1、二 微生物的选择培养和计数 必备知识必备知识素养奠基素养奠基 一、选择培养基一、选择培养基 1.1.实验室中微生物筛选的原理实验室中微生物筛选的原理: :人为提供有利于人为提供有利于_生长的条件生长的条件( (包括营养、包括营养、 温度、温度、pHpH等等),),同时同时_或或_其他微生物的生长。其他微生物的生长。 2.2.选择培养基概念选择培养基概念: :在微生物学中在微生物学中, ,允许允许_的微生物生长的微生物生长, ,同时同时 _其他种类微生物生长的培养基。其他种类微生物生长的培养基。 3.3.选择培养基配方的设计选择培养基配方的设计: : (1)(1)原理原理: :分解尿素的细菌合成
2、的脲酶将尿素分解产生分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解产生_。 (2)(2)培养基配方设计培养基配方设计: :以以_为唯一氮源的选择培养基。为唯一氮源的选择培养基。 目的菌目的菌 抑制抑制 阻止阻止 特定种类特定种类 抑制或阻止抑制或阻止 NHNH3 3 尿素尿素 【激疑激疑】如果要从土壤中分离出固氮微生物如果要从土壤中分离出固氮微生物, ,那么对培养基有什么要求呢那么对培养基有什么要求呢? ? 提示提示: :固氮微生物能利用空气中的固氮微生物能利用空气中的N N2 2, ,因此培养基中不应添加氮源因此培养基中不应添加氮源, ,这样就只有这样就只有 固氮微生物才能生存。固氮微生物才能生存。 二
3、、微生物的选择培养二、微生物的选择培养 1.1.方法方法: :对样品进行充分稀释对样品进行充分稀释, ,然后将然后将_涂布到制备好的涂布到制备好的_培养基上。培养基上。 2.2.稀释涂布平板法的操作过程稀释涂布平板法的操作过程: : (1)_(1)_稀释操作稀释操作: : 菌液菌液 选择选择 系列梯度系列梯度 (2)(2)涂布平板操作。涂布平板操作。 取菌液取菌液: :取取_菌液菌液, ,添加到添加到_。 涂布器灭菌涂布器灭菌: :取出浸在取出浸在_中的涂布器中的涂布器, ,放在放在_上燃烧上燃烧, ,酒精燃尽后酒精燃尽后, , _涂布器。涂布器。 涂布过程涂布过程: :用涂布器将菌液用涂布器
4、将菌液_地涂布在培养基表面地涂布在培养基表面, ,涂布时可涂布时可_培养皿培养皿, , 使菌液分布使菌液分布_。 3.3.培养培养: :待涂布的菌液被培养基吸收后待涂布的菌液被培养基吸收后, ,将平板将平板_,_,放入放入_中培养中培养, , 观察。观察。 0.1mL0.1mL 培养基表面培养基表面 酒精酒精 火焰火焰 冷却冷却 均匀均匀 转动转动 均匀均匀 倒置倒置 恒温培养箱恒温培养箱 【激疑激疑】在进行稀释操作时在进行稀释操作时, ,需要在酒精灯火焰附近操作吗需要在酒精灯火焰附近操作吗? ?解释原因。解释原因。 提示提示: :需要。在进行稀释操作时需要。在进行稀释操作时, ,如果不在酒精
5、灯火焰附近进行如果不在酒精灯火焰附近进行, ,就有可能造成就有可能造成 杂菌污染。杂菌污染。 三、微生物的数量测定三、微生物的数量测定 1.1.稀释涂布平板法稀释涂布平板法: : (1)(1)统计依据。统计依据。 当样品的当样品的_足够高时足够高时, ,培养基表面生长的一个菌落培养基表面生长的一个菌落, ,来源于样品稀释液中来源于样品稀释液中 的一个的一个_。通过统计平板上的菌落数。通过统计平板上的菌落数, ,就能推测出样品中大约含有多少活就能推测出样品中大约含有多少活 菌。菌。 (2)(2)操作。操作。 一般选择菌落数为一般选择菌落数为_的平板进行计数。的平板进行计数。 选用选用_的样品液进
6、行培养的样品液进行培养, ,在同一稀释度下在同一稀释度下, ,应至少对应至少对_个平板进个平板进 行重复计数行重复计数, ,然后求然后求_。 稀释度稀释度 活菌活菌 3030300300 一定稀释范围一定稀释范围 3 3 平均值平均值 2.2.显微镜直接计数显微镜直接计数: :利用特定的细菌计数板或利用特定的细菌计数板或_,_,在显微镜下观在显微镜下观 察、察、_,_,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。 血细胞计数板血细胞计数板 计数计数 四、探究四、探究实践实践土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.1.提出问题提出
7、问题: :如何如何_土壤中分解尿素的细菌土壤中分解尿素的细菌? ?每克土壤样品中含有多少分解每克土壤样品中含有多少分解 尿素的细菌尿素的细菌? ? 分离分离 2.2.基础知识基础知识: : 组分组分 含量含量 提供的主要营养提供的主要营养 KHKH2 2POPO4 4 1.4 g1.4 g _ NaNa2 2HPOHPO4 4 2.1 g2.1 g MgSOMgSO4 4 7H7H2 2O O 0.2 g0.2 g 葡萄糖葡萄糖 10.0 g10.0 g _ 尿素尿素 1.0 g1.0 g _ 琼脂琼脂 15.0 g15.0 g _ H H2 2O O 定容至定容至 1 000 mL1 000
8、 mL 水水 无机盐无机盐 碳源碳源 氮源氮源 凝固剂凝固剂 3.3.实验设计实验设计: : (1)(1)土壤取样土壤取样: :先铲去先铲去_,_,取距地表取距地表_cm的土壤层的土壤层, ,将样品装入将样品装入_中。中。 (2)(2)样品稀释样品稀释: :一般选用一般选用_倍的稀释液进行平板培养。倍的稀释液进行平板培养。 (3)(3)微生物的培养与观察微生物的培养与观察: :一般在一般在_的温度下培养的温度下培养1 12 2天天, ,每隔每隔_统计统计 一次菌落数目一次菌落数目, ,选取选取_时的记录作为结果。时的记录作为结果。 表层土表层土 3 38 8 纸袋纸袋 1 110104 4、1
9、 110105 5、1 110106 6 30303737 24h24h 菌落数目稳定菌落数目稳定 4.4.操作操作提示提示: : 选出下列关于实验操作的正确说法选出下列关于实验操作的正确说法_。 本实验耗时长本实验耗时长, ,应提前制订好计划应提前制订好计划, ,提高效率。提高效率。 本实验用到的器材比较多本实验用到的器材比较多, ,应该对试管和平板做好标记。应该对试管和平板做好标记。 取土样的铁铲和取样纸袋使用前都要经过消毒。取土样的铁铲和取样纸袋使用前都要经过消毒。 为了防止杂菌污染为了防止杂菌污染, ,从酒精中取出的涂布器应该直接在酒精灯火焰上充分燃从酒精中取出的涂布器应该直接在酒精灯
10、火焰上充分燃 烧灭菌。烧灭菌。 过热的涂布器不能直接放在盛有酒精的烧杯中。过热的涂布器不能直接放在盛有酒精的烧杯中。 5.5.结果分析与评价结果分析与评价: : 结合实验过程结合实验过程, ,判断下列实验分析的正误判断下列实验分析的正误: : (1)(1)由于使用了选择培养基由于使用了选择培养基, ,因此本实验不需要设置对照组。因此本实验不需要设置对照组。 ( )( ) 提示提示: :应该设置未接种的平板和接种在牛肉膏蛋白胨培养基的平板作为对照。应该设置未接种的平板和接种在牛肉膏蛋白胨培养基的平板作为对照。 (2)(2)在同一稀释度下在同一稀释度下, ,至少要涂布至少要涂布3 3个平板。个平板
11、。 ( )( ) (3)(3)当菌落数目稳定时当菌落数目稳定时, ,选取菌落数在选取菌落数在 3030300 300 的平板进行计数。的平板进行计数。 ( )( ) (4)(4)应该仔细观察培养基上菌落的形状、大小、颜色等特征应该仔细观察培养基上菌落的形状、大小、颜色等特征, ,并要做好记录。并要做好记录。 ( )( ) (5)(5)统计的分解尿素的细菌菌落数目就是样品中分解尿素的活菌数目。统计的分解尿素的细菌菌落数目就是样品中分解尿素的活菌数目。( )( ) 提示提示: :统计的菌落数目还要经过计算才能代表样品中的活菌数目统计的菌落数目还要经过计算才能代表样品中的活菌数目, ,而且数目偏而且
12、数目偏 低低, ,因为当两个或多个细菌连在一起时因为当两个或多个细菌连在一起时, ,平板上观察到的只是一个菌落。平板上观察到的只是一个菌落。 【激疑激疑】选择培养基上生长分解尿素的细菌之后选择培养基上生长分解尿素的细菌之后,pH,pH会发生变化吗会发生变化吗? ?解释原因。解释原因。 提示提示: :会升高。分解尿素的细菌可以将尿素分解成会升高。分解尿素的细菌可以将尿素分解成NHNH3 3, ,导致培养基的导致培养基的pHpH升高。升高。 关键能力关键能力素养形成素养形成 知识点一知识点一 微生物的选择培养与计数方法微生物的选择培养与计数方法 1.1.选择培养的目的选择培养的目的: :从众多微生
13、物中分离出需要的特定微生物。从众多微生物中分离出需要的特定微生物。 2.2.筛选微生物常用培养基筛选微生物常用培养基选择培养基和鉴别培养基选择培养基和鉴别培养基: : 选择培养基选择培养基 鉴别培养基鉴别培养基 特殊特殊 成分成分 控制某一条件控制某一条件( (如唯一如唯一 氮源氮源) )或加入某种物质或加入某种物质 ( (如青霉素如青霉素) ) 加入某种指示剂或化学药品加入某种指示剂或化学药品 目的目的 抑制其他微生物生长抑制其他微生物生长, , 促进目的微生物的生长促进目的微生物的生长 与微生物的代谢产物或培养基中的成与微生物的代谢产物或培养基中的成 分发生特定反应分发生特定反应 用途用途
14、 培养、分离出特定微生培养、分离出特定微生 物物 鉴别不同的微生物鉴别不同的微生物 举例举例 培养酵母菌和霉菌培养酵母菌和霉菌, ,可可 在培养基中加入青霉素在培养基中加入青霉素, , 抑制细菌生长抑制细菌生长; ;用以尿用以尿 素为唯一氮源的培养基素为唯一氮源的培养基 来培养尿素分解菌来培养尿素分解菌 可用伊红可用伊红美蓝培养基鉴定饮用水或美蓝培养基鉴定饮用水或 乳制品中是否有大肠杆菌乳制品中是否有大肠杆菌( (若有若有, ,菌落菌落 呈深紫色呈深紫色, ,并带有金属光泽并带有金属光泽) ) 3.3.稀释涂布平板法稀释涂布平板法: : (1)(1)主要操作环节主要操作环节: :系列梯度稀释和
15、涂布平板。系列梯度稀释和涂布平板。 (2)(2)系列梯度稀释和涂布平板后培养结果如图所示系列梯度稀释和涂布平板后培养结果如图所示: : (3)(3)计算公式计算公式: : 每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数= = 稀释倍数稀释倍数 (4)(4)计数结果计数结果: :由于当两个或多个细胞连在一起时由于当两个或多个细胞连在一起时, ,平板上观察到的只是一个菌平板上观察到的只是一个菌 落落, ,计算结果比实际值偏小。计算结果比实际值偏小。 4.4.稀释涂布平板法操作注意问题稀释涂布平板法操作注意问题: : (1)(1)稀释操作时稀释操作时: :每支试管及其中的每支试管及其中的9 mL9 mL水、移
16、液管等均需灭菌水、移液管等均需灭菌; ;操作时操作时, ,试管口试管口 和移液管应在离火焰和移液管应在离火焰1 12 cm 2 cm 处。处。 (2)(2)涂布平板时。涂布平板时。 涂布器浸在体积分数为涂布器浸在体积分数为70%70%的酒精中的酒精中, ,取出时取出时, ,让多余酒精在烧杯中滴尽让多余酒精在烧杯中滴尽, ,然后然后 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。 不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中, ,以免引燃其中的酒精。以免引燃其中的酒精。 酒精灯与培养皿距离要合适酒精灯与培养皿距离要合适, ,移液管管头不接
17、触任何物体。移液管管头不接触任何物体。 (3)(3)同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上, ,经涂布、培养经涂布、培养, ,计算出菌计算出菌 落平均数。落平均数。 5.5.两种纯化方法的比较两种纯化方法的比较: : 主要方法主要方法 平板划线法平板划线法 稀释涂布平板法稀释涂布平板法 主要主要 步骤步骤 接种环在固体培养接种环在固体培养 基表面连续划线基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作系列梯度稀释操作和涂布平板操作 接种工具接种工具 接种环接种环 涂布器涂布器 菌体获取菌体获取 在具有显著的菌落在具有显著的菌落 特征的区域挑取菌特征的
18、区域挑取菌 体体 从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体 能否用能否用 于计数于计数 不能计数不能计数 可以计数可以计数, ,但是操作复杂但是操作复杂, ,需涂布多个平板需涂布多个平板 共同点共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面都能将微生物分散到固体培养基表面, ,以获得单细胞菌落以获得单细胞菌落, ,达到达到 分离纯化微生物的目的分离纯化微生物的目的, ,也可用于观察菌落特征也可用于观察菌落特征 6.6.显微镜直接计数显微镜直接计数: : (1)(1)原理原理: :此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板, ,在显微镜
19、下计算一定体在显微镜下计算一定体 积的样品中微生物的数量。积的样品中微生物的数量。 (2)(2)方法方法: :显微镜下观察显微镜下观察, ,细菌计数板或血细胞计数板计数。细菌计数板或血细胞计数板计数。 (3)(3)计算公式计算公式: : 每毫升原液所含细菌数每毫升原液所含细菌数= =每小格平均细菌数每小格平均细菌数40040010 00010 000稀释倍数稀释倍数 (4)(4)缺点缺点: :统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和, ,计算结果比实际值偏大。计算结果比实际值偏大。 【素养案例素养案例】 (2020(2020全国全国卷卷) )某种物质某种物质S(
20、S(一种含有一种含有C C、H H、N N的有机物的有机物) )难以降解难以降解, ,会对环境会对环境 造成污染造成污染, ,只有某些细菌能降解只有某些细菌能降解S S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得 到能高效降解到能高效降解S S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基, ,甲的组分为无甲的组分为无 机盐、水和机盐、水和S,S,乙的组分为无机盐、水、乙的组分为无机盐、水、S S和和Y Y。 回答下列问题回答下列问题: : (1)(1)实验时实验时, ,盛有水或培养基的摇瓶通常采用盛有水或培养基的摇瓶通
21、常采用_的方法进行的方法进行 灭菌。乙培养基中的灭菌。乙培养基中的Y Y物质是物质是_。甲、乙培养基均属于。甲、乙培养基均属于 _培养基。培养基。 (2)(2)实验中初步估测摇瓶实验中初步估测摇瓶M M中细菌细胞数为中细菌细胞数为2 210107 7 个 个/mL,/mL,若要在每个平板上涂布若要在每个平板上涂布 100 100 L L 稀释后的菌液稀释后的菌液, ,且保证每个平板上长出的菌落数不超过且保证每个平板上长出的菌落数不超过200200个个, ,则至少则至少 应将摇瓶应将摇瓶M M中的菌液稀释中的菌液稀释_倍。倍。 (3)(3)在步骤的筛选过程中在步骤的筛选过程中, ,发现当培养基中
22、的发现当培养基中的S S超过某一浓度时超过某一浓度时, ,某菌株对某菌株对S S的的 降解量反而下降降解量反而下降, ,其原因可能是其原因可能是_( (答出答出1 1点点 即可即可) )。 (4)(4)若要测定淤泥中能降解若要测定淤泥中能降解S S的细菌细胞数的细菌细胞数, ,请写出主要实验步骤请写出主要实验步骤 _。 (5)(5)上述实验中上述实验中, ,甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同, ,但都能为细菌的生但都能为细菌的生 长提供长提供4 4类营养物质类营养物质, ,即即_。 【解析解析】本题主要考查培养基的类型及其应用、无菌技术和微生物的分离与计本
23、题主要考查培养基的类型及其应用、无菌技术和微生物的分离与计 数。数。 (1)(1)常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶。由图中过程可知常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶。由图中过程可知, ,甲甲 为液体培养基为液体培养基, ,乙为固体培养基乙为固体培养基, ,所以乙培养基中需要加入的所以乙培养基中需要加入的Y Y为琼脂。甲和乙为琼脂。甲和乙 培养基可以用于筛选能降解培养基可以用于筛选能降解S S的菌株的菌株, ,因此均属于选择培养基。因此均属于选择培养基。 (2)(2)若要在每个平板上涂布若要在每个平板上涂布100 L100 L稀释后的菌液稀释后的菌液, ,且每个平板上长出的菌落
24、数且每个平板上长出的菌落数 不超过不超过200200个个, ,根据计算公式根据计算公式: :细菌细胞数细菌细胞数=(=(C CV V) )M M可知可知, ,稀释倍数稀释倍数 M M=2=2107107V VC C=2=210710710001000100100200=104(200=104(倍倍) )。 (3)(3)当培养基中的当培养基中的S S超过某一浓度后超过某一浓度后, ,可能会抑制菌株的生长可能会抑制菌株的生长, ,从而造成其对从而造成其对S S的的 降解量下降。降解量下降。 (4)(4)要测定淤泥中能降解要测定淤泥中能降解S S的细菌的细胞数的细菌的细胞数, ,可以取淤泥加无菌水制
25、成菌悬液可以取淤泥加无菌水制成菌悬液, ,稀稀 释涂布到乙培养基上释涂布到乙培养基上, ,培养后进行计数。培养后进行计数。 (5)(5)甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源等成分。甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源等成分。 答案答案: :(1)(1)高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌 琼脂琼脂 选择选择 (2)104(2)104 (3)S(3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长 (4)(4)取淤泥加入无菌水取淤泥加入无菌水, ,涂布涂布( (或稀释涂布或稀释涂布) )到乙培养基上到乙培养基上, ,培养后计数培养后计数 (5)(5)水、碳源、氮源和无机盐水、碳
26、源、氮源和无机盐 【误区警示误区警示】稀释涂布平板法分离微生物常见误区稀释涂布平板法分离微生物常见误区 (1)(1)误认为不用涂布均匀误认为不用涂布均匀: :用涂布器涂布平板时一定要涂布均匀用涂布器涂布平板时一定要涂布均匀, ,否则难以得到否则难以得到 单菌落。单菌落。 (2)(2)误认为不用冷却误认为不用冷却: :涂布器使用前应进行酒精浸泡涂布器使用前应进行酒精浸泡, ,然后灼烧灭菌然后灼烧灭菌, ,冷却之后再冷却之后再 涂布涂布, ,否则会由于温度过高杀死菌种。否则会由于温度过高杀死菌种。 【素养素养迁移迁移】 (2020(2020枣庄高二检测枣庄高二检测) )筛选是分离和培养微生物新类型
27、常用的手段筛选是分离和培养微生物新类型常用的手段, ,下列有关下列有关 技术中不能筛选成功的是技术中不能筛选成功的是 ( ( ) ) A.A.在全营养的在全营养的LBLB培养基培养基( (普通培养基普通培养基) )中中, ,筛选大肠杆菌筛选大肠杆菌 B.B.在尿素固体培养基中在尿素固体培养基中, ,筛选能够分解尿素的微生物筛选能够分解尿素的微生物 C.C.用纤维素为唯一碳源的培养基用纤维素为唯一碳源的培养基, ,筛选能分解纤维素的微生物筛选能分解纤维素的微生物 D.D.在培养基中加入不同浓度的氯化钠在培养基中加入不同浓度的氯化钠, ,筛选抗盐突变体的微生物筛选抗盐突变体的微生物 【解析解析】选
28、选A A。在全营养的。在全营养的LBLB培养基中培养基中, ,几乎所有细菌都能生长几乎所有细菌都能生长, ,不能筛选出大不能筛选出大 肠杆菌肠杆菌,A,A错误错误; ;在尿素固体培养基中在尿素固体培养基中, ,只有能分解尿素的微生物才能生长只有能分解尿素的微生物才能生长, ,不能不能 分解尿素的微生物因缺乏氮源不能生长分解尿素的微生物因缺乏氮源不能生长, ,能够筛选分解尿素的微生物能够筛选分解尿素的微生物,B,B正确正确; ;在在 纤维素为唯一碳源的培养基上纤维素为唯一碳源的培养基上, ,只有能分解纤维素的微生物才能生长只有能分解纤维素的微生物才能生长, ,不能分解不能分解 纤维素的微生物因缺
29、乏碳源不能生长纤维素的微生物因缺乏碳源不能生长, ,能筛选分解纤维素的微生物能筛选分解纤维素的微生物,C,C正确正确; ;在培在培 养基中加入不同浓度的氯化钠养基中加入不同浓度的氯化钠, ,能筛选抗盐突变体微生物能筛选抗盐突变体微生物,D,D正确。正确。 【补偿训练补偿训练】 下列关于测定土壤中微生物数量的叙述下列关于测定土壤中微生物数量的叙述, ,不正确的是不正确的是 ( ( ) ) A.A.显微镜直接计数计算的结果比实际值偏大显微镜直接计数计算的结果比实际值偏大 B.B.当样品的稀释度足够高时当样品的稀释度足够高时, ,一个活菌会形成一个菌落一个活菌会形成一个菌落 C.C.采用平板计数法获
30、得的菌落数往往少于实际的活菌数采用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的活菌数 D.D.统计菌落数目时统计菌落数目时, ,只要菌落数目在只要菌落数目在3030300300的平板都可以计数的平板都可以计数, ,并以它们的平并以它们的平 均值作为统计结果均值作为统计结果 【解析解析】选选D D。显微镜直接计数统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和。显微镜直接计数统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和, ,计算计算 结果比实际值偏大结果比实际值偏大,A,A正确正确; ;当样品的稀释度足够高时当样品的稀释度足够高时, ,一个活菌会形成一个菌一个活菌会形成一个菌 落落,B,B正确正确; ;采用平板计数法获得的
31、菌落有可能是由多个细菌形成的采用平板计数法获得的菌落有可能是由多个细菌形成的, ,所以往往少所以往往少 于实际的活菌数于实际的活菌数,C,C正确正确; ;统计菌落数目时统计菌落数目时, ,应选择同一稀释倍数下涂布的菌落数应选择同一稀释倍数下涂布的菌落数 量为量为3030300300之间的平板进行计数之间的平板进行计数,D,D错误。错误。 知识点二知识点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 1.1.分离菌种的原理分离菌种的原理: : 在以尿素为唯一氮源的选择培养基上在以尿素为唯一氮源的选择培养基上, ,只有能产生脲酶的微生物才能分解尿素只有能产生脲酶的微生物才能分
32、解尿素, , 而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素, ,会因缺乏氮源而无法生长繁殖。会因缺乏氮源而无法生长繁殖。 2.2.实验流程示意图实验流程示意图: : 3.3.实验操作过程实验操作过程: : 流程流程 具体操作具体操作 操作提示操作提示 土壤取样土壤取样 先铲去表层土先铲去表层土, ,取距地取距地 表表 3 38 cm8 cm的土壤层的土壤层, , 将样品装入纸袋中将样品装入纸袋中 适宜在富含有机质适宜在富含有机质, , 酸碱度接近中性的潮湿酸碱度接近中性的潮湿 土壤中取样土壤中取样 取样用的铁铲和取样取样用的铁铲和取样 的纸袋使用前都需要灭的纸袋使用前都
33、需要灭 菌菌 制备制备 培养基培养基 分别配制牛肉膏蛋白胨分别配制牛肉膏蛋白胨 培养基和以尿素为唯一培养基和以尿素为唯一 氮源的选择培养基氮源的选择培养基 牛肉膏蛋白胨培养基作牛肉膏蛋白胨培养基作 为对照组为对照组, ,用来判断选用来判断选 择培养基是否具有选择择培养基是否具有选择 的作用的作用 流程流程 具体操作具体操作 操作提示操作提示 样品的稀释样品的稀释 和涂布和涂布 火焰旁称取土壤样本火焰旁称取土壤样本 将稀释倍数为将稀释倍数为10103 310107 7的的 稀释液涂布平板。每个稀释稀释液涂布平板。每个稀释 度至少涂布三个平板作为重度至少涂布三个平板作为重 复组复组 注意无菌操作注
34、意无菌操作 对所用的平板、试管做好对所用的平板、试管做好 标记标记 初次实验对于稀释的范围初次实验对于稀释的范围 没有把握没有把握, ,可选择一个较为宽可选择一个较为宽 泛范围泛范围10103 310107 7倍的稀释液倍的稀释液 流程流程 具体操作具体操作 操作提示操作提示 培养、观察培养、观察 和计数和计数 将涂布好的平板和空白平将涂布好的平板和空白平 板放在适宜温度下的培养箱板放在适宜温度下的培养箱 中倒置培养中倒置培养 每隔每隔24 h24 h统计一次菌落数统计一次菌落数 目目, ,比较牛肉膏蛋白胨培养比较牛肉膏蛋白胨培养 基和选择培养基中菌落的数基和选择培养基中菌落的数 量、形态等量
35、、形态等, ,并做好记录并做好记录 当菌落数目稳定时当菌落数目稳定时, ,选取选取 菌落数在菌落数在3030300 300 的平板进的平板进 行计数行计数 空白平板作为对照空白平板作为对照, ,检测培检测培 养基制备是否合格养基制备是否合格 观察时还要记录不同菌落观察时还要记录不同菌落 的形状、大小、颜色等的形状、大小、颜色等 在同一稀释度下在同一稀释度下, ,至少对至少对3 3 个平板进行计数个平板进行计数, ,然后求出平然后求出平 均值均值, ,并根据平板所对应的稀并根据平板所对应的稀 释度计算出样品中活菌的数释度计算出样品中活菌的数 目目 4.4.实验结果分析实验结果分析: : 内内 容
36、容 现现 象象 结结 论论 有无杂有无杂 菌污染菌污染 的判断的判断 对照的培养皿中无菌落生长对照的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染未被杂菌污染 培养基中菌落数偏高培养基中菌落数偏高 被杂菌污染被杂菌污染 菌落形态多样菌落形态多样, ,菌落数偏高菌落数偏高 培养基中混入其他杂菌培养基中混入其他杂菌 选择培养选择培养 基的筛选基的筛选 作用作用 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌牛肉膏蛋白胨培养基上的菌 落数目大于选择培养基上的落数目大于选择培养基上的 数目数目 选择培养基具有筛选作用选择培养基具有筛选作用 样品的样品的 稀释操作稀释操作 得到得到3 3个或个或3 3个以上菌落数目个以上菌落数目 在在30
37、30300300的平板的平板 操作成功操作成功 重复组的重复组的 结果结果 若选取同一种土样若选取同一种土样, ,统计结果应接近统计结果应接近 5.5.鉴定原理鉴定原理: :分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NHNH3 3, ,使培养基的碱性增使培养基的碱性增 强强,pH,pH升高。在选择培养基中加入酚红指示剂升高。在选择培养基中加入酚红指示剂, ,培养某种细菌培养某种细菌, ,若指示剂变红若指示剂变红, ,可可 初步鉴定该种细菌能够分解尿素。初步鉴定该种细菌能够分解尿素。 【特别提醒特别提醒】实验中的两种“对照组”与“重复组”实验中的两种“对照组”与“重
38、复组” (1)(1)两种对照组作用比较。两种对照组作用比较。 判断培养基中“是否有杂菌污染”判断培养基中“是否有杂菌污染”, ,需将未接种的培养基需将未接种的培养基( (空白对照组空白对照组) )同时同时 进行培养。进行培养。 判断选择培养基“是否具有筛选作用”判断选择培养基“是否具有筛选作用”, ,需设置完全培养基需设置完全培养基( (牛肉膏蛋白胨培牛肉膏蛋白胨培 养基养基) )进行接种培养进行接种培养, ,观察两种培养基上菌落数目观察两种培养基上菌落数目, ,进行对比得出结论。进行对比得出结论。 (2)(2)重复组的设置及作用重复组的设置及作用: :为排除偶然因素对实验结果的干扰为排除偶然
39、因素对实验结果的干扰, ,在每一稀释度下在每一稀释度下 宜设置宜设置3 3个平板作为重复组个平板作为重复组, ,选择菌落数均在选择菌落数均在3030300300且数目相差不大的三个平且数目相差不大的三个平 板板, ,用“平均值”代入计数公式计算活菌数。用“平均值”代入计数公式计算活菌数。 【素养案例素养案例】 巴氏芽孢杆菌是一类具有较高脲酶活性巴氏芽孢杆菌是一类具有较高脲酶活性, ,能够分解尿素的细菌能够分解尿素的细菌, ,广泛分布在土壤、广泛分布在土壤、 堆肥及污水中。这种细菌能够将氮肥中的尿素分解成氨态氮被植物吸收堆肥及污水中。这种细菌能够将氮肥中的尿素分解成氨态氮被植物吸收, ,对土对土
40、 壤的肥力有着重要作用。研究人员拟从土壤样品中分离该类细菌壤的肥力有着重要作用。研究人员拟从土壤样品中分离该类细菌, ,如图所示为如图所示为 操作流程操作流程, ,表示操作步骤。请回答下列问题表示操作步骤。请回答下列问题: : (1)(1)制备培养基时制备培养基时, ,按照培养基配方准确称量各组分按照培养基配方准确称量各组分, ,将其溶解、定容后将其溶解、定容后, ,调节培调节培 养基的养基的_, ,及时对培养基进行分装及时对培养基进行分装, ,并进行并进行_灭灭 菌。菌。 (2)(2)步骤富集培养所使用的培养基按用途来分应为步骤富集培养所使用的培养基按用途来分应为_培养基培养基, ,步步 骤
41、的主要目的是骤的主要目的是_。 (3)(3)在步骤的培养基中加入在步骤的培养基中加入_指示剂指示剂, ,根据培养基是否变红来鉴根据培养基是否变红来鉴 定是否为尿素分解菌。若用该方法培养设置了定是否为尿素分解菌。若用该方法培养设置了3 3个培养皿个培养皿, ,菌落数分别为菌落数分别为163163个、个、 158158个、个、159159个个, ,则可以推测富集培养后的菌液中每毫升含活菌数为则可以推测富集培养后的菌液中每毫升含活菌数为 _个个, ,运用这种方法统计的结果往往较实际值运用这种方法统计的结果往往较实际值_。 (4)(4)要进一步分离纯化巴氏芽孢杆菌采用步骤要进一步分离纯化巴氏芽孢杆菌采
42、用步骤_法进行操作法进行操作, ,在在 该操作过程中接种工具至少要灼烧该操作过程中接种工具至少要灼烧_次。次。 【解题导引解题导引】解答本题的两个关键知识点解答本题的两个关键知识点: : (1)(1)培养基灭菌的方法培养基灭菌的方法: :常用高压蒸汽灭菌。常用高压蒸汽灭菌。 (2)(2)培养基种类的判断培养基种类的判断: :富集培养目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度富集培养目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度, ,所使用的培所使用的培 养基属于选择培养基。养基属于选择培养基。 【解析解析】(1)(1)制备培养基时制备培养基时, ,操作过程为计算、称量、溶化、配制培养液、调节操作过程为计算、称量、溶化、配制培
43、养液、调节 pHpH、分装、包扎、灭菌、倒平板、分装、包扎、灭菌、倒平板, ,培养基需要进行高压蒸汽灭菌。培养基需要进行高压蒸汽灭菌。(2)(2)图中步骤图中步骤 富集培养所使用的培养基属于选择培养基富集培养所使用的培养基属于选择培养基, ,目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度 ( (数量数量) )。(3)(3)鉴别尿素分解菌时需要使用酚红指示剂鉴别尿素分解菌时需要使用酚红指示剂, ,根据培养基是否变红来鉴根据培养基是否变红来鉴 定是否为尿素分解菌。富集培养后的菌液中每毫升含活菌数为定是否为尿素分解菌。富集培养后的菌液中每毫升含活菌数为 (163+158+159)(163+
44、158+159)3 30.10.110103 3=1.6=1.610106 6个个, ,用稀释涂布平板法进行计数时用稀释涂布平板法进行计数时, ,由于由于 一个菌落可能是两个或多个微生物细胞的后代形成的一个菌落可能是两个或多个微生物细胞的后代形成的, ,所以统计的结果往往较所以统计的结果往往较 实际值偏低。实际值偏低。(4)(4)图中分离纯化巴氏芽孢杆菌采用的方法是平板划线法图中分离纯化巴氏芽孢杆菌采用的方法是平板划线法, ,图中图中 划线区域共划线区域共4 4个个, ,所以该操作过程中接种工具至少要灼烧所以该操作过程中接种工具至少要灼烧4+1=54+1=5次。次。 答案答案: :(1)pH(
45、1)pH 高压蒸汽高压蒸汽( (湿热湿热) ) (2)(2)选择选择 增加巴氏芽孢杆菌的浓度增加巴氏芽孢杆菌的浓度( (数量数量) ) (3)(3)酚红酚红 1.61.610106 6 偏低偏低 (4)(4)平板划线平板划线 5 5 【误区警示误区警示】从土壤中分离微生物的注意事项从土壤中分离微生物的注意事项 (1)(1)一般步骤一般步骤: :土壤取样、选择土壤取样、选择( (富集富集) )培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株。培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株。 (2)(2)选择分离过程中需要使用选择培养基选择分离过程中需要使用选择培养基, ,要做到全过程无菌操作。要做到全过程无菌操作。 (3
46、)(3)常用的固体培养基上的接种方法是稀释涂布平板法和平板划线法。常用的固体培养基上的接种方法是稀释涂布平板法和平板划线法。 【素养素养探究探究母题追问母题追问】 (1)(1)科学思维科学思维分析与综合分析与综合 上题步骤中用到的培养基的氮源是什么物质上题步骤中用到的培养基的氮源是什么物质? ? 提示提示: :步骤中用到的培养基属于选择培养基步骤中用到的培养基属于选择培养基, ,目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度 ( (数量数量),),应该以尿素为氮源。应该以尿素为氮源。 (2)(2)科学思维科学思维演绎与推理演绎与推理 某同学发现他涂布的培养基上菌落数目过多连成一片某同学发现他涂布的培养基上菌落数目过多连成一片, ,请你帮他分析可能的原请你帮他分析可能的原 因并提出合理的处理措施。因并提出合理的处理措施。 提示提示: :可能是稀释倍数不够可能是稀释倍数不够, ,
