1、幽门螺杆菌细胞毒素的鉴定方法The methods of identifying the cytotoxin in Helicobacter pyloriWANG Hua-Bing,DONG Xiu-Yun(Department of Gastroenterology,Peking University Third Hospital,Beijing100083,China)ABSTRACTObjective:To investigate the methods of identifying the cytotoxin in Helicobacter pylori (H.Pylori) clin
2、ical isolate.Methods:H.Pylori strain HB1 was isolated from the biopsy specimen of gastric mucosa and identified its cytotoxin by using the techniques of cell culture,PCR and Western blot.Results:HB1 strain induced vacuolation in HeLa cells.The cagA gene was detected by PCR in HB1 strain.The Western
3、blot analysis showed there were two protein bands of 87103and 130103in H.pylori water extract.Conclusion:H.pylori clinical isolate HB1 was a VacA+CagA+strain.KEY WORDSHelicobacter pylori;Cytotoxin/VacA,CagA;Identify自1983年澳大利亚学者Marshall和Warren首次从人胃粘膜中成功地分离培养出幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）以来，Hp已成为国内外许多
4、专家、学者研究的对象。最近Hp毒素在致病性中的重要作用引起人们广泛关注。根据目前的研究，Hp毒素主要有两种，即空泡细胞毒素(Vacuolating cytotoxin A,VacA)和毒素相关基因A(Cytotoxin associated gene A,CagA)。根据这两种蛋白可将Hp分为两种主要类型1：型菌株含有cagA基因，表达CagA蛋白，并产生空泡毒素；型菌株缺乏cagA基因，不表达CagA蛋白，不产生空泡毒素。这两型菌株分别占研究总样本的56%和16%，其余28%属中间表型，仅表达CagA或VacA。本实验利用已知毒素特性的Hp国际标准株NCTC 11637和NCTC 11639
5、为参照，对临床分离株HB1进行细胞毒素鉴定，以求探索出一套有效的鉴定方法，以便对不同菌株作进一步研究。1材料与方法1.1细菌来源NCTC 11637(VacA+,CagA+)和NCTC 11639(VacA,CagA+)由中国预防医学科学院流行病学研究所提供；HB1从十二指肠球溃疡患者胃粘膜活检标本中分离。1.2主要试剂cag A扩增产物为349 bp片段，引物由中国预防医学科学院流行病学研究所惠赠，序列如下：5-GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG-35-CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA-3100bp Ladder Marker由北京大学基础医学院病理学系提供。高分子蛋白
6、质分子质量标准为Promega公司产品。 第一抗体为混合病人血清，经Helico Blot试剂盒检测CagA抗体及VacA抗体均为阳性。第二抗体（辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG)为中山生物工程公司产品。1.3HeLa细胞空泡变性实验将培养34d的Hp刮入盛有灭菌三蒸水的小离心管中，在涡旋振荡器上充分振荡后，放20过夜。取出融化后，再次振荡，12000r*min1离心15min，TGL-16G台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)，取上清液用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取对数生长期HeLa细胞，消化后制成细胞悬液，调细胞数后接种于六孔板中。CO2恒温培养箱中孵育24h，更换培养液后分别加入各型Hp细
7、胞毒素提取液共同孵育24h。弃去培养液，以甲醇固定10min，晾干后加Giemsa染液作用20min，自来水冲洗。镜下观察细胞内是否有空泡形成，若大于50%的细胞形成空泡，则认为该菌株有空泡变性能力。1.4多聚酶链反应（PCR）检测cag A基因用接种环刮取1/3环细菌，悬于0.5 ml STE缓冲液中，洗涤一次，再以 200l TE重悬，100 煮沸5 min，14 000 r*min1离心10min，取上清进行扩增反应。经15g*L1琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪观察结果。分子质量标准为100 bp Ladder Marker。1.5Western blot分析配制80 g*L1分离胶和40
8、g*L1积层胶，加入电泳缓冲液。据蛋白定量结果每孔加样50g进行垂直电泳。电泳结束后电转移至硝酸纤维素（NC）膜上。经丽春红S染色，用针尖标出作为分子质量标准的参照蛋白的位置，然后进行抗原-抗体结合反应，DAB显色。2结果2.1HeLa细胞空泡变性实验阳性对照NCTC 11637毒素提取液使HeLa细胞发生空泡变性；阴性对照NCTC 11639未使HeLa细胞发生空泡变性；临床株 HB1可使HeLa细胞发生空泡变性，提示HB1菌株为VacA菌株（图1）。Figure 1Vacuolating test4002.2PCR检测PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外检测仪下观察可见：以NCTC 116
9、37、NCTC 11639、HB1 3种菌株的裂解物为模板的扩增产物均出现一DNA带。据DNA Ladder Marker计算约350 bp，提示为cag A。说明3种菌株均属于cag A阳性菌株(图2)。2.3Western blot分析经与蛋白质分子质量标准比较（已通过丽春红S染色标记条带位置），在130103处，3种菌株均有条带，87103处仅NCTC 11637及HB1有条带，NCTC 11639条带缺如(图3)。3讨论十多年来，大量研究资料表明，Hp感染与胃十二指肠疾病关系密切2。所有的Hp感染者在组织学上都有胃炎的表现，但大多数人并无症状，仅一小部分人发展成严重疾病(如消化性溃疡和
10、胃癌)3。目前人们对Hp的致病机制还不太清楚，但是导致临床结局不同的一个重要因素在于Hp菌株之间毒力的差异。Hp的几种毒力因子(如鞭毛的动力、粘附因子、脂多糖的内毒素、尿素酶、蛋白水解酶、磷脂酶A和超氧离子歧化酶等)存在于所有的Hp菌株，因此用上述因素并不能完全解释为什么感染Hp者会出现不同的临床后果。Figure 2PCR result for detecting cagA gene1，HB1;2，NCTC11637;3，NCTC11639.Figure 3Western blot analysisHp毒素VacA 和CagA只在大约50%60%的Hp菌株中产生，并且与胃十二指肠疾病关系密切
11、4，编码二者的基因分别称之为vacA和cagA。VacA 蛋白于1988年由Leunk等首先描述，1992年被提纯5，在SDS-PAGE上表现为87103成熟蛋白，可导致真核细胞发生空泡变性，其目标是晚期核内体膜上的型ATP酶6。本研究临床分离株HB1经HeLa细胞空泡变性实验显示具有空泡变性能力，提示为VacA+。所有Hp都具有vacA，但并非所有的Hp都有空泡毒素活性，对于这一现象的解释认为，两种Hp的vacA在DNA序列上有所不同，碱基组成上有64.8%的同源性。Cover等7的研究显示，大约60%70%的Hp菌株含有cagA基因，这些菌株均是CagA+，不产生CagA蛋白的Hp没有ca
12、gA基因8。HB1经PCR检测具有cagA基因，由此推测亦CagA+。cagA基因内部存在重复序列，所以cagA基因和蛋白的大小在Hp菌株间存在差异，CagA蛋白的相对分子质量变动于120103140103。Western blot结果显示，HB1在130103处可见一杂交条带，相同位置NCTC11637和NCTC11639亦有条带，进一步支持PCR检测结果。同时Western blot分析显示在87103处，HB1、NCTC11637有杂交带，NCTC11639条带缺如，亦支持HeLa细胞空泡变性实验。综上所述，本实验从功能到结构、从基因到蛋白质对Hp细胞毒素进行了双重鉴定：Hp临床分离株H
13、B1为VacA+和CagA+菌株。从而为HB1的深入研究准备了条件。参考文献1，Xiang Z,Censini S,Bayeli PF,et al.Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that CagA is not necessary for expression of the vacuolating
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