1、第第 11章章 基因工程基因工程第第 1节节 基因工程概述基因工程概述第第 2节节 基因的分离基因的分离第第 3节节 外源基因导入受体外源基因导入受体第第 4节节 转基因生物的检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定第第 5节节 基因工程的应用基因工程的应用遗传工程（遗传工程（genetic engineering），也称生），也称生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。生物体的一种遗传学手段。核心是利用重组核心是利用重组DNA技术，在分子水平上技术，在分子水平上操
2、作修饰改变生物体。操作修饰改变生物体。细胞工程（细胞工程（cell engineering）基因工程（基因工程（gene engineering）酶工程（酶工程（enzyme engineering）发酵工程（发酵工程（fermentation engineering）第第 1节节 基因工程概述基因工程概述基因工程（基因工程（gene engineering）l利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰
3、或改变的过程。性得到修饰或改变的过程。l基因工程操作的对象是基因工程操作的对象是DNA分子，分子，首先首先把把目标基因克隆出来插入到一定的载体中，目标基因克隆出来插入到一定的载体中，然然后后将重组将重组DNA分子导入到受体细胞，并使其分子导入到受体细胞，并使其保持和遗传下去。保持和遗传下去。第第 1节节 基因工程概述基因工程概述u目的基因的获目的基因的获u目的基因与载体的连接成重组目的基因与载体的连接成重组DNADNA分子分子u重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞u筛选重组克隆筛选重组克隆u基因表达与产物分离基因表达与产物分离基因工程的内容 第第 1节节 基因工程概述基因工程概
4、述第第 2节节 基因的分离基因的分离一一 工具酶工具酶二二 载体载体三三 基因分离方法基因分离方法 第第 2节节 基因的分离基因的分离一、工具酶一、工具酶（一）（一）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶(restriction enzymes)限制性内切核酸酶（限制酶）是细菌中降解外限制性内切核酸酶（限制酶）是细菌中降解外来来DNA分子的一类酶。分子的一类酶。细菌中限制细菌中限制修饰现象：修饰现象：作用于同一作用于同一DNA的两的两种酶种酶分解分解DNA的的限制酶限制酶和改变和改变DNA碱基碱基结构使其免遭限制酶分解的结构使其免遭限制酶分解的修饰酶修饰酶。通过某些。通过某些碱基进行甲基化修饰，使得
5、限制酶不能进行切碱基进行甲基化修饰，使得限制酶不能进行切割。而外来的割。而外来的DNA在没有被甲基化，限制酶将在没有被甲基化，限制酶将其降解。其降解。（一）（一）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶共同的特性：共同的特性：只切割双链只切割双链DNA分子，不切单链分子，不切单链DNA；每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性；每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性；需要镁离子激活等。需要镁离子激活等。限制酶可分为限制酶可分为3类。类。型酶：只有型酶：只有EcoB和和EcoK两种，具有催化限制性两种，具有催化限制性切割和修饰核苷酸切割和修饰核苷酸2种功能。种功能。型酶：在遗传工程中应用最广泛。型酶：在遗传工
6、程中应用最广泛。有特异识别有特异识别和切割的序列部位，被切割的和切割的序列部位，被切割的DNA分子形成单链的分子形成单链的断裂；断裂；断裂的部位通常不是直接相对的，结果所断裂的部位通常不是直接相对的，结果所形成的形成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末端），使其能够重新连接；末端），使其能够重新连接；内切酶的切割和修内切酶的切割和修饰功能由两个不同的酶催化所完成。饰功能由两个不同的酶催化所完成。型酶具有特异的识别位点，这种识别位点是非对型酶具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的。称的。（一）（一）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（一）（一）限制性内
7、切核酸酶限制性内切核酸酶通过用相同通过用相同的限制性内的限制性内切核酸酶切切核酸酶切割形成一个割形成一个重组重组DNA分分子子（一）（一）限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（二）（二）DNA连接酶（连接酶（ligase）在分子克隆中使用在分子克隆中使用的的DNA连接酶有两种：连接酶有两种：大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶和和T4 DNA连接酶。连接酶。催化催化DNA中相邻的中相邻的3 OH和和5 磷酸基磷酸基末端之间形成磷酸二末端之间形成磷酸二酯键并把两段酯键并把两段DNA连连接起来。接起来。（三）（三）反转录酶反转录酶（reverse transcriptase）反转录酶是一类以反转录酶是一
8、类以RNA为模板来指导为模板来指导DNA合成的合成的DNA聚合聚合酶，所以又称为依赖于酶，所以又称为依赖于RNA的的DNA聚合酶。聚合酶。反转录酶在遗传工程反转录酶在遗传工程中的主要用途是以中的主要用途是以mRNA为模板合成为模板合成cDNA。（四）（四）PCR 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是体外快是体外快速扩增速扩增DNA的方法的方法。PCR反应包括三个步骤：反应包括三个步骤：变性：变性：在在94-9594-95使模板使模板DNADNA的双的双链变性成单链。链变性成单链。复性复性：两个引物分别与单链两个引物分别与单链DNADNA互
9、补复性，复性的温度在互补复性，复性的温度在50-6050-60 延伸延伸：在引物的引导及：在引物的引导及TaqTaq酶的酶的作用下，于作用下，于7272合成模板合成模板DNADNA的互补的互补链链 这三个步骤称为一个循环，这三个步骤称为一个循环，PCR反应常有反应常有25-35个循环。个循环。PCR.EXE（四）（四）PCR PCR产物可以通过产物可以通过电泳检测电泳检测琼脂糖电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳二二 载体载体 载体（载体（vectorvector）是将外源基因送入受体细胞的）是将外源基因送入受体细胞的工具。工具。作为载体作为载体DNADNA分子，需要具备：分子，
10、需要具备：在宿主细胞中能独立复制，有独立的复制起始位点；载体DNA分子中有一段不影响其复制的非必需区域，即有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增；有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主细胞；分子量小，多拷贝，易于操作。除了上述特点外，一般还要求载体载荷外源DNA的幅度要宽，具有安全性等。（一）（一）质粒质粒 质粒质粒(plasmid)是细菌染色体外存在的一种是细菌染色体外存在的一种能够自我复制的双链闭合环状能够自我复制的双链闭合环状DNA分子，大分子，大小小1kb200kb。质粒常常带有一些特殊的基因，如致死基因，抗质粒常常带有一些特殊的基因，如致死基因
11、，抗抗生素的基因等等。抗生素的基因等等。一般质粒都含有一个复制起始区，可独立复制。一般质粒都含有一个复制起始区，可独立复制。质粒质粒DNA复制与宿主之间的关系，可分为复制与宿主之间的关系，可分为“严谨严谨型型”和和“松弛型松弛型”。“严谨型严谨型”质粒在每个细胞中质粒在每个细胞中的拷贝数通常的拷贝数通常13个，而个，而“松弛型松弛型”通常在通常在10个以个以上，可高达上，可高达200个拷贝。个拷贝。一般质粒通过改造后才能用于遗传工程。一般质粒通过改造后才能用于遗传工程。（一）（一）质粒质粒 pUC18可以克隆比较大的可以克隆比较大的DNA片段，在细胞片段，在细胞中产生中产生500个拷贝左右。个
12、拷贝左右。有一个多克隆位点，位于大肠杆菌的有一个多克隆位点，位于大肠杆菌的lacZ基基因之内，有利于筛选和分离转化细胞。因之内，有利于筛选和分离转化细胞。筛选的原理是：筛选的原理是：细细菌细胞含有野生质粒，菌细胞含有野生质粒，在含有在含有X-gal（5-溴溴-氯吲哚氯吲哚-半乳糖苷酶）半乳糖苷酶）的培养基上培养时产的培养基上培养时产生生兰色菌斑兰色菌斑；插入克；插入克隆片段后，隆片段后，lacZ基因基因失去功能，不能代谢失去功能，不能代谢X-gal，从而产生，从而产生白白色菌斑。色菌斑。（一）（一）质粒质粒（二）（二）病毒载体病毒载体 噬菌体基因组噬菌体基因组全长全长48kb。具有粘性末端。具
13、有粘性末端(cos位点位点)。中间约中间约1/3的的序列为中间基因簇序列为中间基因簇(central gene cluster)，两端为两端为DNA左、右臂。左、右臂。基因组的基因组的中间基因簇中间基因簇序列可被外源序列可被外源DNA片段片段取代取代,而不影响噬菌体而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑感染细菌及形成噬菌斑的能力。的能力。噬菌体噬菌体（二）（二）病毒载体病毒载体 噬菌体载体可接受噬菌体载体可接受15 kb-23 kb的外源的外源DNA片段，它既可作为克隆载体，也可作片段，它既可作为克隆载体，也可作为表达载体，广泛用于各类基因库的构建。为表达载体，广泛用于各类基因库的构建。(三三)克
14、隆大片段载体克隆大片段载体粘粒载体、细菌人工染色体和酵母人工染色体载体等。粘粒载体、细菌人工染色体和酵母人工染色体载体等。u粘粒载体粘粒载体（cosmid）是一类含有是一类含有cos位点的位点的质粒载体质粒载体.u兼有兼有噬菌体的高效噬菌体的高效感染能力和质粒的易于感染能力和质粒的易于克隆和选择的优点，克隆和选择的优点，既既能像质粒一样在寄主细能像质粒一样在寄主细胞内复制，又能象胞内复制，又能象DNA一样被包装到噬一样被包装到噬菌体颗粒中去。菌体颗粒中去。与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点：与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点：具有具有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠位点，能高
15、效地转化大肠杆菌，能在大肠杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制；杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制；有像质粒一样的选择标记；有像质粒一样的选择标记；cosmid载体比较小，但能插入较大的外源片段，可载体比较小，但能插入较大的外源片段，可克隆外源片段的长度在克隆外源片段的长度在1545 kb之间。之间。由于由于cosmid载体的大片段克隆能力，多载体的大片段克隆能力，多用于基用于基因组文库的构建，而因组文库的构建，而噬菌体载体多用于噬菌体载体多用于cDNA文库的构建文库的构建。已有多种粘粒载体可用于基因克。已有多种粘粒载体可用于基因克隆，隆，pJB8是最常用的粘粒载体之一是最常用的粘粒
16、载体之一粘粒载体粘粒载体细菌人工染色体细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）BAC载体是基于细菌的载体是基于细菌的性因子性因子(F因子因子)质粒质粒的的一些特点构建的。一些特点构建的。F因子在细菌接合时转移因子在细菌接合时转移1Mb的细菌染色体片段。将的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构因子经基因工程改良构成的成的BAC载体，可用于克隆载体，可用于克隆100 kb以上以上的的DNA片段。片段。带有外源片段的带有外源片段的BACBAC载体在细菌细胞中通常仅载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝，这一特点有利于保持单个拷贝，这一特点有利于保持DNAD
17、NA大分子，在大分子，在细胞内稳定复制而不发生重组。细胞内稳定复制而不发生重组。BACBAC载体本身分载体本身分子量小子量小，具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位具有氯霉素抗性选择基因及多克隆位点。点。酵母人工染色体酵母人工染色体（yeast artificial chromosome，YAC）酵母人工染色体酵母人工染色体具有自主复制序列、克隆具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。因。YAC可以接受可以接受1-2Mb的外源的外源DNA片段片段，这，这一特点使一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的
18、重要工具，并促进了发展人类隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体人工染色体(human artificial chromosome，HAC)的研究。的研究。三三 基因分离方法基因分离方法 基于基因库的分离基因方法基于基因库的分离基因方法 T-DNA标签克隆基因标签克隆基因 基于基于PCR的基因克隆的基因克隆 人工合成基因人工合成基因1 构建基因文库构建基因文库 基因文库基因文库(library)是一组是一组DNA和和cDNA序序列克隆的集合体。从基因文库中分离基因，列克隆的集合体。从基因文库中分离基因，首先要构建基因文库。只有利用合乎要求首先要构建基因文库。只有利用合乎要求的基因文库
19、才有可能筛选出所需要的基因，的基因文库才有可能筛选出所需要的基因，很多分子遗传学工作才能继续深入下去。很多分子遗传学工作才能继续深入下去。（一）（一）基于基因文库的分离基因方法基于基因文库的分离基因方法 核基因文库核基因文库 核基因文库核基因文库(genomic library或或genomic bank)是将某一生物的全部基因组是将某一生物的全部基因组DNA酶酶切后与载体连接构建而成的。切后与载体连接构建而成的。通常的方法是，尽量提取大分子量的核通常的方法是，尽量提取大分子量的核DNADNA，用限制性酶酶切后，分离选择具有，用限制性酶酶切后，分离选择具有一定长度一定长度(大于大于15kb)1
20、5kb)的的DNADNA片段，与适宜片段，与适宜的载体连接构成重组的载体连接构成重组DNADNA分子分子,选择相应选择相应的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒，的宿主细胞用于克隆。载体可以是质粒，噬菌体，噬菌体，BACBAC或或YACYAC等等（一）（一）基于基因库的分离基因方法基于基因库的分离基因方法 理想的核基因文库应当能包括全部的基因组理想的核基因文库应当能包括全部的基因组序列。如果每一个克隆包括的序列。如果每一个克隆包括的DNA片段大，则片段大，则总克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。总克隆数目少，常选择能接受较大片段的载体。检测是否包括一个完整的基因组序列的公式：检测是否包括一个完
21、整的基因组序列的公式：例例:人类基因组人类基因组3.0 x106kb,以以EMBL作载体，作载体，插入片段的平均长度为插入片段的平均长度为17 kb，p为为99%时时,基因基因库应有库应有8.1x105 个个 重组噬菌体。重组噬菌体。1.核基因库核基因库染色体基因库染色体基因库 将基因组的一部分（如一条染色体）用来构将基因组的一部分（如一条染色体）用来构建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结建基因库，对于选择特异基因及分析染色体结构和组织十分有价值。构和组织十分有价值。果蝇果蝇X X染色体上的一个片段，具有染色体上的一个片段，具有5050多个多线染色多个多线染色体带，利用微切割技术切割，抽提
22、体带，利用微切割技术切割，抽提DNADNA，构建染色体，构建染色体片段基因库。片段基因库。在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分拣技术在人类基因组项目研究中，利用流动细胞分拣技术将人类染色体分开，构建单个染色体基因库，大大将人类染色体分开，构建单个染色体基因库，大大加速了人类基因组作图和分析。加速了人类基因组作图和分析。在酵母菌中，利用一种改良的脉冲电泳方法，将酵在酵母菌中，利用一种改良的脉冲电泳方法，将酵母菌的母菌的1616条染色体据分开，用于构建染色体库。条染色体据分开，用于构建染色体库。cDNA库库 以以mRNA为模板，为模板，经反转录酶合成互补经反转录酶合成互补DNA(cDNA)，构建
23、的，构建的基因库基因库 cDNA库仅具有用于分离库仅具有用于分离mRNA的细胞或的细胞或组织内表达的基因的组织内表达的基因的mRNA序列，仅包括基序列，仅包括基因组的部分基因序列。因组的部分基因序列。构建什么样的基因库取决于研究目的。构建什么样的基因库取决于研究目的。cDNA 库对于研究基因的表达模式、分离某库对于研究基因的表达模式、分离某一特定基因是十分有用的。如分离在一特定基因是十分有用的。如分离在某一细某一细胞或组织高效表达的某种基因胞或组织高效表达的某种基因。通常是将通常是将cDNA库与核基因库配合使用，库与核基因库配合使用，以便既能得到基因的编码序列，又可得到基以便既能得到基因的编码
24、序列，又可得到基因的调控序列。因的调控序列。cDNA库库 2 筛选基因库筛选基因库 从基因库中筛选、分离基因，可据对待选从基因库中筛选、分离基因，可据对待选基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和条件。条件。常用方法是利用一段核苷酸序列常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA，cDNA或寡核苷酸或寡核苷酸)作探针作探针(probe)，用放射性，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，也可用同位素或非放射性同位素标记探针，也可用抗体作探针，筛选基因库。抗体作探针，筛选基因库。将重组噬菌体将重组噬菌体(来自基因库来自基因库)感感染的宿主细菌细胞与少量培养染的宿主细菌
25、细胞与少量培养基混合培养，噬菌体在宿主细基混合培养，噬菌体在宿主细胞内复制扩增后形成噬菌斑。胞内复制扩增后形成噬菌斑。将培养皿中的噬菌斑转到硝将培养皿中的噬菌斑转到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，变性，酸纤维素膜或尼龙膜上，变性，用标记的探针与膜上的噬菌体用标记的探针与膜上的噬菌体DNA杂交，杂交膜用杂交，杂交膜用X-光片放光片放射自显影，检测杂交信号。射自显影，检测杂交信号。与探针杂交的噬菌斑即为阳与探针杂交的噬菌斑即为阳性克隆。根据杂交信号的位置，性克隆。根据杂交信号的位置，找出培养皿中所对应的噬菌斑，找出培养皿中所对应的噬菌斑，培养，制备培养，制备DNA。菌斑杂交法筛选菌斑杂交法筛选噬菌体核基因
26、库噬菌体核基因库菌落杂交技术寻找目标菌落杂交技术寻找目标DNA克隆克隆从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行测序才能进行生物信息分析和功能预测。测序才能进行生物信息分析和功能预测。（三）序列测定和分析（三）序列测定和分析限制性酶图谱限制性酶图谱 一个一个15kb DNA片段的限制性酶图谱构建片段的限制性酶图谱构建实验过程：实验过程：首先将阳性克隆首先将阳性克隆DNADNA分装在分装在3 3个管中，分别用不个管中，分别用不同的同的酶及酶的组合酶及酶的组合酶切酶切DNADNA。酶切的产物用于。酶切的产物用于琼脂糖凝胶电泳，染色，在紫外灯下可见到琼脂糖凝胶电泳，染色
27、，在紫外灯下可见到DNADNA带。各条带的分子量大小可根据分子量标带。各条带的分子量大小可根据分子量标记估测记估测。限制性酶图谱限制性酶图谱 结果分析结果分析从凝胶电泳结果可见，从凝胶电泳结果可见，模式模式就是这个就是这个15kb DNA片段用片段用上述两种酶酶切后的限制性酶上述两种酶酶切后的限制性酶图谱。图谱。将不同将不同DNA用限制性酶消用限制性酶消化，产生的多态性，即化，产生的多态性，即限制性限制性酶片段长度的多态性酶片段长度的多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)，用来，用来分析分析DNA水平的变异程度，水平的变异程度，进行
28、基因组图谱分析进行基因组图谱分析。限制性酶图谱限制性酶图谱（二）（二）T-DNA标签克隆基因标签克隆基因基本原理：基本原理：利用利用T-DNA插入突变创造突变体，获得插入突变创造突变体，获得各突变体的纯合材料；各突变体的纯合材料；然后分析突变性状与然后分析突变性状与T-DNA的共分离关的共分离关系，存在共分离的材料用适当的系，存在共分离的材料用适当的PCR克隆克隆技术获得技术获得T-DNA的侧翼基因组序列；的侧翼基因组序列；用其作探针筛选基因文库，获取目标基用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析因或克隆，再进行下一步的分析。T-DNA 载体构建载体构建转化植物（转化植物
29、（T1，T-DNA杂合子杂合子)收获收获T2种子种子筛选筛选T2，获突变子，应为，获突变子，应为3:1分离分离确定确定T-DNA与突变型共分离的个体与突变型共分离的个体产生纯合后代产生纯合后代克隆克隆T-DNA两侧的植物两侧的植物DNA利用侧翼利用侧翼DNA序列作探针从该植物的序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因文库中钓取基因基因功能的验证基因功能的验证（三）基于（三）基于PCR的基因克隆的基因克隆基于基于PCR的的DNA克隆与基于载体的克隆技克隆与基于载体的克隆技术相比具有一定优越性。术相比具有一定优越性。PCR反应速度很快，可以在几个小时内反应速度很快，可以在几个小时内完成，而载体克
30、隆需要几周时间。完成，而载体克隆需要几周时间。PCR反应非常灵敏，可以用来扩增痕量反应非常灵敏，可以用来扩增痕量样品的样品的DNA。对于部分降解、甚至污染，用载体克隆对于部分降解、甚至污染，用载体克隆无法进行的无法进行的DNA样品，样品，PCR扩增仍可获得扩增仍可获得目的基因克隆目的基因克隆同源克隆同源克隆（四）（四）人工合成基因人工合成基因 根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核根据已知的基因或氨基酸序列，将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。很快地人工合成基因。例如，首先化学合成多个含有例如，首先化学合成
31、多个含有80-100个核苷酸的寡个核苷酸的寡核苷酸核苷酸，每个寡核苷酸之间具有，每个寡核苷酸之间具有19-24个核苷酸的重个核苷酸的重叠序列叠序列，再将各个寡核苷酸等量混合，在，再将各个寡核苷酸等量混合，在DNA聚合聚合酶酶(或或Taq酶酶)作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新作用下，各寡核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链，再用两个链，使单链部分补齐成为双链，再用两个PCR引物引物，经，经PCR扩增出扩增出DNA片段。若将两个片段。若将两个DNA片段放在片段放在一起，一起，经经SOE-PCR(sequence overlapped extension，SOE)扩增出完整的基因片段。
32、扩增出完整的基因片段。第第 3 节节 外源基因导入受体外源基因导入受体 一、重组一、重组DNA导入原核生物（细菌）导入原核生物（细菌）二、植物表达载体二、植物表达载体三、外源基因导入植物三、外源基因导入植物一、重组一、重组DNA导入原核生物（细菌）导入原核生物（细菌）CaCl2处理转化处理转化。CaCl2处理转化的机制尚不清楚，处理转化的机制尚不清楚，可能是可能是CaCl2处理破坏了细菌的细胞壁，使游离的处理破坏了细菌的细胞壁，使游离的DNA分子被摄入受体细胞。这种方法的转化频率大概分子被摄入受体细胞。这种方法的转化频率大概是千分之一。是千分之一。电激转化电激转化（electroporatio
33、n）。是目前常用的一种）。是目前常用的一种转化方式。在电转化仪施加的强电场的作用下，使受转化方式。在电转化仪施加的强电场的作用下，使受体细胞细胞壁具有可逆的电穿孔，体细胞细胞壁具有可逆的电穿孔，DNA分子进入细胞。分子进入细胞。结合（结合（conjugation）。结合是原核生物细胞与细胞。结合是原核生物细胞与细胞接触而进行遗传物质转移的一种自然过程。接触而进行遗传物质转移的一种自然过程。二、植物表达载体二、植物表达载体 Ti质粒质粒是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌细胞中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的受菌细胞中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的
34、受伤部位，使之产生冠瘿瘤伤部位，使之产生冠瘿瘤(grown gall tumors)。Ti 质粒。质粒。Ti质粒的一质粒的一部分部分DNA叫做叫做转移转移DNA（T-DNA），当，当T-DNA整合到宿主植物细胞的整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出染色体后，就诱导出根根瘤瘤，并使根瘤细胞合成，并使根瘤细胞合成冠瘿碱冠瘿碱(opine),作为土壤作为土壤农杆菌的碳源和氮源农杆菌的碳源和氮源。（1）T-DNA区（区（transferred-DNA regions）T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒质粒上导入植物细胞的一段上导入植物细胞的一段DNA。T-DNA两
35、端各有一段两端各有一段25bp的重复序列的重复序列(LB,RB)。T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基携带的致瘤基因是一些与激素合成有关的基因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态，因，由于激素合成基因使细胞处于不停的分裂状态，形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。形成冠瘿瘤，不能进行细胞分化。Ti质粒改造后才能应用于植物的基因工程。质粒改造后才能应用于植物的基因工程。保留保留T-DNA两端的末端序列，然后用外源两端的末端序列，然后用外源DNA插入或直插入或直接取代野生型接取代野生型T-DNA的部分基因，使转化的植物细的部分基因，使转化的植物细胞不具有成瘤能力。胞不具有成瘤能力。（2）
36、Vir区（区（virolence region）Vir区段上的基因与区段上的基因与T-DNA从细菌转移到植物细胞的遗从细菌转移到植物细胞的遗传过程有关传过程有关，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，区段上的基因能够使农杆菌表现出毒性，故称之为故称之为毒性区毒性区。Vir区段总长度大约区段总长度大约35kb，由，由7个互个互补群组成，分别命名为补群组成，分别命名为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和和VirH。（3）Con区区(regions encoding conjugations)该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因（t
37、ratra），），调控调控TiTi质粒在农杆菌之间的转移质粒在农杆菌之间的转移。（4）Ori区区(origin of replication)该区段基因调控该区段基因调控TiTi质粒的自我复制，故称之为质粒的自我复制，故称之为复制起复制起始区始区。Ti质粒分子受到信号分子的激活作用之后，质粒分子受到信号分子的激活作用之后，virD基因编码的一种核酸内切酶，先在基因编码的一种核酸内切酶，先在T-DNA的的RB序列中的第序列中的第3和第和第4碱基之间切开一碱基之间切开一个个单链单链缺口，随后在缺口，随后在T-DNA同一条链的同一条链的LB序序列中切出第二个单链缺口。列中切出第二个单链缺口。T-DN
38、A便以便以单链形式单链形式释放出来，并在释放出来，并在RB序序列的引导下定向地转移到寄主植物细胞。列的引导下定向地转移到寄主植物细胞。在有关的植物细胞酶体系的催化作用下，合在有关的植物细胞酶体系的催化作用下，合成互补链形成双链形式的成互补链形成双链形式的T-DNA分子。分子。在一在一系列酶的参与下整合进植物基因组。这种整合系列酶的参与下整合进植物基因组。这种整合是一种非正常重组。是一种非正常重组。T-DNA转移的机制转移的机制（1）双元载体系统（）双元载体系统（binary vector）具有两个质粒具有两个质粒穿梭质粒和穿梭质粒和Ti质粒。质粒。（2）共整合载体（）共整合载体（integra
39、ted vector）共整合载体系统包括在共整合载体系统包括在T-DNA上的激素合成上的激素合成区经过突变后的区经过突变后的Ti质粒和中间载体两部分。质粒和中间载体两部分。Ti质粒的衍生载体质粒的衍生载体发根农杆菌存在另一种质粒，发根农杆菌存在另一种质粒，Ri质粒。质粒。Ri质粒也可完成外源基因向植物的转移工作。质粒也可完成外源基因向植物的转移工作。发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根，也称为发状根，分别简称为毛根之为毛状根，也称为发状根，分别简称为毛根或发根，
40、或发根，Ri质粒为根诱导质粒。质粒为根诱导质粒。Ri质粒的结构与质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以质粒的结构很相似，可以分为分为T区、区、vir区、区、ori区和其它区域等几个部区和其它区域等几个部分。分。Ri质粒质粒T区与区与Ti质粒的质粒的T-DNA十分相似：十分相似：T区的左右边界序列。左右边界上含有区的左右边界序列。左右边界上含有25bp的重复序列。的重复序列。TL-DNA区。该区中含有与毛状根形成有区。该区中含有与毛状根形成有关的关的rolA、B、C、D基因群。基因群。TR-DNA区。该区中含有与农杆碱合成有区。该区中含有与农杆碱合成有关的基因（关的基因（ags）和生长素合成有关
41、的基因）和生长素合成有关的基因（tms1、tms2）。）。ags基因在转化的初期起基因在转化的初期起着重要的作用，是着重要的作用，是不定根产生的关键不定根产生的关键Ri质粒质粒高等植物基因遗传转化的方法为两类：高等植物基因遗传转化的方法为两类：u非生物载体介导的遗传转化非生物载体介导的遗传转化种质转化系统种质转化系统是以植物自身的生殖系统种质细是以植物自身的生殖系统种质细胞为受体进行的转化，如花粉浸泡外源胞为受体进行的转化，如花粉浸泡外源DNADNA、DNADNA注射受粉后的子房等；注射受粉后的子房等；直接转化直接转化是采用物理或化学方法直接将外源基是采用物理或化学方法直接将外源基因导入受体细
42、胞，如基因枪法等。因导入受体细胞，如基因枪法等。u生物载体介导的遗传转化。生物载体介导的遗传转化。在生物载体介导的转基因中，农杆菌介导的转在生物载体介导的转基因中，农杆菌介导的转基因是常用的方法基因是常用的方法。三、外源基因导入植物三、外源基因导入植物需要具备如下条件：需要具备如下条件：高效的植株再生体系。高效的植株再生体系。选择容易从体细胞再生植选择容易从体细胞再生植株的受体基因型是获得转化成功的关键。株的受体基因型是获得转化成功的关键。受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。受体植物细胞对农杆菌要有很高的亲和力。一般一般认为受体细胞应处于高度的分裂状态，认为受体细胞应处于高度的分裂状态，T-
43、DNA才能才能插入植物基因组；插入植物基因组；具有有效的选择系统。具有有效的选择系统。必须有一个理想的选择方必须有一个理想的选择方法将转化细胞从非转化细胞中选择出来；法将转化细胞从非转化细胞中选择出来；稳定的转化技术和基因表达。稳定的转化技术和基因表达。外源基因转入植物外源基因转入植物后应能传代并稳定表达。后应能传代并稳定表达。（一）农杆菌法（一）农杆菌法一般技术程序一般技术程序农杆菌侵染植物细胞、细菌与植物细胞农杆菌侵染植物细胞、细菌与植物细胞共培养、在筛选培养基上筛选、获得转化共培养、在筛选培养基上筛选、获得转化细胞克隆、转化细胞分化并再生植株。细胞克隆、转化细胞分化并再生植株。叶圆盘转化
44、法。带有伤口的植物叶片的叶圆盘转化法。带有伤口的植物叶片的圆盘。使用的外植体可以是叶圆盘、下胚圆盘。使用的外植体可以是叶圆盘、下胚轴、胚性愈伤组织等。轴、胚性愈伤组织等。（一）农杆菌法（一）农杆菌法F1.共培养2.在选择培养基上筛选3.筛选获得的抗性愈伤 5.胚萌发成苗6.转基因植株移栽大田4.抗性愈伤分化成胚状体选择是为了将转化细胞与非转化细胞区分开，选择是为了将转化细胞与非转化细胞区分开，使转化细胞具有生长优势。在构建载体时，使转化细胞具有生长优势。在构建载体时，往往在目的基因上连上一个选择标记基因。往往在目的基因上连上一个选择标记基因。通常使用的是抗生素抗性基因，如通常使用的是抗生素抗性
45、基因，如NPTNPTIIII基基因因新霉素磷酸转移酶基因，能分解卡那新霉素磷酸转移酶基因，能分解卡那霉素等抗生素。霉素等抗生素。其它选择标记基因，如抗除草剂基因，报告其它选择标记基因，如抗除草剂基因，报告基因（如：基因（如：GUSGUS基因）等。基因）等。选择系统选择系统（一）农杆菌法（一）农杆菌法u基因枪法（基因枪法（gene gun）是依赖高速的）是依赖高速的金属微粒将外源基因金属微粒将外源基因导入活细胞的一种转导入活细胞的一种转化技术。化技术。（二）基因枪介法（二）基因枪介法优点优点：（1 1）无宿主限制。可以对任何基因无宿主限制。可以对任何基因型材料进行转化研究；型材料进行转化研究；(
46、2)(2)靶受体几乎包括所靶受体几乎包括所有具有潜在分化能力的组织或细胞。有具有潜在分化能力的组织或细胞。（3 3）易）易于操作。于操作。缺点：缺点：如转化频率低、嵌合体较多、结果的如转化频率低、嵌合体较多、结果的重复性差，转化的外源基因以多拷贝居多，易重复性差，转化的外源基因以多拷贝居多，易导致基因沉默，实验成本较高等。导致基因沉默，实验成本较高等。还有很多将外源基因引入植物基因组的方法，还有很多将外源基因引入植物基因组的方法，如电激法、花粉管通道法、超声波法等，它们如电激法、花粉管通道法、超声波法等，它们都在不同程度上得到应用。都在不同程度上得到应用。（二）基因枪法（二）基因枪法第第4节节
47、 转基因生物的检测与鉴定转基因生物的检测与鉴定一、分子检测一、分子检测二、二、生物学性状鉴定生物学性状鉴定PCRSouthern杂交杂交Northern杂交杂交Western杂交杂交常用的转基因生物分子检测手段有常用的转基因生物分子检测手段有一、分子检测一、分子检测PCR检测检测PCR检测外源基因的原理是根据被转移的外源检测外源基因的原理是根据被转移的外源基因（目的基因或选择标记基因）设计引物，基因（目的基因或选择标记基因）设计引物，扩增外源基因的片段。如果扩增出的片段与设扩增外源基因的片段。如果扩增出的片段与设计的一对引物之间的实际片段在长度上相吻合，计的一对引物之间的实际片段在长度上相吻合
48、，说明基因已转入受体细胞。说明基因已转入受体细胞。在进行在进行PCR检测时应设两个对照：阳性对照即质粒检测时应设两个对照：阳性对照即质粒DNA和阴性对照即非转基因材料的和阴性对照即非转基因材料的DNA。PCR扩增结果只能初步确定转基因材料的真实性，扩增结果只能初步确定转基因材料的真实性，并不能完全确信。容易出现假阳性，通常需要进一步并不能完全确信。容易出现假阳性，通常需要进一步用用Southern杂交才能证实。杂交才能证实。转基因棉花选择标记基因转基因棉花选择标记基因NPTII编码区段的编码区段的PCR扩增结果（扩增结果（M为分子量标准，为分子量标准，C为非转为非转基因植株，基因植株，P为质粒
49、对照，为质粒对照，1-20为转基因植为转基因植株）株）Southern杂交杂交(Southern blotting)将将DNA用限制性酶酶切用限制性酶酶切酶切酶切DNA电泳电泳变性变性转移到膜上转移到膜上经过标记的经过标记的DNA探针与探针与膜上的膜上的DNA片段杂交片段杂交洗去膜上非特异性结洗去膜上非特异性结合的探针合的探针检测杂交信号检测杂交信号。如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部如果转移的膜上具有与杂交探针相同或部分同源的序列，就会检测到杂交带信号。分同源的序列，就会检测到杂交带信号。SOUTHERN.EXEM 1 2 3 4 5 6 7 8 9kb23.1-9.4-6.6-4.4-2
50、.3-2.0-转基因棉花的转基因棉花的Southern杂交检测（杂交检测（M为为分子量标准，分子量标准，1为阳性对照，为阳性对照，2为阴性对为阴性对照，照，3-8为转基因植株）为转基因植株）NorthernNorthern杂交是一种杂交是一种RNA-DNARNA-DNA杂交。杂交。将提取的植物总将提取的植物总RNA或或mRNA用变性凝用变性凝胶电泳分离，则不同的胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子分子将按分子量大小依次排布在凝胶上；量大小依次排布在凝胶上；将它们原位转移到固相膜上；在适宜的离将它们原位转移到固相膜上；在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交；子强度及温度条件下，用探针与膜
