人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备课件.ppt

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1、细胞与遗传学教研室细胞与遗传学教研室一、实验目的一、实验目的1.1.掌握人类染色体标本的制作方法掌握人类染色体标本的制作方法2.2.了解人类染色体形态结构特征了解人类染色体形态结构特征PHA37 68h秋水仙素秋水仙素至至72 h h三、实验用品三、实验用品 1.1.材料:人体外周血材料:人体外周血 2.2.器材:培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸器材:培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸管、恒温水浴锅等管、恒温水浴锅等 3.3.试剂:培养基、秋水仙素(试剂:培养基、秋水仙素(12.5gml12.5gml)、)、植物凝植物凝集素(集素(PHAPHA)、肝素、肝素、0.075Mkcl0.0

2、75Mkcl低渗液、甲醇、冰乙低渗液、甲醇、冰乙酸、酸、PH6.8PH6.8磷酸缓冲液、磷酸缓冲液、GiemsaGiemsa原液。原液。四、实验方法四、实验方法1.1.外周血细胞培养外周血细胞培养(1 1)采血:无菌,肝素抗凝。)采血:无菌,肝素抗凝。 用无菌注射器抽取肝素用无菌注射器抽取肝素0.2ml,0.2ml,润湿针筒润湿针筒, ,推出多推出多余肝素余肝素. .消毒后消毒后, ,抽取受试者静脉血抽取受试者静脉血2ml2ml。)(2 2)接种培养:每培养瓶加入)接种培养:每培养瓶加入0.30.5ml0.5ml(1010滴)滴), , 接种种于装有5ml培养养基的培养瓶养瓶中,摇匀摇匀, 3

3、7培养养箱中培养养68小时时。 (2020滴)滴) (3 3)秋水仙素处理:)秋水仙素处理:0.050.4gml培养养基,轻摇轻摇混匀匀后,继续继续培养养至72小时时 。 实验方法实验方法2.2.染色体的制备染色体的制备(1)收获细胞:用吸管吸取培养物,移至离心管中,以)收获细胞:用吸管吸取培养物,移至离心管中,以1500转转/分离心分离心10分钟,弃去上清液,留下沉淀物约分钟,弃去上清液,留下沉淀物约0.3ml。 (2)低渗处理:加入预温)低渗处理:加入预温37的低渗液至的低渗液至8ml,用吸管,用吸管轻轻吹吹打混匀,置于打混匀,置于37恒温水浴锅中低渗恒温水浴锅中低渗20分钟分钟 。低渗后

4、吹打要轻轻,以防细细胞破裂.(3)预固定:缓缓加入)预固定:缓缓加入1ml新配制的固定液(甲醇:冰乙酸新配制的固定液(甲醇:冰乙酸=3:1),立即用吸管轻吹打混匀。以),立即用吸管轻吹打混匀。以1500转转/分离心分离心10分钟分钟,弃上清液,弃上清液, 留约留约0.3ml沉淀物。沉淀物。 (4)固定:加入新鲜固定液至)固定:加入新鲜固定液至8ml,吸管吹打混匀,室温固,吸管吹打混匀,室温固定定20分钟分钟, 1500转转/分离心分离心10min,去上清液。依上述方法,去上清液。依上述方法再重复固定再重复固定1次。次。 实验方法实验方法(5)制备细胞悬液:)制备细胞悬液: 预留预留0.20.3ml固定液固定液 ,加2滴新配固定液制成细胞悬制成细胞悬液液 (6)滴片:)滴片: 吸取细胞悬液,滴吸取细胞悬液,滴23滴于冰镇的载玻片上滴于冰镇的载玻片上,于酒精灯火于酒精灯火焰上过火后,空气干燥。焰上过火后,空气干燥。(每组每组3张,只染张,只染1张)张) (7)染色:)染色: Giemsa染液染色10分钟钟,自来来水轻轻冲洗,晾晾干,镜检镜检。 五、实验结果五、实验结果 在低倍镜下选择分散良好,长度适中的分在低倍镜下选择分散良好,长度适中的分裂相,再转至油镜观察。裂相,再转至油镜观察。

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