1、酶酶 免免 疫疫 技技 术术 Enzyme Immunoassay 侯侯 珏珏临临 床床 微微 免免 教教 研研 室室.目的要求目的要求1掌握酶联免疫吸附试验的原理、方法类型掌握酶联免疫吸附试验的原理、方法类型及各类型原理及各类型原理2.掌握酶免疫技术的必要试剂掌握酶免疫技术的必要试剂3熟悉膜载体的酶免疫测定熟悉膜载体的酶免疫测定4熟悉酶免疫技术的分类熟悉酶免疫技术的分类5熟悉酶免疫技术的特点熟悉酶免疫技术的特点6了解酶免疫测定的应用了解酶免疫测定的应用.标记免疫技术=抗原抗体反应示踪物标记灵敏性特异性标记免疫技术的主要特点：高特异性、高灵敏性免疫技术+标记技术标记免疫技术标记免疫技术一、基本
2、概念一、基本概念免疫技术免疫技术 :Ag+Ab AgAb 测定复合物中的标记物测定复合物中的标记物 Ag*+Ab Ag*Ab.二、分类：二、分类：按检测对象分类按检测对象分类 免疫组化技术免疫组化技术:（immunohistochemical techniqueimmunohistochemical technique）组织切片标本 免疫测定免疫测定（immunoassayimmunoassay）:液体标本.分类：分类：根据标记物不同根据标记物不同 荧光免疫技术 放射免疫分析 传统三大标记技术 酶免疫技术 发光免疫技术 金免疫技术 生物素-亲和素免疫技术 .酶免疫技术酶免疫技术(Enzyme
3、Immunoassay)概述概述n酶免疫技术定义酶免疫技术定义:Ag-E+Ab E-Ag Ab Ab-E+Ag Ag Ab-E 抗原抗体的免疫反应抗原抗体的免疫反应 +酶酶的高效催化作用的高效催化作用 底物底物 定性、定量分析定性、定量分析.一、一、技术要点：技术要点：试剂的制备试剂的制备 反应条件的选择反应条件的选择 操作的标准化操作的标准化.必要的试剂：必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂免疫吸附剂”（immunosorbent）（2）酶标记的抗原或抗体，称为）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物结合物”（conjugate）（3）酶反应的底物）酶反应的底物
4、 (substrate).其他试剂：其他试剂：1、对照品和参考品、对照品和参考品阳性对照品（阳性对照品（positive control，PC）阴性对照品（阴性对照品（negtive control，NC）参考标准品：定量测定时制作标准曲线用参考标准品：定量测定时制作标准曲线用2、洗涤液：常用、洗涤液：常用PBS3、终止液：强酸或强碱、终止液：强酸或强碱.（一）（一）酶和底物酶和底物 一）酶的适用要求：一）酶的适用要求：1 1、催化效率高催化效率高2 2、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定3 3、酶催化、酶催化底物产物应易于判定或测定底物产物应易于判定或测定4 4、
5、酶活性不受样品中其它成分的影响、酶活性不受样品中其它成分的影响5 5、酶、酶、底物等性质稳定、价廉易得底物等性质稳定、价廉易得,对人体无危害对人体无危害二）常用的酶：二）常用的酶：辣根过氧化酶（辣根过氧化酶（horseradish peroxidase,HRPHRP）碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,APAP）其他：其他：葡萄糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等半乳糖苷酶和脲酶等.1 1、辣根过氧化酶、辣根过氧化酶 （horseradish peroxidase,HRPHRP）（1 1）分子结构：）分子结构：主酶（糖蛋白）主酶（糖蛋白）:在在275n
6、m275nm波长处有最高吸收峰波长处有最高吸收峰 辅基（亚铁血红素）：酶活性基团辅基（亚铁血红素）：酶活性基团 在在403nm403nm波长处有最高吸收峰波长处有最高吸收峰.（2 2）HRPHRP的底物的底物 ：HRP HRP催化的反应式：催化的反应式：DH DH2 2+H+H2 2O O2 2 D+H D+H2 2O O DHDH2 2为供为供氢氢体，体，H H2 2O O2 2为受氢体。为受氢体。常用的供氢体常用的供氢体(底物）：底物）：n 邻苯二胺（邻苯二胺（O-phenylenediamine,OPDOPD）:反应显橙黄 色，应避光，致癌性n 四甲基联苯胺四甲基联苯胺（3,3,5,5-
7、tetramethylbenzidine,TMB）:反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性，但水溶性差n ABTS ABTS(2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)HRP.HRPHRP催化催化OPDOPD的反应：的反应：492nm492nm波长处有最高吸收峰波长处有最高吸收峰HRPHRP催化催化TMB:TMB:无色无色 蓝色蓝色 黄色黄色 在在450nm450nm波长处有最高吸收峰波长处有最高吸收峰终止液.、碱性磷酸酶（、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,APAP）底物底物：（1 1）对对硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯(p-nitr
8、ophenyl phosphate,p-NPP)(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)AP AP催化催化p-NPPp-NPP的反应：的反应：405nm405nm波长处有最高吸收峰波长处有最高吸收峰 （2）发荧光底物：磷酸发荧光底物：磷酸4-甲基伞酮甲基伞酮 可用于可用于ELISA作荧光测定作荧光测定*APAP灵敏性高与灵敏性高与HRPHRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率 低于低于HRPHRP，且价高，故应用不如，且价高，故应用不如HRPHRP普及。普及。.、-半乳糖苷酶：半乳糖苷酶：常用底物：常用底物：4-甲伞酮基甲伞酮基-
9、D半乳糖苷半乳糖苷 产物产物:4-甲基伞形酮（荧光物质）甲基伞形酮（荧光物质）.（三）（三）酶酶结合物结合物(Enzyme Conjugate)一）定义：一）定义：酶标记的抗体（或抗原）酶标记的抗体（或抗原）EIA中最关键的试剂中最关键的试剂二）结合物二）结合物要求：要求：1、保有酶的催化活性、保有酶的催化活性 2、保持抗体（或抗原）的免疫活性、保持抗体（或抗原）的免疫活性 3、有良好的稳定性、有良好的稳定性.三）制备方法三）制备方法:1、戊二醛交联法、戊二醛交联法:常用于常用于HRP或或AP标记抗体或抗原标记抗体或抗原 原理：原理：NH2 FeE CH2OH +OHC-(CH2)3-CHO
10、+H2N-Ig酶酶 戊二醛戊二醛 免疫球蛋白免疫球蛋白 -Fe-E-N=C-(CH2)3-C=N-Ig +2H2O CH2OH H H 酶结合物酶结合物 水水.2 2、过碘酸盐氧化法：、过碘酸盐氧化法：H HIOIO先将先将HRPHRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再表面的糖分子氧化成醛基，然后再与与IgIg上的氨基相结合上的氨基相结合。本法。本法只用于只用于HRPHRP的交联的交联NaIO4 NH2 NH2(1)FeE CH2OH+O-Fe E CHO +H2O NH2 NH2(2)FeE CHO+H2N-Ig -FeE C=N-Ig +H2O H .结合物中混有的游离酶结合物中混有的游离酶:
11、一般不影响一般不影响ELISA中最后的酶活性测定中最后的酶活性测定游离的抗体游离的抗体:与酶标抗体竞争相应的固相抗原与酶标抗体竞争相应的固相抗原因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好后用于检测，效果更好.（四）固相载体（四）固相载体 1、材料要求、材料要求:（1）具有较强的吸附蛋白质性能）具有较强的吸附蛋白质性能 （2）抗原或抗体吸附其上后保留原来的免疫活性）抗原或抗体吸附其上后保留原来的免疫活性 （3）仅）仅作为吸附剂和容器，不参与化学反应作为吸附剂和容器，不参与化学反应 .2 2、固相载体的种类与选择、固相载体的种类
12、与选择（1 1）塑料制品 聚苯乙烯、聚氯乙烯聚苯乙烯、聚氯乙烯 材料经济，操作简便，易于自动化材料经济，操作简便，易于自动化 最常用最常用(微量反应板微量反应板*)（2 2）微颗粒微颗粒 结合容量大，反应迅速结合容量大，反应迅速 逐渐普遍用于自动化分析逐渐普遍用于自动化分析（3 3）膜载体膜载体 硝酸纤维素膜（硝酸纤维素膜（NCNC）、尼龙膜等微孔滤膜）、尼龙膜等微孔滤膜 广泛应用于定性或半定量的斑点广泛应用于定性或半定量的斑点ELISAELISA.ABCDEFGH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12.(五）抗原和抗体五）抗原和抗体 一）抗原一）抗原 1 1、要求：纯度高，抗
13、原性完整、要求：纯度高，抗原性完整 2 2、来源：天然抗原、来源：天然抗原 重组抗原重组抗原 合成多肽抗原合成多肽抗原 二）抗体二）抗体1 1、要求：特异性好、要求：特异性好、效价高、亲和力强效价高、亲和力强2 2、来源：多克隆抗体、来源：多克隆抗体 单克隆抗体单克隆抗体 .（六）免疫吸附剂（六）免疫吸附剂（immunosorbent）一）定义：一）定义：固相的抗原或抗体称为固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂免疫吸附剂；疏水基团间的作用疏水基团间的作用 二）包被（二）包被（coatingcoating）1 1、定义：将抗原或抗体固相化的过程、定义：将抗原或抗体固相化的过程2 2、包被方法（直接吸附
14、法）、包被方法（直接吸附法）：抗原抗原（抗体抗体）/碳酸缓冲液碳酸缓冲液（pH9.6 pH9.6）包被浓度包被浓度100ng/ml-20ug/ml ELISA ELISA板孔中板孔中 4 4过夜过夜 弃包被液，弃包被液，PBSPBS清洗清洗 保存备用。保存备用。.三）封闭三）封闭(blocking)1、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被、定义：包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被 的过程的过程 2、常用的封闭剂：、常用的封闭剂：15牛血清白蛋白牛血清白蛋白.二、酶免疫技术分类二、酶免疫技术分类Ag-E+Ab E-Ag Ab+Ag-E.E EE E.三、酶联免疫吸附试验三、酶联免疫吸
15、附试验 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).（一）基本原理（一）基本原理固相固相化化抗原或抗体抗原或抗体酶标抗原或抗体酶标抗原或抗体 受检标本受检标本 特异性反应特异性反应固相化的酶标抗原或抗体固相化的酶标抗原或抗体和待测抗体（抗原）复合物和待测抗体（抗原）复合物 酶对底物的酶对底物的显色反应显色反应定性、定量结果定性、定量结果 .（二）方法类型及反应原理（二）方法类型及反应原理 三种基本方法：三种基本方法：双抗体夹心法：双抗体夹心法：抗原抗原 间接法：抗体间接法：抗体 竞争法：竞争法：抗原、抗原、抗体抗体 .一）双抗体夹心法一）双抗体夹心法(d
16、ouble-antibody sandwich ELISA)1 1、原理、原理EE EE洗涤洗涤E E标本标本.特点：n检测抗原最常用的方法检测抗原最常用的方法n适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测n所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇 注注 意意:RF(:RF(抗变性抗变性IgGIgG抗体抗体)假阳性假阳性IgGIgG抗抗IgG.2 2、双位点一步法：、双位点一步法：（1 1）原理：原理：应用两个应用两个单克隆抗体单克隆抗体作双抗夹心法测定，两步作双抗夹心法测定，两步抗原抗体反应同时进行且不互相干扰抗原抗体反应同时进行且不互相干扰.（2）注
17、）注 意：意：n该法仅适用于具有该法仅适用于具有两两个或两个以上表位个或两个以上表位的的抗原的检测抗原的检测n 当当待测抗原待测抗原相当高时，相当高时，出现出现“钩状现象钩状现象”（hook effect)解决方法解决方法:稀释标本稀释标本.3、双抗原夹心法：、双抗原夹心法：EEE.二）间接法二）间接法(indirect ELISA)原理：原理：利用酶标记的利用酶标记的抗抗体抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体以检测已与固相结合的受检抗体标本标本.特点：特点：n间接法是检测抗体最常用的方法间接法是检测抗体最常用的方法n只要变换包被抗原就可利同一酶标抗抗体只要变换包被抗原就可利同一酶标抗抗体检测各
18、种与抗原结合的相应抗体检测各种与抗原结合的相应抗体.HBsAg 抗-HBs(IgG)HBeAg 抗-HBe(IgG)HBcAg 抗-HBc(IgG)抗抗-IgG抗抗-IgG*.三）竞争法三）竞争法(competitive ELISA)待测抗原或抗体量与产物量呈负相关待测抗原或抗体量与产物量呈负相关基本原理基本原理测定抗原测定抗原:测定抗体测定抗体.特点：n用于抗原和半抗原的定性、定量测定，也可对抗体进行测定n酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力n反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记A
19、g（Ab）的分子数量和n反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比.四四）捕获法）捕获法(capture ELISA)：主要用于 血清中某种抗体亚型成分的测定 检测IgM抗体最常用方法原理：原理：.（三（三)结果分析：结果分析：1、定性、定性 间接法与夹心法：正相关间接法与夹心法：正相关 竞争法：反相关竞争法：反相关 肉眼观察肉眼观察 比色仪：比色仪：阳性判定值阳性判定值,截止值，截止值，Cut-off value,COV 间接法与夹心法：间接法与夹心法：COV=阴性对照的阴性对照的OD值值2.1 标本标本ODCOV为阳性为阳性
20、 竞争法：竞争法：COV=(阴性对照平均阴性对照平均OD+阳性对照平均阳性对照平均OD)/2 标本标本ODCOV为阳性为阳性.2、定量测定：以已知含量的标准品制用标准曲线、定量测定：以已知含量的标准品制用标准曲线.（四）操作的标准化（四）操作的标准化酶联试验的基本操作过程：酶联试验的基本操作过程：试剂及标本的准备加样；加样；温育洗涤；温育洗涤；酶结合物反应，温育洗涤；酶结合物反应，温育洗涤；底物显色；底物显色；终止反应读取结果终止反应读取结果.操作的标准化操作的标准化试剂及标本的准备加样保温洗涤显色比色.一一)标本：标本：1.新鲜标本新鲜标本 2.避免溶血避免溶血 3.避免细菌污染避免细菌污染
21、 4.避免反复冻融避免反复冻融 5.勿用勿用NaN3防腐防腐.二二)加样加样 准确准确 微量加样器微量加样器 加在加在ELISA板孔的底部板孔的底部 三三)保温保温 保温过程称为温育保温过程称为温育(incubation)1、一般均采用水浴箱、一般均采用水浴箱 2、避免蒸发、避免蒸发 3、若用保温箱，、若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内板应放在湿盒内 4、反应板均不宜叠放、反应板均不宜叠放.四四)洗涤洗涤 目的：目的：n洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质n反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。
22、n分离游离的和结合的酶标记物分离游离的和结合的酶标记物 洗涤的方式洗涤的方式:自动洗涤仪自动洗涤仪 手工操作手工操作:浸泡式和流水冲洗式浸泡式和流水冲洗式 洗涤液洗涤液 PBST.五)比色比色方法：方法：酶标比色仪，用特定的波长测读吸光值。酶标比色仪，用特定的波长测读吸光值。结果的表示：光密度（结果的表示：光密度（optical density，OD）表示方法表示方法:将吸收波长写于将吸收波长写于OD字母的右下角字母的右下角 如如OPD的吸收波长为的吸收波长为492nm，表示方法为，表示方法为OD 492nm.（五）方法学（五）方法学 优点：优点：特异性强、灵敏度高、准确性好、试剂稳定、特异性
23、强、灵敏度高、准确性好、试剂稳定、快速、快速、简单易行、简单易行、稳定及易于自动化操作稳定及易于自动化操作存在问题：存在问题：1、所用的抗原大部分还是混合的可溶性抗原、所用的抗原大部分还是混合的可溶性抗原2、内源性过氧化酶的普遍存在，常不易除去、内源性过氧化酶的普遍存在，常不易除去3、可能出现非特异性反应、可能出现非特异性反应4、假阳性、假阴性存在、假阳性、假阴性存在4、固相载体的质量常不统一，影响试验结果。、固相载体的质量常不统一，影响试验结果。5、试剂不统一，标准还不能统一、试剂不统一，标准还不能统一.四、均相酶免疫测定四、均相酶免疫测定（一）原理：（一）原理：Ag-E E-Ag Ab（E
24、活性改变）活性改变）+Ag-E Ag Ag Ab 抗原抗体反应后无需分离结合的和游离的酶标抗原抗体反应后无需分离结合的和游离的酶标记物而直接测定反应体系中酶活性记物而直接测定反应体系中酶活性（二）应用：主要用于（二）应用：主要用于小分子抗原小分子抗原或或半抗原半抗原的检测的检测+Ab.（三）类型（三）类型1.酶扩大免疫测定技术酶扩大免疫测定技术:2.2.（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）2.克隆酶供体免疫测定（cloned enzyme donor immunoassay,CEDIA）位阻EDEDEAEAEDAbAb活性酶标本中Ag.五
25、、膜载体免疫测定五、膜载体免疫测定（一）特点（一）特点n微孔薄膜为固相载体微孔薄膜为固相载体n产物为不溶性有色物产物为不溶性有色物n阳性结果为在膜上出现着色点阳性结果为在膜上出现着色点n只能定性只能定性,不能定量不能定量.（二）类型（二）类型斑点-ELISA免疫渗滤试验免疫层析试验免疫印迹法重组免疫结合试验.1、斑点、斑点ELISA(dot-elisa).2、免疫层析试验、免疫层析试验.3、免、免 疫疫 印印 迹迹 法法（immunoblotting test，IBT）亦称Western blotSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 电转移电转移 酶酶 免免 疫疫 定定 位位.应用：分
26、析抗原组分及其免疫活性 疾病的诊断.Western BlotHIV-1 Western BlotnLane1:Positive ControlnLane 2:Negative ControlnSample A:NegativenSample B:IndeterminatenSample C:Positive.4、重组免疫结合试验、重组免疫结合试验(RIBA).六、酶免疫测定的应用 几乎所有抗原抗体的检测几乎所有抗原抗体的检测 1 1病原体及其抗体病原体及其抗体 2 2蛋白质各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物、蛋白质各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物、各种血浆蛋白质、同工酶、激素各种血浆蛋白质、同工酶、激素 3 3非肽类激素：如非肽类激素：如T3T3、T4T4、雌激素、皮质醇等、雌激素、皮质醇等 4 4药物和毒品：如地高辛、苯巴比妥、吗啡等药物和毒品：如地高辛、苯巴比妥、吗啡等.n严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证良好的仪器是保证ELISA必要条件必要条件n严格遵照规定操作，必能得出准确的结果严格遵照规定操作，必能得出准确的结果.再再 见见.
