1、一、课题目标一、课题目标 本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。二、课题重点与难点二、课题重点与难点课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。有不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和
2、提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。思考思考3 人们用鸡的红细胞提取人们用鸡的红细胞提取DNA，用，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行，便于进行DNA的提取，哺乳的提取，哺乳动物的红细胞无细胞核，结构简单，动物的红细胞无细胞核，结
3、构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。白。一、基础知识：一、基础知识：凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）1、凝胶、凝胶 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由的通道，由多糖类化合物多糖类化合物构成构成,如葡聚糖、如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）。琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）。2、凝胶色谱法的概念、凝胶色谱法的概念 根据被分离的蛋白质根据被分离的蛋白质相对分子质量相对分子质量的的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行蛋白质分离。作用，来进行蛋白质分离。3、
4、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（）的蛋白质容易进）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（入凝胶内部的通道，路程（），移动），移动速度（速度（）；而）；而(）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（在（）移动，路程（）移动，路程（），），移动速度（移动速度（），相对分子质量不同），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。的蛋白质因此得以分离。4、具体过程、具体过程分子质量较小分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快 1、概念：在一定的范围内，能对抗外、概念：在一定的
5、范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做发生明显变化的作用叫做缓冲作用缓冲作用，具，具有缓冲作用的溶液叫做有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液缓冲溶液。缓冲溶液：缓冲溶液：2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（）的对溶液）的对溶液的（的（）的影响，维持）的影响，维持PH基本不变。基本不变。外界的酸或碱外界的酸或碱PH 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制 通常由（通常由（）种缓冲剂溶解于水）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（就可以制得（）使用的）使用的缓冲液。缓冲液。12使用比例使用
6、比例在不同在不同PH范围内范围内思考：思考：说出人体血液中的缓冲对。说出人体血液中的缓冲对。NaH2PO4 /Na2HPO4H2CO3 /NaHCO3电泳电泳1、概念：指带电粒子在、概念：指带电粒子在电场的作用电场的作用下发生下发生 迁移迁移的过程。的过程。思考：思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？冲液是什么？它的目的是什么？使用的是使用的是磷酸缓冲液磷酸缓冲液，目的是利用缓，目的是利用缓冲液模拟细胞内的冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研
7、究（活性）。和材料的科学研究（活性）。2、原理：许多重要的生物大分子，如、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有）等都具有()在在()下，这些基团会带上下，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（带电分子会向着与其（）电极移动。电泳利用了待分离样品中各种电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（分子（）以及分子本身）以及分子本身的（的（）、（）、（）的不同使带电分）的不同使带电分子产生不同的（子产生不同的（），从而实现），从而实现样品中各种分子的分离。样品中各种分子的分离。多肽、核酸多肽、核酸可解离的基团可解离的基团正电或负电正电或负电所带电荷相反
8、的所带电荷相反的带电性质的差异带电性质的差异大小大小形状形状迁移速度迁移速度一定的一定的PH聚丙烯酰胺凝胶：聚丙烯酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-N,N-甲叉甲叉双丙烯酰胺在引发剂双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵）和催化过硫酸铵）和催化剂（四甲基已二胺）的作用下剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。的具有三维网状结构的凝胶。3、分类、分类琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定（测定（）时，）时，通常用十二烷基硫酸钠通常用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。蛋白质相
9、对分子质量蛋白质相对分子质量 为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入中加入()()。SDSSDS能使蛋白质发生能使蛋白质发生完全变完全变性性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDSSDS的作的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()()。SDSSDS能与各种蛋白质能与各种蛋白质形成蛋白质形成蛋白质-SDS-SDS复合物，复合物，SDSSDS所带负电荷的量大所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差
10、别，使电泳迁移率完全不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于取决于()()。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带它所带的多少以及的多少以及等因素。等因素。SDS单条肽链的分子量单条肽链的分子量分子的大小分子的大小 聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子子大得多大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，酸根，核酸带负电荷核酸带负电荷，在电场中向正极，在电场中向正极
11、移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以据荧光条带的粗细和分布的位置，可以用在对用在对PCR扩增效果的鉴定上。扩增效果的鉴定上。说说 明明二、实验操作二、实验操作蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：1.样品处理样品处理水分水分固体物质固体物质血浆蛋白血浆蛋白无机盐无机盐磷脂磷脂葡萄糖等葡萄糖等血血液液血浆血浆血细胞血细胞白细胞白细胞血小板血小板红细胞红细胞（最多）（最多）血红血红蛋白蛋白（）两个两个-肽链肽链两个两个-肽链肽链样品处理样品
12、处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定90 目的目的：去除（：去除（），以利于后续），以利于后续步骤的分离纯化。步骤的分离纯化。方法方法：（）离心（速度越离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（吸管吸出上层透明的（），将下），将下 每条肽链环绕（每条肽链环绕（），此），此基团可携带（基团可携带（）。血红）。血红蛋白因含有（蛋白因含有（）而呈红色。）而呈红色。一个亚铁血红素基团一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子一分子氧或一分子COCO2 2血红素血红素(1)红
13、细胞的洗涤红细胞的洗涤杂蛋白杂蛋白低速短时间低速短时间黄色血浆黄色血浆1.样品处理样品处理层（层（）的红细胞液体倒入烧杯，）的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的（再加入五倍体积的（）（质）（质量分数为量分数为0.90.9的氯化钠溶液的氯化钠溶液），缓慢），缓慢搅拌搅拌10min10min，低速短时间离心，如此，低速短时间离心，如此重重复洗涤（复洗涤（）次，直至上清液中没）次，直至上清液中没有（有（），表明红细胞已洗涤干净。），表明红细胞已洗涤干净。生理盐水生理盐水三三黄色黄色暗红色暗红色(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放 加（加（）到（）到（）体）体积，再加积，再加40体积的（体积的（）（）
14、（溶解细溶解细胞膜胞膜），置于（，置于（）上充分搅）上充分搅拌拌10分钟（加速细胞破裂）分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释细胞破裂释放出血红蛋白。放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以液转移到离心管内，以2000r/min的的速度离心速度离心10 min，试管中的溶液分为，试管中的溶液分为4层层:原血液原血液甲苯甲苯磁力搅拌器磁力搅拌器蒸馏水蒸馏水第第1层（最上层）：层（最上层）：（）甲苯层）甲苯层第第2层（中上层）：层（中上层）：（）的沉淀层，的沉淀层，（）色薄层固体）色薄层固体第第3层（中下层）：层（中下层）：（）的水溶液层的水溶
15、液层 （）的液体）的液体 第第4层（最下层）：层（最下层）：其它杂质（其它杂质（）的沉淀层）的沉淀层无色透明无色透明脂溶性物质脂溶性物质白白血红蛋白血红蛋白红色透明红色透明暗红色暗红色 用滤纸用滤纸过过滤滤，除去脂溶，除去脂溶性沉淀层，于性沉淀层，于分液漏斗中静分液漏斗中静置片刻后，置片刻后，分分出下层的红色出下层的红色透明液体。透明液体。有机溶剂有机溶剂脂类物质脂类物质血红蛋白溶液血红蛋白溶液红细胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 取取1mL的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入（）中，将透析袋放入盛有）中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/L的的（）中，）中，
16、pH为（为（），），透析透析12小时。目的是小时。目的是（）或）或用于更换样品中的（用于更换样品中的（）。）。透析袋一般用透析袋一般用硝酸纤维素硝酸纤维素（玻璃（玻璃纸）制成。纸）制成。除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质透析袋透析袋磷酸缓冲液磷酸缓冲液7.0缓冲液缓冲液(4)透析透析2.凝胶色谱操作凝胶色谱操作1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作取长取长4040厘米，内径厘米，内径1.61.6厘米的玻璃管，两厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。端需用砂纸磨平。柱底部的制作：柱底部的制作：打孔打孔 挖出凹穴挖出凹穴 安装移液管头部安装移液管头部 覆盖尼龙网覆盖尼龙网，再用，再用1
17、00100目尼龙纱包好。目尼龙纱包好。a a、选择合适的的橡皮塞，、选择合适的的橡皮塞，中间打孔；中间打孔；b b、在橡皮塞上部切出锅底状的、在橡皮塞上部切出锅底状的（），在），在0.5mL0.5mL的（的（）头部切）头部切下（下（）长的一段，插入橡皮塞孔内，）长的一段，插入橡皮塞孔内，上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。上部不得超过橡皮塞的凹穴底面。凹穴凹穴移液管移液管5cm5cmc.c.剪尼龙网小圆片覆盖在剪尼龙网小圆片覆盖在橡皮塞的橡皮塞的凹面凹面上，用上，用100目目的尼龙纱将橡皮塞的尼龙纱将橡皮塞上部上部包好，插到玻璃管一端。包好，插到玻璃管一端。d d、色谱柱下端用移液头部做、色谱柱下端
18、用移液头部做出口部出口部位位，连接一细的，连接一细的尼龙管尼龙管，并用螺旋，并用螺旋夹控制尼龙管的夹控制尼龙管的打开与关闭打开与关闭，另一，另一端放入收集端放入收集色谱流出液色谱流出液的收集器内。的收集器内。安装其他附属结构。安装其他附属结构。顶塞的制作：顶塞的制作：插入安装了玻璃管的橡皮塞插入安装了玻璃管的橡皮塞组装：将上述三者按相应位置组装成一组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体个整体。2）凝胶色谱柱填料的处理）凝胶色谱柱填料的处理（1 1）凝胶的选择：）凝胶的选择：（）（）（G-75G-75）“G G”表示凝胶的表示凝胶的交联程度交联程度，膨胀程度，膨胀程度 及分离范围。及分离范围。
19、7575表示凝胶的表示凝胶的得水值得水值，即每克凝胶，即每克凝胶 膨胀时吸水膨胀时吸水7.57.5克。克。（2 2）方法：）方法：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于（的凝胶浸泡于（）中充分溶胀后，）中充分溶胀后，配成（配成（）。）。蒸馏水蒸馏水凝胶悬浮液凝胶悬浮液交联葡聚糖凝胶交联葡聚糖凝胶固定：将色谱柱垂直固定在支架上。固定：将色谱柱垂直固定在支架上。装填：装填：将将（）一次性的缓慢一次性的缓慢倒入（倒入（）内，装填时轻轻敲动色）内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。谱柱，使凝胶填装均匀。（3）凝胶色谱柱的装填方法）凝胶色谱柱的装填方法凝胶悬浮液
20、凝胶悬浮液色谱柱色谱柱注意：注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气泡存在：泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。的洗脱次序，降低分离效果。你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？的装填要紧密、均匀吗？凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能
21、进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离
22、。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，影响分离的效果。，影响分离的效果。洗涤平衡洗涤平衡 装填完毕后，立即连接缓装填完毕后，立即连接缓冲液洗脱瓶，在约冲液洗脱瓶，在约()()高的高的操作压操作压下，用下，用300mL300mL的的20mmol/L的的磷酸缓冲液磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡）充分洗涤平衡1212小时，小时，使凝胶装填紧使凝胶装填紧密密。50cm50cm3 3）样品的加入与洗脱）样品的加入与洗脱加样前加样前 打开下端
23、流出打开下端流出口，使柱内凝胶面口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，降到与凝胶面平齐，关闭出口。关闭出口。加透析样品加透析样品3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱调整缓冲液面调整缓冲液面：与凝胶面平齐。：与凝胶面平齐。滴加透析样品滴加透析样品：用吸管将：用吸管将1mL透析透析后的样品加到色谱柱的顶端。后的样品加到色谱柱的顶端。样品渗入凝胶床样品渗入凝胶床：样品完全进入凝：样品完全进入凝胶层。胶层。洗脱洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱。脱。收集收集：待红色的蛋白质接近色谱柱：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每底端时，用试
24、管收集流出液，每5mL收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做选做）判断纯化的蛋白质是否达到要求，判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。需要进行蛋白质的鉴定。思考：思考：与其他真核细胞相比，红细胞有什与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？离有什么意义？3.SDS3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 鉴定血红蛋白纯度鉴定血红蛋白纯度（1 1）试剂的配制）试剂的配制丙烯酰胺和丙烯酰胺和N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 用去离用去离子
25、水配制子水配制29%29%（29 g/100 mL29 g/100 mL，下同）的丙烯酰，下同）的丙烯酰胺和胺和1%1%的的N,N-N,N-甲叉双丙烯酰胺的贮存液甲叉双丙烯酰胺的贮存液十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）用去离子水配成用去离子水配成10%10%的贮存液，于室温保存。的贮存液，于室温保存。用于制备分离胶和浓缩胶的用于制备分离胶和浓缩胶的TrisTris缓冲液缓冲液 TEMED TEMED：作用通过催化过硫酸铵形成自由：作用通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。用去离子水配制用去离子水配制10%10%过硫酸铵：作用
26、提供驱过硫酸铵：作用提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液须配制新鲜液。基。此溶液须配制新鲜液。TrisTris甘氨酸电泳缓冲液甘氨酸电泳缓冲液 25 mmol/L Tris25 mmol/L Tris，250 mmol/L 250 mmol/L 甘氨酸甘氨酸 (pH 8.3)(pH 8.3)，0.1%0.1%的的SDSSDS。样品处理液样品处理液 50 mmol/L Tris50 mmol/L TrisHCl(pH HCl(pH 6.8)6.8)，100 mmol/L DTT(100 mmol/L DTT(巯基苏糖醇巯基苏糖醇)或用或用5
27、%5%的巯基乙醇，的巯基乙醇，2%2%的的SDSSDS，0.1%0.1%的溴酚蓝，的溴酚蓝，10%10%的甘油。的甘油。染色液染色液 0.1%0.1%的考马斯亮蓝的考马斯亮蓝R250R250，40%40%的甲的甲醇，醇，10%10%的冰醋酸的冰醋酸脱色液脱色液 10%10%的甲醇和的甲醇和10%10%的冰醋酸。的冰醋酸。由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯由于制备凝胶的丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被酰胺具有很强的神经毒性，并且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。通风处进行。TEMEDTEMED和过硫酸胺对黏膜和过硫酸胺对黏膜和上呼
28、吸道组织、眼睛、皮肤等有很大和上呼吸道组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤完电泳操作时一定按照实验要求和步骤完成。操作时要戴好一次性手套。成。操作时要戴好一次性手套。聚丙烯酰胺凝胶电泳装置聚丙烯酰胺凝胶电泳装置及其原理示意图及其原理示意图 SDS-SDS-聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺分离胶制备分离胶制备1)根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板根据厂家说明书安装电泳用的玻璃板2 2）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶制备制备 用去离子水用去离子水4.6 mL4.6 mL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺2.7 2.
29、7 mLmL，1.5mol1.5mol、pH 8.8pH 8.8的的TrisTris缓冲液缓冲液2.5 mL2.5 mL，10%10%的的SDS 0.1 mLSDS 0.1 mL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.1 mL0.1 mL，TEMED 0.006mLTEMED 0.006mL，混合均匀，迅速灌注在两玻，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加梳子的齿长再加0.5 cm)0.5 cm)，再在胶液面上小心，再在胶液面上小心注入一层水（约高注入一层水（约高2 23 mm3 mm），以阻止氧气进），以阻止氧气
30、进入凝胶溶液。入凝胶溶液。（2 2）电泳方法步骤）电泳方法步骤配制配制SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水用去离子水2.7 mL2.7 mL，30%30%的丙烯酰胺的丙烯酰胺0.67 mL0.67 mL，1.0 mol1.0 mol、pH 6.8pH 6.8的的TrisTris缓冲液缓冲液0.5 mL0.5 mL，10%10%的的SDS0.041 mLSDS0.041 mL，10%10%的过硫酸胺的过硫酸胺0.04 mL0.04 mL，TEMED TEMED 0.004 mL0.004 mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离，混合均匀，直接灌注在聚合
31、的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。将凝胶垂直放置于室温下聚合。分离胶聚合完全后（约分离胶聚合完全后（约30 min30 min），倾出覆盖），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。水层，再用滤纸吸净残留水。3 3）样品处理）样品处理5)5)加样加样在电泳样品中按在电泳样品中按1111体积比加入样品处理液，体积比加入样品处理液，在在100 100 温度下加热温
32、度下加热3 min3 min，以使蛋白质变性。，以使蛋白质变性。按顺序加样，加样量通常为按顺序加样，加样量通常为101025 L25 L。样。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后品可以多加几个，例如，血浆样品红细胞破碎后(即进行凝胶色谱分离之前即进行凝胶色谱分离之前)的样品和凝胶色谱分的样品和凝胶色谱分离之后的样品。离之后的样品。4 4）浓缩胶聚合完全后（）浓缩胶聚合完全后（30 min30 min），小心移出梳），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入TrisTris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝
33、胶底部两玻璃板之间的气泡。底部两玻璃板之间的气泡。7 7）剥胶）剥胶 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻从电泳装置上卸下玻璃板，用刮刀撬开玻璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下璃板。将紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角，以标注凝胶的方位。部切去一角，以标注凝胶的方位。8 8）染色）染色 将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染将电泳凝胶片放在考马斯亮蓝染色液中染色色1-2 h1-2 h。6)6)电泳电泳 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8 8 V/cmV/cm。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高。当染料前沿进入分离胶后，把电压提高到到15 V/
34、cm15 V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约底部上方约1 cm1 cm处，关闭电源。处，关闭电源。10)10)观察结果：观察结果：9)9)脱色：脱色：染色完毕，倾出染色液染色完毕，倾出染色液,换脱色液脱换脱色液脱色色3-10 h3-10 h，其间需多次更换脱色液至背景，其间需多次更换脱色液至背景清楚。清楚。观察你处理的血液样品离心后是否观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图分层（见教科书图5-185-18），如果分层不），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和浆蛋白的原
35、因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。续血红蛋白的提取纯度。三三、实验结果分析与评价、实验结果分析与评价 1.你是否完成了对血液样品的处理？你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？2.你填装的凝胶色谱柱中是否有气泡你填装的凝胶色谱柱中是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？何判断的？3.你能观察到蛋白质的分离过程中，你能观察到蛋白质的分
36、离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离结果。动情况，并据此判断分离结果。凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩色谱柱内进行两
37、种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，程较长，移动速度较慢。因此，这种现象又叫，这种现象又叫。此外，凝胶本身具。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种
38、网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。同分子量的蛋白质分子可以获得分离。在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液加稀释不引起溶液pHpH发生明显变化的作用叫做发生明显变化的作用叫做，具有缓冲作用的溶液叫做具有缓冲作用的溶液叫做。缓冲溶液通常是由。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同剂的配比就可制得不同pHpH范围的缓冲液。
39、范围的缓冲液。缓冲溶液的作用是缓冲溶液的作用是。在生。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pHpH下进行下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的化学反应过程有与体内过程完全相同的pHpH。电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、
40、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的它们在某个特定的pHpH下会带上正电或负电；在电下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到产生不同的迁移速度，从而达到的目的。的目的。血红蛋白提取和分离的程序可分
41、为血红蛋白提取和分离的程序可分为，包括：，包括：、和和。首先通过。首先通过洗涤洗涤红细胞、血红蛋白的红细胞、血红蛋白的释释放放、离心离心等操作收集到血红蛋白溶液，即等操作收集到血红蛋白溶液，即；再经过；再经过透析透析去除分子量较小的杂去除分子量较小的杂质，即样品的质，即样品的；然后通过；然后通过凝胶色谱法凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的的；最后经；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进行。血红蛋白是有色蛋白，因此血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。非常直观，大大简化了实验操作。
