测+细胞学12个月和24个月连续两次联合检测均为阴性重复联合检测3年内常规筛查任何检测异常阴道镜结合颈管取样2013年ASCCP指南推荐的CIN2,3 管理*如果妊娠或年龄在2124 岁的女性，管理选择可能会有所差异n 术前、术后的检测提示病灶是否清除干净n 术后 6、12 个月复查HPV检测，若结果仍为阳性，提示有残留病灶或复发可能n CIN 转归的预测，若 CIN 不伴HPV，预示良性转归245.HPV分型及定量检测的临床应用n 预测病变的发展或转归对于非CIN的HPV检测阳性患者，根
17、据病毒型别及载量的变化，监测患者HPV是自限性感染（一过性感染）或持续性感染，预测患者病变的发展或转归n 风险提示高病毒载量预示着患者自我消退的时间更长以及潜在的病变风险更高，提示临床需进行更为积极的管理n 指导疫苗的使用和研究2006年FDA批准了第一代四价抗HPV疫苗（抗HPV16、18、6、11），2014年FDA又批准了9价抗HPV疫苗（抗HPV16、18、31、33、45、52、58、6、11），推荐对已有性生活的人群，在接种疫苗前进行HPV基因分型检测 Shen G,Chen J,Wang Y,et al,2014.Jonas Lefevre,Catherine Hankins,e
18、t al.2004.廖秦平,赵健,2010.25病毒载量是宫颈病变发生发展的关键因素随着HPV病毒载量的增加，细胞异常的比例显著增加Bigras G,Marval F D.British Journal of Cancer,2005,93(5):575-81.26病毒载量越高，持续感染的时间越长a：LS-PCR（low-stringency PCR）0.500.512121b：qRT-PCR L188825825c：qRT-PCR E677-675675病毒载量可预测病毒的清除或疾病的进展Trevisan A,Schlecht N F,Ramanakumar A V,et al.Journal
19、 of General Virology,2013,94(Pt 8):1850-1857.三种不同的检测试剂，评估不同三个区隔每单位细胞内HPV16型拷贝数随时间的清除情况27乔友林团队载量预测风险的研究结论：HR HPV病毒载量越高，发生宫颈癌及高度病变的风险越高，提高病毒载量界值可以进一步分流HPV阳性人群，从而更合理的分配卫生资源。Kang L,Zhao F,Chen F,et al.Value of high risk human papillomavirus viral load in predicting cervical lesions and triaging for high
20、 risk(HR)-HPV-positive women.J.Zhonghua zhong liu za zhi Chinese journal of oncology,2014,36(4):316-20.28内容uHPV检测技术的诞生背景uHPV检测临床应用的进展uHPV检测主要的技术及进展u硕世21HPV分型定量检测的优势29HPV检测方法核酸信号放大PCRPCR+芯片杂交凯普 21分型亚能 23分型透景27分型达安18分型荧光PCR罗氏cobas HPV之江13分型港龙13高危硕世HPV21分型&定量TMA豪洛捷AptimaISO中生方政HPV 非核酸信号放大法杂交捕获凯杰 HC2凯杰c
21、areHPV德同DH2/3酶切信号放大豪洛捷cervista国内主要HPV检测产品30非核酸信号放大法digene HC2 HPV检测：检测13种高危型，不分型德国凯杰careHPV检测：检测14种高危型，不分型DH2：检测14种高危型，不分型 DH3：检测16/18型+12高危型不分型杂交捕获法酶切信号放大法Cervista HR：检测14种高危型，分组但不分型 Cervista 16/18：检测16&18分型31DNA裂解成为单链HC2全长8000碱基对的RNA探针与DNA杂交一抗捕获固定DNA:RNA杂交体酶催化底物化学发光，基因信号放大仪器检测发光信号HC2（Hybrid Captur
22、e 2）杂交捕获二代技术携带碱性磷酸酶的二抗与固定的杂交体结合利用基因杂交、化学发光、信号放大的原理，13种高危型HPV（不分型，半定量）32核酸信号放大法核酸信号放大法PCR普通PCR+芯片分型普通PCR+芯片分型实时荧光PCR技术TMAISOAptima HR&Aptima 16、18/4515高危分型15高危不分型16/18分型+13不分型33凯普的21HPV分型检测（PCR+膜杂交法，定性检测）34cobas x 480全自动核酸分离纯化仪cobas z 480聚合酶链反应仪日常维护2-7分钟（手工）样本制备62-149分钟转换到z4802-3分钟（手工）DNA扩增和检测86-120分
23、钟卸载z480中的反应板1分钟（手工）样品加载到x48011-27分钟（手工）检测96样本约需5小时，其中手工用时需约40分钟n基于LightCycle480实时荧光PCR技术n四个荧光信号检测通道，分别检测：内质控（Intern control）、HPV16型、HPV18型和12高危型HPVn采用磁珠分离技术分离核酸n原始收集管可直接上样，但样本加载需要人工操作，特别是加载液基细胞学样本时需要手工开盖n所用耗材（枪头、微孔板等）必须额外购买cobas4800专用耗材cobas4800 检测原理及流程35cobas HPV检测检测检测HPV16HPV16检测检测HPV18HPV18检测检测-g
24、lobin-globin内质控内质控检测其他检测其他1212种高种高危危HPVHPV混合型混合型1 1次检测可在次检测可在4 4个通道内分别报告个通道内分别报告HPV16HPV16型，型，HPV18HPV18型，其他型，其他1212种高危混合种高危混合型及内质控型及内质控-globin-globin的结果的结果Wright TC Jr,et al.Am J Obstet Gynecol 2012;206:46.e1-.e11361、磁珠提取mRNA2、TMA，转录介导的扩增3、杂交保护及化学发光检测（DKA）T(胸腺嘧啶）构成的核苷酸链固定于磁珠上寡核苷酸序列捕获目标RNAAPTIMA HPV
25、检测（TMA技术，定性检测）37精准医学：HPV检测的应用进展杂交捕获技术检测13 种高危HPV不分型半定量荧光PCR技术检测14种高危HPV16/18分型定性转录介导扩增（TMA）检测14种高危HPV16,18/45分型定性荧光PCR技术检测18种高中危+3种低危型21种HPV分型&标准化定量不分型分型&定性定量 38内容uHPV检测技术的诞生背景uHPV检测临床应用的进展uHPV检测主要的技术及进展u硕世21HPV分型定量检测的优势39硕世21HPV分型定量检测系统简介采用独有专利的“宫颈脱落细胞取样处理标准化”技术和先进的多重荧光PCR定量技术，可在2.5小时内快速、准确地区分样本中的2
26、1种HPV亚型，包括13种高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，5种中危型HPV26、53、66、73、82和3种低危型HPV6、11、81；并同步对21种HPV各亚型进行标准化定量。40创新与突破1：分管分型HPV16HPV18HPV31HPV59HPV66HPV53HPV33HPV58HPV45HPV56HPV52HPV35HPV68HPV51HPV39HPV82HPV26HPV73HPV6HPV11HPV81定量参考基因检测传统分型技术（膜杂交/液体芯片杂交）创新分型技术（硕世分管分型）PCR扩增+膜/液态芯片杂交，时间长PCR扩增同步
27、分型，时间短PCR扩增产物开盖进行杂交，易污染实时荧光PCR闭管扩增分型，不易污染所有靶标在同一管中扩增，易竞争抑制每管仅扩增3种型别，分型准确分管区分21种HPV基因亚型41中国医科大学附属盛京院研究数据硕世HPV检测与型别鉴定的金标准测序法比较，准确性99.6%42硕世HPV检测（BMRT）的筛查性能：北京大学深圳医院临床研究数据Chen Q,Du H,Zhang R,et al.Genetics and molecular research:GMR,2016,15(2).自采样的检测，硕世21HPV分型定量检测（BMRT）敏感性高于cobas HPV检测43全面检测CFDA要求检测的18
28、种高危型2015年CFDA颁布最新HPV试剂指导原则http:/ 6、11、816、11、42、43、44、83、MM4硕世21HPV分型定量检测18高中危型与CFDA最新要求完全一致45准确区分中国人群常见致病型别国家排序HPV型别病例数HPV型别分布（%）95%置信区间中国116532438.5(37.2-39.8)252524518(17.0-19.1)358524516(15.1-17.1)43353247.4(6.8-8.2)51853247.2(6.5-7.9)63153245.1(4.6-5.8)75152454.1(3.6-4.6)85349493.2(2.8-3.7)9685
29、0892.8(2.3-3.2)105952452.8(2.4-3.3)*全球HPV信息中心（ICO）最新发布，链接网址：http:/ HPV相关统计:宫颈癌前病变排名前10位HPV型别的分布*46北京大学深圳医院临床数据研究检出频率位于前四位的亚型是HPV 16、52、58、33*研究选用的HPV检测方法为：硕世21HPV分型定量检测Prof.Wu s Data 47准确分型，风险分层2%0%癌前病变风险阴道镜阈值 10%30%21种HPV亚型13种高危型HPV中国人群最常见 癌前病变高危险型HPV16型HPV52型HPV58型HPV33型HPV18型一般高危型HPV31、35、39、45、5
30、1、56、59、68型5种中危型HPVHPV26、53、66、73、82型3种低危型HPVHPV6、11、81型Nicolas Wentzensen，2015 48创新与突破2：标准化定量宫颈脱落细胞HPV病毒宫颈脱落细胞样本HPV检测定量的挑战采样差异会导致样本中细胞数量不一，无法统一标准，进而无法实现定量标准化定量（硕世专利）通过定量检测宫颈脱落细胞内的单拷贝基因的数量测算宫颈脱落细胞的数量，并报告同等细胞数量中HPV病毒载量（copies/cells），实现标准化定量专利号：ZL 201110087602.149中国医科大学附属盛京院研究数据313例HPV16阳性病例，随着病变等级提高载
31、量也相应增加Sun Z et al.Bmc Cancer,2015.50北京大学深圳医院临床验证数据硕世21HPV分型定量检测：不同程度宫颈病变病灶中HPV亚型病毒载量HPV 16HPV 52HPV 58Prof.Wu s Data 51北京大学深圳医院临床验证数据硕世21HPV分型定量检测：不同程度病变病灶组织中病毒载量Prof.Wu s Data 52硕世21HPV分型定量报告单HPV风险分层列表HPV阳性亚型每10000个细胞数量中的病毒载量，对应显示为：6.82107拷贝/1万细胞HPV亚型病毒载量的百分比53小结HPV检测在宫颈癌筛查中发挥了越来越重要的作用25岁及以上女性的HPV检测初筛已纳入筛查指南；中国人群宫颈癌前病变最常见HPV型别为HPV16、52、58、33型；硕世21HPV分型定量检测：首个，唯一采用标准化定量的HPV分型检测54
