1、实验目的及要求实验目的及要求了解培养基配制原理，学习并掌握培养基制备方法。了解培养基配制原理，学习并掌握培养基制备方法。了解消毒与灭菌应用范围及基本原理，学习并掌握实验室常用消毒了解消毒与灭菌应用范围及基本原理，学习并掌握实验室常用消毒与灭菌方法。与灭菌方法。学习一些微生物的实验准备工作。学习一些微生物的实验准备工作。实验原理实验原理培养基的制备培养基的制备培养基：培养基：满足微生物生长的营养需要，人工配制的混满足微生物生长的营养需要，人工配制的混合营养基质。合营养基质。用途：用途：用于微生物的分离、培养、增殖、保藏及鉴定。用于微生物的分离、培养、增殖、保藏及鉴定。牛肉膏蛋白胨培养基（用于腐生
2、细菌的培养）牛肉膏蛋白胨培养基（用于腐生细菌的培养）马铃薯糖培养基（常用于培养真菌）马铃薯糖培养基（常用于培养真菌）高氏一号培养基（用于培养放线菌）高氏一号培养基（用于培养放线菌）配制原则配制原则 根据营养不同配制不同培养基根据营养不同配制不同培养基 注意各种营养物质的浓度及配比注意各种营养物质的浓度及配比 调节适宜的调节适宜的pHpH值值 考虑加生长因子考虑加生长因子 培养基应物美价廉培养基应物美价廉 灭菌处理灭菌处理培养基培养基1 1 根据化学组成分类根据化学组成分类完全用完全用天然物质或其浸出汁天然物质或其浸出汁配制。配制。成分不确定成分不确定。如肉汁、豆芽汁、牛乳、土豆汁是天然营养原料
3、。如肉汁、豆芽汁、牛乳、土豆汁是天然营养原料。酸奶、饮料酒、腐乳、酱类的发酵生产。酸奶、饮料酒、腐乳、酱类的发酵生产。优点：优点：配制方便，成本较低，营养丰富。生产上用配制方便，成本较低，营养丰富。生产上用缺点：缺点：成分不确定。成分不确定。（1 1）天然培养基：）天然培养基：培养基培养基培养基分类：培养基分类：（2 2）合成培养基）合成培养基全由全由化学成分已知化学成分已知的物质配制的培养基。的物质配制的培养基。成分确定成分确定。如：高氏培养基、察氏培养基。如：高氏培养基、察氏培养基。优点：优点：成分确定，重复性强，宜于科学研究成分确定，重复性强，宜于科学研究 如菌种选育，遗传分析。实验室用
4、。如菌种选育，遗传分析。实验室用。缺点：缺点：费用较高费用较高。培养基培养基（3 3）半合成培养基）半合成培养基由由部分天然物质部分天然物质和和一些成份已知的化学药品一些成份已知的化学药品配制而成。配制而成。如：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。如：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。优点：优点：营养成分更全面、均衡。营养成分更全面、均衡。实验室、发酵业用得最多。实验室、发酵业用得最多。培养基培养基2 2 根据物理状态分类根据物理状态分类（1 1）固体培养基固体培养基概念：概念：在液体培养基中加入在液体培养基中加入凝固剂凝固剂琼脂、明琼脂、明 胶、硅胶胶、硅胶等。等。常用的是琼脂（洋菜）。常用的是琼脂（洋菜）。琼琼
5、 脂加入量脂加入量1.51.52.02.0。成分为多缩半乳糖成分为多缩半乳糖绝大多数微生物不能利用绝大多数微生物不能利用融化温度融化温度96 96，凝固温度，凝固温度4545对微生物无毒性对微生物无毒性 固体培养基作用固体培养基作用培养菌落进行培养菌落进行分离、鉴定、计数、保藏分离、鉴定、计数、保藏琼脂的特性：琼脂的特性：培养基培养基（2 2）半固体培养基）半固体培养基（3 3）液体培养基）液体培养基加入凝固剂。加入凝固剂。琼脂加入量琼脂加入量0.20.20.5%0.5%作用：作用：观察细菌的运动状况。观察细菌的运动状况。不加凝固剂不加凝固剂用于用于发酵业发酵业。液体培养。液体培养。培养基培养
6、基（1 1）基础培养基）基础培养基概念：概念：含有微生物生长繁殖所需的含有微生物生长繁殖所需的基本营养物质。基本营养物质。用于用于普通微生物培养。普通微生物培养。细菌通用培养基细菌通用培养基牛肉膏蛋白胨培养基。牛肉膏蛋白胨培养基。真菌通用培养基真菌通用培养基马铃薯蔗糖培养基。马铃薯蔗糖培养基。培养基培养基（2 2）加富培养基）加富培养基在普通培养基中加入某些在普通培养基中加入某些特殊物质特殊物质或某些或某些生长生长素素，只适于一种或一类微生物的生长。只适于一种或一类微生物的生长。（3 3）选择培养基）选择培养基根据培养微生物的生理特性配制。可促进某种微根据培养微生物的生理特性配制。可促进某种微
7、生物生长，抑制某类微生物生长。生物生长，抑制某类微生物生长。如：加如：加青霉素的培养基青霉素的培养基，分离霉菌和酵母菌。，分离霉菌和酵母菌。加加1%1%酚酚分离放线菌分离放线菌 特点：特点：某种微生物富集逐渐淘汰其它各种微生物。某种微生物富集逐渐淘汰其它各种微生物。培养基培养基（4 4）鉴别培养基）鉴别培养基特点：特点：确保所培养的微生物有丰富的营养条件。确保所培养的微生物有丰富的营养条件。显示微生物的某些形态构造或生理代谢上显示微生物的某些形态构造或生理代谢上 的特点。的特点。如：如：伊红美兰培养基伊红美兰培养基区分大肠杆菌和产气肠杆菌。区分大肠杆菌和产气肠杆菌。（5 5）活体培养基）活体培
8、养基用某些活的动植物体或离体的生活组织细胞作用某些活的动植物体或离体的生活组织细胞作培养基。培养基。病毒培养。病毒培养。概念：概念：用以区别不同微生物种类的培养基。用以区别不同微生物种类的培养基。培养基培养基消毒与灭菌消毒与灭菌消毒：消毒：应用理化方法杀灭部分微生物（主要是病应用理化方法杀灭部分微生物（主要是病 原微生物）。原微生物）。灭菌：灭菌：应用理化方法杀灭物体上所有微生物。应用理化方法杀灭物体上所有微生物。类类型型一、加热高温灭菌一、加热高温灭菌 1.1.干热灭菌干热灭菌 火焰烧灼灭菌火焰烧灼灭菌 热空气灭菌热空气灭菌 2.2.湿热灭菌湿热灭菌 常压蒸汽灭菌常压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌高
9、压蒸汽灭菌 煮沸法灭菌煮沸法灭菌 超高温灭菌超高温灭菌二、紫外线灭菌二、紫外线灭菌三、过滤灭菌三、过滤灭菌四、化学药剂的消毒与灭菌四、化学药剂的消毒与灭菌消毒与灭菌消毒与灭菌一一.高温灭菌：高温灭菌：利用高温使菌体蛋白和核酸变性而失去活力以利用高温使菌体蛋白和核酸变性而失去活力以达到杀菌的目的。达到杀菌的目的。二二.紫外线灭菌：紫外线灭菌：诱发菌体核酸结构变异，及使空气中氧电诱发菌体核酸结构变异，及使空气中氧电离、水氧化而产生杀菌化学物质以杀灭杂菌。离、水氧化而产生杀菌化学物质以杀灭杂菌。三三.过滤除菌：过滤除菌：将处理的含菌液体或气体通过细菌过滤器，使将处理的含菌液体或气体通过细菌过滤器，使
10、杂菌被机械截留从而达到除菌。杂菌被机械截留从而达到除菌。四四.化学药剂的消毒和灭菌：化学药剂的消毒和灭菌：杀菌剂（破坏微生物的代谢机杀菌剂（破坏微生物的代谢机能并有致死作用）；消毒剂；防腐剂（抑制微生物的生长繁能并有致死作用）；消毒剂；防腐剂（抑制微生物的生长繁殖）。殖）。消毒与灭菌消毒与灭菌利用温度的灭菌方法利用温度的灭菌方法 高温灭菌高温灭菌：蛋白质凝固变性，酶失活。蛋白质凝固变性，酶失活。高温灭菌高温灭菌干热灭菌干热灭菌湿热灭菌湿热灭菌火焰灭菌火焰灭菌烘箱内干燥热空气灭菌烘箱内干燥热空气灭菌巴斯德消毒法巴斯德消毒法间歇灭菌法间歇灭菌法高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法消毒与灭菌消毒与灭菌1 1
11、 干热灭菌干热灭菌(dry heat sterilization)(dry heat sterilization)1）火焰灭菌）火焰灭菌：接种时的用具如接种环等接种时的用具如接种环等无经济价值的物体。无经济价值的物体。特点：特点：彻底、迅速。彻底、迅速。2）干燥热空气箱灭菌）干燥热空气箱灭菌 用法：用法：160-170,2160-170,2小时（利用热空气灭菌小时（利用热空气灭菌 )特点：特点：由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态由于空气传热穿透力差，菌体在脱水状态 下不易杀死。所以温度高、时间长。下不易杀死。所以温度高、时间长。消毒与灭菌消毒与灭菌2 2 湿热灭菌湿热灭菌(利用饱和热蒸汽灭菌
12、利用饱和热蒸汽灭菌)1）巴斯德消毒法）巴斯德消毒法 (pasteurization)(pasteurization)a a 方法：方法：636366-30min 66-30min 或或71-15min71-15min 或或135 or 150 -2sec135 or 150 -2sec b b 特点：不破坏营养物质，并杀死病原菌特点：不破坏营养物质，并杀死病原菌。c c 适用：牛奶、饮料等食品生产。适用：牛奶、饮料等食品生产。消毒与灭菌消毒与灭菌2 2）间歇灭菌法）间歇灭菌法 a a 方法：方法：2828 3724h3724h培养培养 37 24h37 24h培养培养100/15100/153
13、0min 30min 100/15100/1530min 30min 100/15100/1530min30min 用水蒸汽把培养基加热到用水蒸汽把培养基加热到100100，分几次蒸煮以，分几次蒸煮以 达到彻底灭菌又保护营养成分的目的。达到彻底灭菌又保护营养成分的目的。b b 适用：适用：营养含量高、不适于用高压蒸汽灭菌的特殊培养基、营养含量高、不适于用高压蒸汽灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。此法麻烦、周期长。药品的灭菌。此法麻烦、周期长。消毒与灭菌消毒与灭菌2 2 湿热灭菌湿热灭菌(利用饱和热蒸汽灭菌利用饱和热蒸汽灭菌)3 3）高压蒸汽灭菌法）高压蒸汽灭菌法:利用水的沸点随水蒸气压力的增加利用
14、水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，提高温度以达到高温灭菌目的方法。而上升，提高温度以达到高温灭菌目的方法。a a 方法：方法：一般一般121121（1kg/cm1kg/cm2 2或或1515磅磅/英寸英寸2 2）20min-30min20min-30min。b b 适用：适用：耐高温物品如培养基，无菌水，培养皿。耐高温物品如培养基，无菌水，培养皿。c c 注意事项：注意事项：灭菌开始排净冷空气；灭菌开始排净冷空气；灭菌终了，缓慢降压；灭菌终了，缓慢降压；灭菌结束，趁热取出物品。灭菌结束，趁热取出物品。消毒与灭菌消毒与灭菌2 2 湿热灭菌湿热灭菌(利用饱和热蒸汽灭菌利用饱和热蒸汽灭菌)干热灭菌的
15、操作包扎。包扎。装箱装箱（物品不可与灭菌箱内壁接触，且不可摆放过挤）（物品不可与灭菌箱内壁接触，且不可摆放过挤）灭菌灭菌（启动开关，并打开排气孔，待温度升至（启动开关，并打开排气孔，待温度升至80-10080-100关关闭排气孔，继续升温至闭排气孔，继续升温至160-170 160-170 计时，恒温计时，恒温2 2小时）小时）降温，取物降温，取物（关闭电源，自然降温到（关闭电源，自然降温到6060度开箱取物）度开箱取物）消毒与灭菌消毒与灭菌消毒与灭菌消毒与灭菌高压蒸汽灭菌的操作高压蒸汽灭菌的操作灭菌前准备灭菌前准备（在锅内加适量水）。（在锅内加适量水）。装放物品装放物品（不要过挤，且容器口端
16、不要与物品接触）（不要过挤，且容器口端不要与物品接触）加热放气加热放气（打开放气阀，待有大量水汽排出，维持（打开放气阀，待有大量水汽排出，维持3 35 5分钟，分钟，锅内空气排尽，关上放气阀）锅内空气排尽，关上放气阀）升温保压升温保压（温度，压力升至灭菌所需时计时，压力（温度，压力升至灭菌所需时计时，压力1.05Kg/cm1.05Kg/cm2 2,121.3 ,121.3 ，20203030分钟）分钟）出锅出锅（关闭电源，待指针回零，打开放气阀，稍等一些时间，（关闭电源，待指针回零，打开放气阀，稍等一些时间，再取物）再取物）消毒与灭菌消毒与灭菌消毒与灭菌消毒与灭菌 湿热灭菌较干热灭菌效果好湿热
17、灭菌较干热灭菌效果好1)1)特点：特点：温度低、时间短、灭菌效果好。温度低、时间短、灭菌效果好。2)2)灭菌效果好的原因：灭菌效果好的原因：菌体内含水量越高凝固温度越低。菌体内含水量越高凝固温度越低。蒸汽冷凝会放出潜热。蒸汽冷凝会放出潜热。饱和水蒸汽穿透力强。饱和水蒸汽穿透力强。消毒与灭菌消毒与灭菌实验内容实验内容分组操作：分组操作：分分8 8组，组，7878人人1 1组。每组需要做的工作。组。每组需要做的工作。（1 1）1 1、2 2、3 3、4 4、5 5组做牛肉膏蛋白胨培养基。每组做组做牛肉膏蛋白胨培养基。每组做600ml600ml。装。装试管试管1010支支，余下装三角瓶。，余下装三角
18、瓶。（2 2）6 6、7 7、8 8组做马铃薯糖培养基。每组组做马铃薯糖培养基。每组200ml200ml。装。装试管试管1010管管，余下装三角瓶。，余下装三角瓶。（3 3）每组包）每组包 1 ml1 ml 吸管吸管8-98-9支。（支。（示范）示范）（4 4）每组包）每组包10 ml10 ml吸管吸管3 3支支（5 5）每组装）每组装9 ml9 ml无菌水无菌水1010管管。（示范）（示范）（6 6）每组包）每组包培养皿培养皿2 2包包（每包（每包6 6个）（示范）个）（示范）（7 7）装锅灭菌。）装锅灭菌。1 1牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基（用于腐生细菌的培养）（用于腐生细菌的培养
19、）（1 1）培养基组成：培养基组成：牛肉膏牛肉膏 3g 3g 蛋白胨蛋白胨 10g10g NaCl 5g NaCl 5g 琼脂琼脂 18-20g18-20g 水水 1000ml1000ml PH 7.0-7.2 PH 7.0-7.2（2）配置方法）配置方法称量：称量：溶化：电炉加热熔化溶化：电炉加热熔化调节调节PHPH：分装：试管和三角瓶分装：试管和三角瓶包扎：双层纸和绳子。包扎：双层纸和绳子。灭菌：高压蒸汽灭菌。灭菌：高压蒸汽灭菌。实验内容（2 2）配制方法：配制方法：称量：称量：注意马铃薯去皮后切成丝称量。注意马铃薯去皮后切成丝称量。溶化：将马铃薯丝放入水中置于电炉上加热并不断溶化：将马铃
20、薯丝放入水中置于电炉上加热并不断搅拌，煮沸搅拌，煮沸510min510min，用，用多层纱布过滤得滤液多层纱布过滤得滤液，在，在滤液中加入其他滤液中加入其他药品药品，不断搅拌直至完全溶解。，不断搅拌直至完全溶解。分装：分装：包扎：包扎：灭菌：灭菌：2 2马铃薯糖培养基马铃薯糖培养基（通常用于培养真菌）（通常用于培养真菌）（1 1）培养基组成：培养基组成：马铃薯马铃薯 200 g200 g 葡萄糖或蔗糖葡萄糖或蔗糖 20 g20 g 琼脂琼脂 18-20 g 18-20 g 水水 1000ml1000ml PH PH 自然自然实验内容3 3、高压蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌（1 1）灭菌前的准备灭菌前
21、的准备：将高压蒸汽灭菌锅的内桶取出，向外：将高压蒸汽灭菌锅的内桶取出，向外锅内锅内 加入适量的水，将内桶放入。加入适量的水，将内桶放入。（2 2）装放待灭菌物品装放待灭菌物品：将已包扎好的物品放入内桶。盖上：将已包扎好的物品放入内桶。盖上锅盖，以锅盖，以两两对称两两对称方式同时旋紧螺栓，勿使漏气。方式同时旋紧螺栓，勿使漏气。（3 3）加热排气加热排气：接通热源，同时打开排气阀，待见有大量：接通热源，同时打开排气阀，待见有大量水汽排出时，维持水汽排出时，维持3-5min3-5min，锅内空气排尽，关上排气阀。，锅内空气排尽，关上排气阀。（4 4）升温保压升温保压：压力为压力为1.05kg/cm1
22、.05kg/cm2 2（121.3121.3）,20-30min,20-30min（5 5）出锅出锅：隔断热源，自然降温，待：隔断热源，自然降温，待压力表指针回到零，压力表指针回到零，打开排气阀，稍等一些时间，再开盖取物。打开排气阀，稍等一些时间，再开盖取物。实验内容 实验报告实验报告 （1 1）培养微生物的培养基应具备哪些条件？培养微生物的培养基应具备哪些条件？（2 2）为什么培养基配制好后必须立即灭菌？为什么培养基配制好后必须立即灭菌？（3 3）在培养基中，琼脂有何作用？它有哪些特性？在培养基中，琼脂有何作用？它有哪些特性？（4 4）使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时应注意哪些事项？使用高压蒸汽灭菌
23、锅灭菌时应注意哪些事项？（5 5）比较干热灭菌与高压蒸汽灭菌的异同。比较干热灭菌与高压蒸汽灭菌的异同。自主设计性实验自主设计性实验（学生综合实验技能训练）（学生综合实验技能训练）自自 主主 设设 计计 性性 实实 验验（每（每5 5个学生个学生1 1组）组）结合已做过的实验，每组选择一个自己感结合已做过的实验，每组选择一个自己感兴趣的综合设计性实验选题，从实验的设兴趣的综合设计性实验选题，从实验的设计、准备、实验操作、实验结果的分析到计、准备、实验操作、实验结果的分析到最后实验报告的完成都由学生自己动手完最后实验报告的完成都由学生自己动手完成，教师对设计报告的科学性、可行性把成，教师对设计报告
24、的科学性、可行性把关、指导，并指导学生实验。关、指导，并指导学生实验。参考选题：参考选题：1 1、嗜盐菌的分离及初步鉴定、嗜盐菌的分离及初步鉴定2 2、产淀粉酶菌株的分离及初步鉴定、产淀粉酶菌株的分离及初步鉴定3 3、葡萄皮上菌种分离及葡萄酒发酵、葡萄皮上菌种分离及葡萄酒发酵 4 4、常见水果滋生真菌分离及初步鉴定、常见水果滋生真菌分离及初步鉴定 5 5、常见蔬菜腐烂滋生细菌分离及初步鉴定、常见蔬菜腐烂滋生细菌分离及初步鉴定6 6、实验室环境和人体表面微生物的检查、实验室环境和人体表面微生物的检查7 7、米酒的酿造、米酒的酿造8 8、平菇子实体菌丝的分离纯化和菌丝生长检测、平菇子实体菌丝的分离纯化和菌丝生长检测9 9、香菇子实体菌丝的分离纯化和菌丝生长检测、香菇子实体菌丝的分离纯化和菌丝生长检测
