1、XX年度本科生毕业论文（设计）茶树菇液体培养条件的优化院 系：生命科学与技术学院 专 业：XX 年 级：XX 学生姓名：XX 学 号：XXX 导师及职称：XXX讲师） 2018年4月2018 Annual Graduation Thesis (Project) of the College Undergraduate Title of the Graduation Thesis (Project) Department: College of Life Science and TechnologyMajor: Agriculture specialtyGrade: 2014Students N
2、ame:汪新 Student No.: 201401130541Tutor: Lecturer Bai Jian-bo. April, 2018XX学院本科毕业论文 (设计)摘 要以茶树菇为试材，采用液体摇瓶培养法，通过单因素试验、正交实验，以菌丝体生物量为主要指标，对茶树菇液体发酵液pH筛选及培养条件进行优化，探讨发酵液初始pH对菌丝体生物量的影响，确定不同发酵因素的最佳组合。结果表明：树菇液体培养条件为起始pH6.07.0。最佳液体培养条件组合为A2B2C3，即装液量 100mL接种量15块/瓶，培养时间7d。影响茶树菇菇菌丝生长的因素由强到弱依次为培养时间 接种量 装液量。关键词：茶树菇
3、；培养条件ABSTRACTTea tree mushroom as test materials, the use of liquid shake flask culture method, through the single factor experiment, orthogonal experiment, the mycelium biomass as the main index, the tea mushroom liquid fermentation medium pH to screen and optimize the culture conditions, explore f
4、ermentation medium initial pH between mycelium morphology index and yield, to determine the best combination of different fermentation factors. The results showed that The liquid culture conditions of shitake mushroom were initial pH6.0 7.0. And the liquid culture condition of the mushroom was A2B2C
5、3, i.e., 100mL of liquid loading, 15 pieces of inoculation,and 7d of incubation time.The factors that influence the growth of mycelium growth of tea tree mushroom were from strong to weak,Incubation time inoculation amount loading amount.Key words: Tea tree mushroom; Training conditions目 录1.前言11.1茶树
6、菇概述11.2研究现状与存在问题11.3研究目的22.材料与方法32.1试验材料32.2菌种活化32.3初始pH筛选试验32.4单因素试验32.5最佳培养条件试验42.6测定方法42.7数据处理43.结果与分析53.1不同起始pH值对茶树菇液体培养的影响53.2发酵液初始pH值对终止pH值的影响53.3装液量对茶树菇菌丝体生物量的影响63.4接种量对茶树菇菌丝体生物量的影响63.5培养时间对茶树菇菌丝体生物量的影响73.6摇瓶培养最佳条件的确定74.讨论95.小结10参考文献11致谢13IIIXX学院本科毕业论文 (设计)1. 前言1.1 茶树菇概述茶树菇（Agrocybe cylindrac
7、ea）属层菌纲伞菌目粪锈伞科田头菇属1，是一种温带至亚热带地区从春季至秋季生长的一种木生食用菌,主要分布于南欧、北美洲东南部、中国和日本，它子实体单生、双生或丛生，菌盖直径一厘米,表面光滑，初期为暗红褐色，有浅皱纹，菌肉为白色,有纤维状条纹成熟期菌伞变硬，菌柄附膜质粘状物，菌环残留在菌柄上或附于菌盖边缘或自动脱落2。早在20世纪50年代法国就开始进行茶树菇的栽培研究，日本也从70年代开始有了关于茶树菇人工栽培技术的报道，我国于1972年在福建武夷山首次发现野生种菇,产于油茶树根兜部腐朽洞内，产量极少，十分珍贵，后又相继发现江西、贵州、吉林、广西、云南、四川、浙江、江苏、辽宁等地均有茶树菇分布3
8、。20世纪80年代我国开始利用天然茶树菇子实体分离菌株，成功分离出菌丝生长快、抗病能力强、产量高、广温型、适应能力强的优良品种4，90年代初开始在江西广昌开始大量培植。人工栽培的茶树菇产品质量优于天然茶树菇,且保持了原有的色、香、味。营养成分丰富，富含人体所需的多种蛋白质、氨基酸和微量元素5，不仅味美且具有广泛的药理作用，有清热、平肝、明目之药用功效，可以利尿、癌、抗衰老、降血压、健脾，是一种具有较高开发价值的珍稀食用菌6。1.2 研究现状与存在问题近几年来茶树菇在国内发展甚猛，目前栽培数量和产品市场占有率已超过香菇7，在国内生产上仍以应用固体菌种为主，固体菌种生产要经过较为繁锁的母种、原种、
9、栽培种三级培育，最后才能扩大到栽培袋生产，存在劳动强度大、工艺繁锁、杂菌污染率高、生长周期长、菌龄不一致、规模化程度低等问题，大大制约了茶树菇产业的发展8。相对于传统的固体菌种生产模式，现今存在另一种具有相对优势的新兴技术，即液体发酵生产技术，可以在较短时间内培育出液体菌种，以代替固体菌种进行生产获得子实体。该技术起源于1947年，美国的汉姆非特利用液体培养法生产出了蘑菇菌丝体9。国内是在1958 年开始研究液体发酵，到了20世纪90年代茶树菇在液体发酵技术的应用研究已取得较大进展。相较于固体菌种而言，制备液体菌种一般仅要5至7天，周期短，速度快，仅发菌时间就比固体菌种减少了1/2 以上10。
10、除生产周期上的明显优势外，液体菌种具有较强的流动性，各个菌丝球和菌丝片断可以流散在不同的部位萌芽，菌丝生长均匀一致，菌龄较整齐。并且液体菌种萌发速度超过了杂菌滋长速度，杂菌几乎没有滋生的机会，因此克服了杂菌污染的技术难题，保证了产品质量11。流质状态的液体菌种还便于接种工作的自动化、机械化，有利于工作效率的提高，更适合食用菌的工厂化、标准化生产，深层发酵技术的应用可以说是食用菌生产的大势所趋。然而使用深层发酵技术生产液体菌种亦存在一定的局限性，导致并未形成大规模化、普及化生产，究其主要原因，是因为食用菌的液体发醉需要投资整套的发酵设备,而设备价格昂贵,并非一般的菇农所能够接受，所以目前其只能用
11、于工厂, 推广到菇农尚需要一段时间12。其次，食用菌液体发酵过程是一项严谨的系统工程,中间的每一个环节都要严格控制，如接种量、温度、装液量、环境酸碱性质等条件不容差错，否则菌丝繁殖受到影响，从而导致降低产率，影响菌种质量。所以，明确生产要素，优化发酵工艺是液体制种大众化必经的一环。1.3 研究目的该试验以茶树菇为试验对象，采用液体摇瓶培养法，以菌丝体菌丝体生物量为指标，对茶树菇液体发酵过程中培养条件进行初步优化，确定不同发酵因素的最佳组合，探讨发酵液初始pH对菌丝体生物量的影响，探究菌丝生长周期前后PH值变化规律。为茶树菇液体发酵生产提供理论依据。3XX学院本科毕业论文 (设计)2.材料与方法
12、2.1试验材料2.1.1 试验菌株 茶树菇，实验室保存菌种2.1.2培养基 PDA培养基:土豆 200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL；摇瓶发酵培养基：豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%。2.2菌种活化 将保存的菌种转接到无菌的PDA平板培养基上，放入28左右恒温培养箱中培养5d，保存备用。2.3 初始pH筛选试验采用已优化过的培养基配方,用1molL-1的NaOH溶液和的盐酸溶液将各瓶培养基分别调成不同的pH值,使初始pH值分别为4.0，5.0，6.0，7.0（每个处理重复三次），制备完成后置于高温高压下灭菌。接种后置于28恒温培养箱中静置萌发2
13、4h，28，180rmin-1 条件下振荡培养8d。测定在不同起始pH条件下pH的变化情况，以菌丝体生物量为指标，确定液体发酵培养基的最适起始pH。2.4 单因素试验 2.4.1 装液量筛选试验将配制好的液体发酵培养基装入250mL三角瓶内，装液量分别设置为50mL，75mL，100mL，125mL，150mL。使用专业打孔器将已活化的斜面母种分割为0.1cm*0.1cm的块，每摇瓶内接15块/瓶，接种后置于28，180rmin-1 条件下震荡培养8天，测定发酵液中茶树菇菌丝体鲜重。2.4.2 接种量筛选试验 在250mL三角瓶内装入已配置好的150mL液体培养基，使用专业打孔器将已活化的斜面
14、母种分割为0.1cm*0.1cm的块，接种量分别设置为5块/瓶，7块/瓶，10块/瓶，12块/瓶，15块/瓶。接种后置于28，180rmin-1 条件下震荡培养8天，测定培养后发酵液中茶树菇菌丝体鲜重。2.4.3 培养时间筛选试验 使用专业打孔器将已活化的斜面母种分割成0.1cm*0.1cm的块，接种量为15块/瓶，接种完成将摇瓶置于恒温摇床中震荡培养，摇床温度设置为28，转速设置为180rmin-1，分别在培养的第5天，第6天，第7天，第8天，第9天取发酵液测定茶树菇菌丝体鲜重，了解菌丝体变化情况，确定茶树菇液体菌种最佳培养周期。2.5 最佳培养条件试验用专用打孔器将活化的斜面母种分割成等量
15、大小的块，接种到液体摇瓶培养基中，置于恒温震荡器中培养（28，160 rmin-1）。以装液量、接种量、培养时间3 个因素，采用正交试验设计（见表 1），共9个处理，每个处理重复3 次，以菌丝体鲜重为考察指标，进行培养条件优化，获得最佳摇瓶发酵培养条件组合。表1 液体培养条件正交实验因素水平水平A 装液量 /mlB接种量 /块 C培养时间15056210010731501582.6 测定方法2.6.1 PH 值测定培养结束后使用精密pH 试纸测量液体菌种培养基的PH 值，每个处理重复三次，计算平均值。2.6.2 菌球密度将培养好的摇瓶吸取 1mL培养液摊匀于培养皿中, 在暗背景下,使用放大镜直
16、观计数,重复3次13，取平均值。2.6.3 菌球直径测定培养结束后, 随机选取 15 个菌球, 在培养皿中排成一 排, 皿下衬坐标纸测量样本中全部菌球直径,重复 3 次, 取平均值13。2.6.5 计算培养液菌丝球重量（鲜重）取培养良好无污染的摇瓶，放到转速为 2500 r/min 的离心机中离心 20 min，随即倒掉上清液，取沉淀的菌丝体，放在电子天平上称重14。2.7 数据处理数据处理使用Microsoft Excel 2007和SPSS Version 21软件.XX学院本科毕业论文 (设计)3.结果与分析3.1不同起始pH值对茶树菇液体培养的影响由表2可知，茶树菇适应性良好，在培养基
17、pH47的条件下均能生长，菌球均小而沉淀，无显著差异，但不同的pH对菌丝鲜重有较大的影响。实验显示，茶树菇在培养基pH值为6.0时，菌丝体鲜重最大，达11.414g/100mL。与pH7.0水平下不存在显著性差异，与其它pH水平存在显著性差异，pH4水平下鲜重达最低值。所以，茶树菇液体培养较为适宜的pH为6.07.0。表2.初始pH值对菌丝体鲜重、密度、直径的影响水平设置pH平均直径平均密度鲜重（g/100ml）142.2300.191a11.0001.527a11.4140.259c252.0300.234a7.6661.768a13.5360.280b362.0260.210a11.666
18、1.856a19.5990.195a472.6560.808a6.6660.334a18.9320.352a3.2 发酵液初始pH值对终止pH值的影响图1可以看出，终止pH值相较于初始pH都会有所降低，且起始环境pH越高，下降的程度越大。这是由于培养基高温灭菌后，发酵液的pH会有所降低，而菌丝体在生长过程中由于自身的一些代谢作用也会分泌一些有机酸14，这些有机酸的积累会导致发酵液的pH进一步下降，菌丝体在生长过程中分泌的有机酸越多，最终发酵液pH值下降越多。 图1.发酵前后pH值变化对比图3.3 装液量对茶树菇菌丝体生物量的影响 从图2可以看出，装液量在 100mL时发酵液中茶树菇菌丝体鲜重最
19、高，达10.374g/50m L，装液量超过100mL时，发酵液中菌丝体鲜重呈现下降趋势，原因是装液量过大，三角瓶内溶氧减少，会影响菌体的生长和产物的形成，所以，合适的装液量为100mL。图2.装液量对茶树菇菌丝体鲜重的影响3.4 接种量对茶树菇菌丝体生物量的影响接种量的大小与菌种在发酵液中生长繁殖的速度有关。接种量大，菌种生长繁殖速度快，可缩短发酵时间；接种量不足，则会使发酵前期菌丝量少，菌体生长缓慢，延长发酵时间15。由图3可知，不同接种量大小对茶树菇的生长和菌球生物量有一定影响。接种量在512（块/瓶）时，随接种量不断增大，菌球鲜重也在增加，且接种量为12块/瓶时，鲜重达到最大，为9.4
20、37g/50m L。接种量超过12块/瓶时，菌丝体鲜重有下降趋势，鉴于发酵成本考虑，最适接种量为12块/瓶。 图3.接种量对茶树菇菌丝体鲜重的影响3.5 培养时间对茶树菇菌丝体生物量的影响从图4可以看出，在发酵的57d内，菌丝体生物量逐渐增加，第7天达到最大，即12.358g/50m L，而710d 内菌丝鲜重表现为逐步降低，这是因为发酵时间越长，培养液中的营养物质被消耗得越多，菌体生长受到限制16，所以，较合适的发酵天数为7d。 图4.发酵时间对茶树菇菌丝体鲜重的影响3.6摇瓶培养最佳条件的确定表3、表4中列出了按照正交试验设计进行培养得到的菌丝生物量结果，其方差分析结果表明，装液量和培养时
21、间对菌丝生物量来说具有显著影响（p0.05），接种量对菌丝体生物量无显著影响（p0.05），从F值的大小可看出影响因素由强到弱依次为培养时间 接种量 装液量。由图5可知，茶树菇菌丝生长的最佳液体培养条件组合为 A2B2C3，即装液量100 mL接种量10块/瓶，培养时间7d。表3 正交实验结果序号ABC菌丝体鲜重(g/50ml)11115.17421227.624313310.20642128.136522311.24962317.75673138.63983218.03193328.389.表4.培养条件优化试验方差分析变异来源型平方和df均方F值显著性矫正模型66.264a611.0441
22、5.4950.000A：装液量42.963221.48130.1380.003B：接种量14.74627.37310.3440.147C：培养时间8.55624.2786.0020.024误差14.255200.173总变异1965.93427矫正总和80.51926 A.装液量（mL） B.接种量（块） C. 培养时间（d）图5.液体培养基正交试验最佳组合分析114.讨论不同的培养条件对食用菌生长有着较大的影响。发酵时间、接种量、装液量、PH等因素与菌丝生长环境息息相关，影响菌丝繁殖速度及产量大小。pH筛选试验结果表明最适茶树菇生长的培养液初始pH值，即pH6.07.0，与刘敏17等研究结果
23、一致，过高或过低的pH都会影响生物量的累积。在菌丝体生长过程中，培养液的pH值也会产生一定变化。在发酵初期，菌体利用糖旺盛，碳代谢产生的有机酸使pH值下降，然后，菌体合成的蛋白酶等物质，对氮源的代谢产生了铵等物质使pH开始回升，此后pH又开始缓慢下降，慢慢处于平稳期，在整个过程中，培养终止pH值相较于初始值都下降，初始值较大的下降的更大。接种量对菌丝生长速度、生长质量有着直接影响。接种量不足时，菌丝繁殖速度较慢，产率低，接种量的增加可使菌种表现出一定的群体生长优势，发菌点多，菌丝萌发快，同时也是增加菌丝体前端营养供应最为有效的途径，因而抵抗杂菌的能力也得到提高。为了发酵成本考虑，本试验中较适的
24、接种量为12块/瓶。茶树菇为好气性真菌，发酵中的通气状况对菌丝生长影响较大，而装液量的大小将直接影响到三角瓶内的通气状况。若装液量过大，则影响通气，菌丝通气过多，菌丝过度生长，反而影响菌球数量，从而影响菌丝生物量。从结果上看，250mL三角瓶内装入100mL以上液体培养基显然过多，同等转速下不能制造出更多氧气供给，菌丝生长受到抑制，因缺氧而生长缓慢。液体培养的时间长短一直是重要的影响因素，发酵时间短，菌丝还未达到最大的生长速率，产物没得到最大积累，发酵时间过长，菌丝则会开始老化自溶，结果表明最佳培养时间为7d。从单因素试验中得到的结果并不能直接应用于生产，不同发酵条件中存在一定的相互作用，每个
25、条件的最佳值相加并不等于是最适合菌丝生长的最优选择组合。为了进一步探讨，本试验进行正交试验设计，确定接种量、装液量、发酵时间的最佳组合，结果表明最优条件组合为A2B2C3。本试验结果只适宜摇瓶培养茶树菇液体菌种，在摇瓶中规模生产需要的适宜培养条件，有待进一步研究。另外，试验只是对几种影响因素进行了研究，茶树菇液体菌种摇瓶培养还与好多因素有关，也需要进一步研讨。5.小结本试验通过单因素试验和正交试验，确定最适发酵pH值为。最优发酵条件组合为A2B2C3，即装液量 100mL，接种量10块/瓶，发酵时间7 d。此条件下发酵液中茶树菇生物量含量可达11.2493g/100mL。该试验结果可为茶树菇的
26、下一步液体发酵生产提供相应理论依据。本试验结果表明，对茶树菇液体发酵条件影响较大的因素是发酵时间，其次是装液量和接种量，当然各种发酵条件之间存在一定的相互影响作用，生产上为了节省成本，应该选择生产周期短的发酵工艺。XX学院本科毕业论文 (设计)参考文献1 邱敦莲,刘本洪,肖在勤,等. 茶树菇原生质体的分离和再生以及单核菌株的筛选J. 西南大学学报(自然科学版), 2008, 30(12): 117-1202 郭成金,食用蕈菌生物学M.天津：天津科学技术出版社 , 2014.113 邓超, 茶树菇液体深层发酵及其多糖功能的研究D. 江苏: 江南大学,2006.4 李贺,王相刚,李艳芳. 食用菌液
27、体菌种生产研究进展J. 园艺与种苗,2012, (6): 123-125.5 刘明,肖自添,邱耀明等. 茶树菇液体菌种培养基、培养条件的筛选及其应用J. 中国食用菌,2016,35(4): 39-42.6 陈武强,刘存芳. 茶树菇中生物活性成分的研究现状J. 内江科技,2009, 3(11): 33.7 曾泽斌,刘学峰,王一等. 茶树菇发酵工艺的研究J. 食用菌, 2012,(5):8-10.8 王恒生，陈克龙，李 怡等.茶树菇的经济价值及开发应用J. 中国园艺文摘, 2015(4)9 戴建清,曾志恒. 中国食用菌液体菌种研究现状及发展趋势J. 中国食用菌, 2012, 31(5)：1-3.1
28、0 闻毛红,朱将伟, 食用菌液体培养技术的发展与应用J.现代农业科技,2008(9)11 陈娟,朱忠贵,李萍. 食用液体发酵技术的研究进展与发展前景J.食用菌,2006,4-5.12 宋景平,王幸斌,陈树发. 液体菌种未能推广之原因分析及对策研究J. 中国食用菌, 2010, 299(9): 58-66.13 黄春燕单洪涛,万鲁长等. 鸡腿菇液体菌种培养条件的研究J., 山东农业科学,2004(3):43.14 马瑞霞,刘慧. 杏鲍菇液体菌种培养基的筛选及培养条件的探讨J. 中国农学通报, 2011, 27(7): 452-456.15 徐思炜,张君胜,周 雯.香菇液体菌种培养条件优化J.16
29、 魏雅冬,王广慧,李贺等. 香菇液体发酵条件的优化 江苏农业科学，2014，42(12):290 29217 刘敏,卢红,黄媛媛,等. 茶树菇液体发酵条件研究J. 北方园艺, 2016,(11): 142-144.致谢时光匆匆如流水，转眼便是大学毕业时节，春梦秋云，聚散真容易。离校日期已日趋临近，毕业论文的完成也随之进入了尾声。四年的读书生活在这个季节即将划上一个句号，我将面对又一次征程的开始。四年的求学生涯在师长、亲友的大力支持下，走得辛苦却也收获满囊，在论文即将付梓之际，思绪万千，心情久久不能平静。感谢学院为我提供良好的做毕业设计的环境，这栋包含学术气息的建筑承载着许多莘莘学子的梦想与欢笑
30、，这里是我们蓬勃向上的温土，学习的殿堂，在这里我们学到了知识，得到了进步与成长。与此同时我急切地要把我的敬意和赞美献给一位平凡的人，我的导师。我不是您最出色的学生，而您却是我最尊敬的老师。俗语有云授人以鱼不如授人以渔，从论文题目的选定到论文写作的指导,您不是直接告诉我们答案，而是悉心的点拨,引导我完成,常常让我有“山重水复疑无路,柳暗花明又一村”之感。您治学严谨，学识渊博，跟随您做毕业设计，常常有良好的学术氛围，潜移默化之间，使我不仅接受了全新的思想观念，自我的专注力和自制力得到很大提升。可谓是“经师易得，人师难求”，希望借此机会向老师表示最衷心的感谢! 感谢我的父母，焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报，你们永远健康快乐是我最大的心愿。在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚谢意！ 最后再一次感谢所有在毕业设计中曾经帮助过我的良师益友和同学！ 2018年4月13
