1、2022-8-1 第第第121212章章章 分子发光分析分子发光分析分子发光分析12.1 12.1 12.1 概述概述概述 分子发光分析法：分子发光分析法：基于被测物质的基于被测物质的基态基态分子吸收能量分子吸收能量激发到较高能态后，返回基态时，以发射辐射的方式释放激发到较高能态后，返回基态时，以发射辐射的方式释放能量，通过测量辐射光强度对被测物质进行定量测定的分能量，通过测量辐射光强度对被测物质进行定量测定的分析方法。析方法。当当分子吸收光能分子吸收光能被激发到较高能态，返回基态时发射出被激发到较高能态，返回基态时发射出与激发光波长相同或不同辐射的现象称为与激发光波长相同或不同辐射的现象称为
2、光致发光。光致发光。最常见的两种光致发光现象是最常见的两种光致发光现象是荧光和磷光荧光和磷光。由此建立的由此建立的分析方法称作分析方法称作分子荧光分析和磷光分析。分子荧光分析和磷光分析。2022-8-112.2 12.2 12.2 荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理荧光和磷光分析基本原理1.1.1.荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生荧光和磷光的产生(1)分子的能级与跃迁分子的能级与跃迁 分子中每个电子能级中都包含一系列的振动和转动能级。分子中每个电子能级中都包含一系列的振动
3、和转动能级。基态基态(S0)激发态激发态(S1、S2、激发态振动能级激发态振动能级)：吸收特定频吸收特定频率的辐射；量子化。率的辐射；量子化。激发态激发态基态：多种途径和方式基态：多种途径和方式;第一、第二、第一、第二、电子激发单重态电子激发单重态 S1、S2 基态基态(S0)称为称为荧光；荧光；第一、第二、第一、第二、电子激发三重态电子激发三重态 T1、T2 基态基态(S0)称为称为磷光磷光。2022-8-1(2)(2)(2)电子激发态的多重度电子激发态的多重度电子激发态的多重度电子激发态的多重度电子激发态的多重度电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：电子激发态的多重度：M=2S+1 S为
4、电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(等于等于0或或1)大多数有机分子的基态处于单重态大多数有机分子的基态处于单重态(Pauli不相容原理，不相容原理，s=,S=0,M=1)；激发时电子自旋方向不变，分子处于激发单重态激发时电子自旋方向不变，分子处于激发单重态S1,S2；激发时电子自旋方向改激发时电子自旋方向改变，变，S=1,M=3，分子处，分子处于激发三重态于激发三重态T1,T2；三重态能级比相应单重三重态能级比相应单重态能级低态能级低(洪特规则洪特规则)。S0T1 禁阻跃迁。禁阻跃迁。2022-8-1(3)(3)(3)激发态激发态激发态激发态激发态激发态基态的能量传递途径基态的能
5、量传递途径基态的能量传递途径基态的能量传递途径基态的能量传递途径基态的能量传递途径 分子的激发态是不稳定状态，分子的激发态是不稳定状态，电子从电子从激发态激发态返回基态时，返回基态时，通过辐射跃迁通过辐射跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径传递途径辐射跃迁荧光延迟荧光磷光内转换系间窜越振动弛豫外转换无辐射跃迁以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势，以速度最快、激发态寿命最短的途径占优势，发光强度高。发光强度高。荧光：荧光：10-910-7s，第一激发单重态的最低振动能级，第一激发单重态的最低振动能级基态基态磷光：磷光：10-410s，第一激发三重态的
6、最低振动能级，第一激发三重态的最低振动能级基态基态2022-8-1S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫2022-8-1辐射能量传递过程辐射能量传递过程辐射能量传递过程辐射能量传递过程辐射能量传递过程辐射能量传递过程 发射发射荧光：荧光：电子由第一激发单重态的最低振动能级电子由第一激发单重态的最低振动能级基态基态 (S1 S0跃迁跃迁)，发射波长为发射波长为 l l 2的荧光，的荧光，10-910-7 s。发射荧光的能量比分子吸收的能量小，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，l l 2
7、l l 2 l l 1.发射发射磷光：磷光：电子由第一激发三重态的最低振动能级电子由第一激发三重态的最低振动能级基态基态 (T1 S0跃迁跃迁)；电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：的可能过程：S0激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫T1 S0 T1禁阻跃迁禁阻跃迁，发光速度很慢：发光速度很慢：10-410 s。光照停止后，可持续一段时间。光照停止后，可持续一段时间。2022-8-1非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程非辐射能量传递过程 振动弛豫：振动弛豫：同一电子能级内分子以热能交换形式由高振动能同一电
8、子能级内分子以热能交换形式由高振动能级至低振动能级间的跃迁。级至低振动能级间的跃迁。内转换：内转换：同一多重态电子能级间的无辐射能量交换。同一多重态电子能级间的无辐射能量交换。通过通过振动弛豫和振动弛豫和内转换，高激发单重态的电子跃回第一激内转换，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。发单重态的最低振动能级。系间窜越：系间窜越：不同多重态有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。不同多重态有重叠的振动能级间的非辐射跃迁。是禁阻跃迁，通过自旋是禁阻跃迁，通过自旋轨道耦合进行轨道耦合进行。外转换：外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而激发态分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转
9、移能量的非辐射跃迁。转移能量的非辐射跃迁。外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。2022-8-1 2.2.2.激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱激发光谱和发射光谱(1)激发波长选择与激发光谱曲激发波长选择与激发光谱曲线线 不同波长入射光具有不同的激发不同波长入射光具有不同的激发效率。效率。固定测量波长固定测量波长(选最大发射波长选最大发射波长)，测量不同激发波长下化合物发射，测量不同激发波长下化合物发射的荧光的荧光(磷光磷光)强度与入射光波长的强度与入射光波长的关系曲线关系曲线(曲线曲线I)。激发光谱曲线峰值处，处
10、于激发激发光谱曲线峰值处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。态的分子最多，荧光强度最大。2022-8-1(2)(2)(2)荧光及磷光光谱荧光及磷光光谱荧光及磷光光谱荧光及磷光光谱荧光及磷光光谱荧光及磷光光谱 固定激发光波长固定激发光波长(选最选最大激发波长大激发波长)，测定化合，测定化合物发射的荧光物发射的荧光强度强度(或磷或磷光强度光强度)与发射光波长的与发射光波长的关系曲线关系曲线(图中曲线图中曲线II或或III)。2022-8-1200260320380440500560620荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱磷光光谱磷光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇
11、溶液荧（磷）光光谱2022-8-1(3)(3)(3)发射光谱的特性发射光谱的特性发射光谱的特性发射光谱的特性发射光谱的特性发射光谱的特性 a.Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长发射光谱的波长比激发光谱的长，比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子激发到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子激发到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能如能级图级图l l2,l l1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态
12、的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如如l l2)。c.镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与其吸收光谱通常荧光发射光谱与其吸收光谱(基态基态第一态第一态)成镜像成镜像对称关系。对称关系。2022-8-1镜像规则镜像规则镜像规则镜像规则镜像规则镜像规则2022-8-13.3.3.荧光的产生与分子结构的关系荧光的产生与分子结构的关系荧光的产生与分子结构的关系荧光的产生与分子结构的关系荧光的产生与分子结构的关系荧光的产生与分子结构的关系 (1)分子产生荧光必须具备的条件分子产生荧光必须具备的条件 具有一定结构，多为含芳香环、杂环的化合物或具
13、有刚性具有一定结构，多为含芳香环、杂环的化合物或具有刚性平面的分子平面的分子 具有一定的荧光效率具有一定的荧光效率 荧光效率荧光效率 代表物质发射荧光的能力，通常小于代表物质发射荧光的能力，通常小于1。吸收的光量子数发射的光量子数 荧光效率与激发态分子能量释放各过程的速率常数有荧光效率与激发态分子能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射。2022-8-1(2)(2)(2)化合物结构与荧光化合物结构与荧光化合物结构与荧光化合物结构与荧光化合物结构与荧光化合物结构与荧光 跃迁类型：跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率常的荧光效
14、率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；数小，有利于荧光的产生；共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移;刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故荧光量子产率高。如荧光素和酚酞有相似结构，荧用，故荧光量子产率高。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有光素有很强的荧光，酚酞却没有;取代基效应：芳环上有取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强；相供电基，使荧光增强；相反，芳环上有吸电子基团反，芳环上有吸电子基团，荧光减弱或无荧光。，荧光减弱或无荧光。202
15、2-8-12022-8-14.4.4.影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素 外部因素外部因素:(1)溶剂的影响溶剂的影响 除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化；成都将使化合物的荧光发生变化；(2)温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加几率增加;(3)溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制的影响较大，需要严格控制.202
16、2-8-15.5.5.内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象内滤光作用和自吸现象 自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光的组分，如色胺酸中的重铬酸钾；的荧光的组分，如色胺酸中的重铬酸钾；2022-8-16.6.6.溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭溶液
17、荧光的猝灭 碰撞猝灭；碰撞猝灭；氧的熄灭作用等。氧的熄灭作用等。2022-8-112.3 12.3 12.3 仪器结构流程仪器结构流程仪器结构流程仪器结构流程仪器结构流程仪器结构流程 测量荧光的仪器主要由测量荧光的仪器主要由四个部分四个部分组成：激发光源、样品组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。池、双单色器系统、检测器。特殊点特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：基本流程如图：单色器单色器：选择激发光波长：选择激发光波长的第一单色器和选择发射的第一单色器和选择发射光光(测量测量)波长的第二单色波长的第二单色器；器；光源光源
18、：高压氙灯或高压汞：高压氙灯或高压汞灯灯检测器检测器：光电倍增管。：光电倍增管。2022-8-1同步扫描技术同步扫描技术同步扫描技术同步扫描技术同步扫描技术同步扫描技术 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差关系，同步扫描可分为固定波长差(ll)和固定能量差及可和固定能量差及可变波长三种；变波长三种；同步扫描技术可简化光谱，谱同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；率；如图。如图。合适的合适的ll可可减少光谱重叠；减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相酪氨
19、酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发 射 光 谱 严 重 重 叠，但似，发 射 光 谱 严 重 重 叠，但ll60nm时，只显示时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定色氨酸的特征光谱，实现分别测定。2022-8-1可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器可获得三维光谱图的仪器 可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧可获得激发光谱与发射光谱同时变化时的荧(磷磷)光光谱图光光谱图2022-8-1磷光检测磷光检测磷光检测磷光检测磷光检测磷光检测 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测
20、量。在有荧光发射的同时测量磷光。荧光发射的同时测量磷光。测量方法：测量方法：（1 1）通常借助于荧光和磷）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。镜的装置将荧光隔开。（2 2）采用脉冲光源和可控）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。检测及时间分辨技术。室温测量时，不需要室温测量时，不需要杜瓦瓶。杜瓦瓶。2022-8-112.4 12.4 12.4 荧光分析方法与应用荧光分析方法与应用荧光分析方法与应用荧光分析方法与应用荧光分析方法与应用荧光分析方法与应用1.特点特点(1)灵敏度高灵敏度高 比紫外比紫外-可见分光光度法高可见分光光度法高24个数量级个数
21、量级 检测下限：检测下限：0.10.1 g/cm-3(2)选择性强选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱(3)试样量少试样量少 缺点：缺点：应用范围小应用范围小2022-8-12.2.2.定量依据与方法定量依据与方法定量依据与方法定量依据与方法定量依据与方法定量依据与方法 (1)定量依据定量依据 荧光强度荧光强度 If正比于正比于吸收的光量吸收的光量Ia和荧光量子效率和荧光量子效率 ：If=Ia 由朗伯由朗伯-比耳定律：比耳定律：Ia=I0(1-10-l c)If=I0(1-10-l c)=I0(1-e-2.3 l c)浓度很低时，将括号
22、项近似处理后：浓度很低时，将括号项近似处理后：If=2.3 I0 l c =Kc2022-8-1(2)(2)(2)定量方法定量方法定量方法定量方法定量方法定量方法标准曲线法：标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；度，在标准曲线上求出浓度；比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；比较；2022-8-13.3.3.荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用荧光分析法
23、的应用荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定.(2)生物与有机化合
24、物的分析生物与有机化合物的分析 见表见表.2022-8-12022-8-12022-8-112.5 12.5 12.5 磷光分析法的应用磷光分析法的应用磷光分析法的应用磷光分析法的应用磷光分析法的应用磷光分析法的应用1.稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）；见表环化合物（致癌物质）；见表2.农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析 烟碱、降烟碱、新烟碱，烟碱、降烟碱、新烟碱，2，4-D等分析等分析 检测限检测限0.01 g/cm-3 3.药物分析和临床分析药物分
25、析和临床分析 见表见表2022-8-12022-8-12022-8-112.6 12.6 12.6 化学发光化学发光化学发光1.1.化学发光反应化学发光反应 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A +B =C +D*D*D+h（1）能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；能够发光的化合物大多为有机化合物，芳香族化合物；（2）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当）化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当 E=170300 kJ/mol；位于可见光区；位于可见光区；（3）发光持续时间较长，反应持续进行；发光持续时间较长，
26、反应持续进行；化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。2022-8-12.2.化学发光效率化学发光效率化学效率：化学效率：emcecl 参加反应的分子数参加反应的分子数发射光子的分子数发射光子的分子数参加反应分子数参加反应分子数激发态分子数激发态分子数 ce 发光效率：发光效率：激发态分子数激发态分子数产生光子数产生光子数 em 时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：tctIddclcl dc/dt 分析物参加反应的速率；2022-8-13.3.化学发光强度与化学发光分析的依据化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析
27、中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：cttcttIAttcl0cl0cldddd dc/dt=Kc；K 为反应速率常数。定性依据：定性依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：2022-8-14.4.化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1 1）气相化学发光反应）气相化学发光反应a.一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO +O3 NO2*NO2*NO2+h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与氧原子与SO2、NO、CO的发光反应的发光反应 O3
28、O2+O（1000 C石英管中进行）SO2 +O+O SO2*+O2 SO2*SO2*+h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；2022-8-1 O3 O2+O（1000 C石英管中进行石英管中进行）NO +O NO2*NO2*NO2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：4001400nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与CO的发光反应：的发光反应：CO +O CO2*CO2*CO2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：300500nm；灵敏度灵敏度1ng/cm-3；氧原子与氧原子与NO的发光反应：的发光反应：2022-8-1c.乙烯与乙烯与O3的发光反应的发光反应 乙
29、烯与乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：反应，生成激发态乙醛：CH2O*CH2O+h 最大发射波长：最大发射波长：435nm；对对O3的特效反应；线性响应的特效反应；线性响应范围范围1 ng/cm-3 1 g/cm-3；2022-8-1（2 2）火焰中的化学发光反应）火焰中的化学发光反应 在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；在富氢火焰中，也存在着很强的化学发光反应；a.一氧化氮一氧化氮 NO +H HNO*HNO*HNO +h 发射光谱范围：发射光谱范围：660770nm；最大发射波长：最大发射波长：690nm；在在富氢火焰中：富氢火焰中：NO2 +2H NO+H2O 该反应十分迅速；该反应
30、十分迅速；2022-8-1b.硫化物硫化物 挥发性硫化物挥发性硫化物SO2、H2S、CH3SH、CH3SCH3等等在富在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：SO2 +2H2 S +2H2O S +S 2S2*S2*S2 +h 发射光谱范围：发射光谱范围：350460nm；最大发射波长：最大发射波长：394nm；灵敏度：灵敏度：0.2 ng/cm-3；发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。2022-8-1（3 3）液相中的化学发光反应）液相中的化学发光反应 机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu
31、、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.150.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：反应过程：该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可测定这些金属离子。鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：反应过程：2022-8-15.5.化学与生物发光分析的应用化学与生物发光分析的应用（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、F
32、e2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等（2）可检测低至可检测低至 10-9 mol/L 的的H2O2；（3）间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样 氨基酸氨基酸 +O2 酮酸酮酸 +NH3 +H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖葡萄糖 +O2+H2O 葡萄糖酸葡萄糖酸 +H2O2 通过测定生成的通过测定生成的H2O2，确定，确定氨基酸、葡萄糖氨基酸、葡萄糖含量。含量。葡萄糖氧化酶2022-8-1 草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。2022-
33、8-1生物发光分析应用生物发光分析应用 1 1 在pH 78；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)：ATP +LH2+E+Mg2+AMP LH2 E+Mg ppi+2H+pH7-8复合物与氧反应，产生化学发光：AMP LH2 E+O2 氧化荧光素*+AMP+CO2+H2O氧化荧光素*氧化荧光素 +h最大发射波长562nm；2022-8-1生物发光分析应用生物发光分析应用 2 2 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反
34、应：NADH+FMA+H+NAD+FMNH2NADH脱氢酶FMNH2+RCHO+O2 FMN+RCOOH+H2O+h黄素酶最大发射波长495 nm；2022-8-1二、二、二、特点特点特点 characteristicscharacteristicscharacteristics1.1.灵敏度极高灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量2 2.仪器设备简单仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正；3.3.发射光强度测量无干扰发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰；4.4.线性范围宽线性范围宽5.5.分析速度快分析速度快缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。2022-8-12022-8-12022-8-1三、三、三、装置与技术装置与技术装置与技术 装置流程：装置流程：发光反应室发光反应室光检测器光检测器信号放大器信号放大器显示与记录显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静态方式静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差；流动注射方式流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；
