1、乙肝丙肝核酸检测的新平台临床乙肝丙肝核酸检测的新平台临床目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到的主要问题目前乙肝和丙肝临床治疗过程中遇到的主要问题 治疗终点无法准确判定 有些病人经一段时间治疗后DNA/RNA检测结果忽阴忽阳，但临床症状依然明显 不能及时预测耐药（病毒学突破）核苷（酸）类似物治疗后病毒DNA/RNA快速下降至检测限以下，不久却发现病毒出现反跳 疗效的准确监测？治疗后12或24周病毒DNA/RNA下降幅度直接决定预后问题的根源在哪里？问题的根源在哪里？内内 容容 HBV核酸检测的现状与需要核酸检测的现状与需要 HCV核酸检测的现状与需要 罗氏的CAP/CTM能带来什么益处 总结HBV
2、DNAHBV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用监测在抗病毒治疗中的临床应用 HBV DNA是监测抗病毒治疗监测抗病毒治疗响应和时间的关键标志物 HBV 治疗的路线图理念，为HBV DNA监测用于临床实践提供了指导 对用药耐药性的监测用药耐药性的监测（拉米夫定YMDD，）肝移植HBV复发风险的降低（术前，术后）HBV DNA监测的临床应用监测的临床应用HBV治疗路线图治疗路线图 Keeffe E.Clin Gastro Hepatology 2007;5:890-897.侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治疗方案优化，中国肝脏病杂志侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治疗方案优化，中国肝脏病杂志国产试剂现状
3、国产试剂现状 目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：HBV试剂盒说明：5005107 IU/mL 较可信的测试范围：1045107 IU/mL 对部分发生HBV病毒突变的病人无法准确检测注：注：1 IU/mL=1 copy/mL1 IU/mL=1 copy/mL内内 容容 HBV核酸检测的现状与需要 HCV核酸检测的现状与需要核酸检测的现状与需要 罗氏的CAP/CTM能带来什么益处 总结HCV DNAHCV DNA监测在抗病毒治疗中的临床应用监测在抗病毒治疗中的临床应用 HCV病毒感染是可治愈的疾病 HCV RNA检测可以有效指导临床用药 治疗的终点治疗的终点是核酸检测为阴性（核酸检
4、测可以直接指导停药时机）Schering-Plough Corp.CAP/CTM HCV样本管/反应管管盖抓手Peginterferon alfa-2aHEPSERA(Adefovir dipivoxil)package insert Gilead Sciences.COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 96系统（带连接系统）HCV RNA检测可以有效指导临床用药侯金林等，慢性乙型肝炎抗病毒治疗方案优化，中国肝脏病杂志,Journal of Medical Virology 2005,77:486490治疗结束后24周，未检测到HCV RNA可针对疑难病例、低病毒载量、长期
5、用药或高端病人治疗期间曾有HCV RNA低于检出限，但尚未停药即出现HCV RNA重新升高真正实现“样品进，结果出”Christoph Sarrazina et al.检测通量可达4*24测试北京友谊医院（贾继东）TYZEKA(Telbivudine)Package Insert.0 in serum and plasma matrices.慢性慢性HCVHCV治疗方案治疗方案治疗应答名称治疗应答名称描述描述快速病毒学应答（快速病毒学应答（RVR）4周时未检测到HCV RNA早期病毒学应答（早期病毒学应答（EVR）-完全早期病毒学应答完全早期病毒学应答（cEVR）未RVR，但12周时未检测到H
6、CV RNA-部分早期病毒学应答部分早期病毒学应答（pEVR）未RVR，12周时HCV RNA拷贝数下降2log10，但仍检测到HCV RNA没有应答没有应答12周时HCV RNA拷贝数下降2log10治疗结束（治疗结束（EOT）治疗结束未检测未检测到HCV RNA持续病毒学应答（持续病毒学应答（SVR）治疗结束后24周，未检测到HCV RNA反弹反弹治疗期间曾有HCV RNA低于检出限，但尚未停药即出现HCV RNA重新升高复发复发治疗期间HCV RNA低于检出限，但治疗结束（停药）后HCV RNA重新升高慢性慢性HCVHCV治疗方案治疗方案用药用药12周早期病毒学反应周早期病毒学反应HCV
7、 RNA下降下降2log继续治疗至继续治疗至48周周继续治疗至继续治疗至24周周考虑停药考虑停药国产试剂现状国产试剂现状 目前使用的国产试剂能解决的问题，不能解决的问题：HCV试剂盒说明：5005107 IU/mL 较可信的测试范围：1045107 IU/mL注：1 IU/mL=1 copy/mL内内 容容 HBV核酸检测的现状与需要 HCV核酸检测的现状与需要 罗氏的罗氏的CAP/CTM能带来什么益处能带来什么益处 总结全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统真正实现真正实现“样品进，结果出样品进，结果出”全球安装超过全球安装超
8、过 2,000台，国内安装超过台，国内安装超过 40台台COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 系统系统COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan48系统COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 96系统（带连接系统）COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 96系统（无连接系统）COBAS AmpliPrepCOBAS AmpliPrep仪器简介仪器简介全自动系统，自动进行核酸提取纯化和PCR反应体系配制 基于MGPMGP磁珠磁珠分离技术，确保高质量的核酸提取纯化最多72
9、个样品可以同时上机，运行中可连续装载上架，提高工作效率 包括耗材、样品、试剂均可以连续上样DNA或者RNA1.裂解、稳定和去蛋白裂解、稳定和去蛋白2.核酸捕获核酸捕获病毒或细胞3.冲洗冲洗4.洗脱洗脱37C孵育孵育COBAS AmpliPrepCOBAS AmpliPrep仪器仪器MGP MGP 磁珠分离技术磁珠分离技术室温室温80C孵育孵育取SPU枪头样本管/反应管管盖抓手样本初始体积感应器取试剂钢针CAPCAP机械臂介绍机械臂介绍样本管/反应管结构COBASCOBAS TaqMan/COBAS TaqMan 48TaqMan/COBAS TaqMan 48分析仪简介分析仪简介检测通量可达4
10、*24测试独立的24孔热循环仪 TaqMan 48有2个模块，TaqMan 96有4个模块 最多可同时进行4个不同的分析检测 操作简单，核酸扩增和检测全部自动完成实时定量PCR检测技术，卓越的检测性能，灵敏度高和特异性好，动态范围宽HBV-DNAHBV-DNA定量测试定量测试用于药品用于药品FDAFDA注册试验注册试验通用名商品名 FDA批准日期关键的HBV-DNA测试Interferon alfa-2b-2b 干扰素 INTRON A1991N/ALamivudine拉米夫定EPIVIR-HBV1998杂交研究解决方案 1Adefovir dipivoxil阿德福韦酯 HEPSERA2002
11、Amplicor Monitor 2Entecavir恩替卡韦BARACLUDE2005Cobas Amplicor 3Peginterferon alfa-2a聚乙二醇干扰素-2aPEGASYS2005Cobas Amplicor 4Telbivudine替比夫定TYZEKA2006Cobas Amplicor 5Tenofovir替诺福韦VIREAD(HIV)Phase 3Cobas TaqMan 6 (Lamivudine)package insert GlaxoSmithKline,Research Triangle park,NC 3.(Adefovir dipivoxil)pack
12、age insert Gilead Sciences.Foster City,CA Pegasys(Peginterferon alfa-2a)package insert.Hoffmann-La Roche Inc.Nutley,NJ 5.Abstract 63,Dec 9-13 2007,Lahaina,HI国外发表的文献国外发表的文献Evaluation of initial virological response to adefovir and development of adefovir-resistant mutations in patients with chronic h
13、epatitis B.Gallego et al.,Journal of Viral Hepatitis,15,392398Evaluation of an automated,highly sensitive,real-time PCR-based assay(COBAS AmpliprepTM/COBAS TaqManTM)for quantification of HCV RNA.Christoph Sarrazina et al.,Journal of Clinical Virology,43,162168COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan Hepatitis B
14、 Virus(HBV)Test:a Novel Automated Real-Time PCR Assay for Quantification of HBV DNA in Plasma.Tiziano Allice et al.,Journal of Clinical Microbiology,Mar.2007,p.828834Evaluation of the COBAS AmpliPrep-total nucleic acid solation-COBAS TaqMan hepatitis B virus(HBV)quantitative test and comparison to t
15、he VERSANT HBV DNA 3.0 assay.Ronsin C et al.,Journal of Clinical Microbiology 2006 vol.44(no.4)Comparison of the COBAS TaqManTM HBV Test With the COBAS Amplicor MonitorTM Test for Measurement of Hepatitis B Virus DNA in Serum.Simon Siu-Man Sum et al.,Journal of Medical Virology 2005,77:486490Hepatit
16、is B virus(HBV)genotype determination by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test,v2.0 in serum and plasma matrices.Goedel S et al.,Journal of Clinical Virology Jul;45(3):232-6Comparison of Versant HBV DNA 3.0 and COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan assays for hepatitis B DNA quantitation:Possible clinica
17、l implications.GARBUGLIA A.R.et al.,Journal of virological methods 2007,vol.146,no1-2,pp.274-280 Performance of the Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan Real-Time PCR Assay for Hepatitis B Virus DNA Quantification.Stephane Chevaliez et al.,Journal of Clinical,May ,p.17161723HBVHBV的定量检测性能指标的定量检测性能指标国产国产HBVHB
18、V试剂试剂CAP/CTM HBVCAP/CTM HBV灵敏度灵敏度 (LOD)(LOD)500 IU/mL？12 IU/mL12 IU/mL检测范围检测范围1045107 IU/mL54-1.154-1.110108 8 IU/mL IU/mL定量方法定量方法外标法定量内标法定量内标法定量其它其它对部分发生HBV病毒突变的病人无法准确检测涵盖亚型:A-G加强加强pre-corepre-core突变检测突变检测注：注：国产试剂国产试剂1 IU/mL=1 copy/mLHCVHCV的定量检测性能指标的定量检测性能指标国产国产HCVHCV试剂试剂CAP/CTM HCVCAP/CTM HCV灵敏度灵敏
19、度 (LOD)(LOD)500 IU/mL？15 IU/mL15 IU/mL检测范围检测范围1045107 IU/mL43 6.943 6.910107 7 IU/mL IU/mL定量方法定量方法外标法定量内标法定量内标法定量其它其它未知1-6 型(能区分 0.5 log浓度变化)定量原理定量原理外标法定量（国产试剂）外标法定量（国产试剂）使用一组（4管）外部标准品定量，分别为5 510104 4到5107 IU/mL未考虑各患者血液成分间的差异性各患者血液成分间的差异性对结果的影响定量原理定量原理内标定量内标定量Internal Quantitation StandardInternal Q
20、uantitation Standard(CAP/CTM)(CAP/CTM)内标是已知拷贝数的人工构建核酸，加入每一反应管，与靶核酸竞争扩增，管内定量可提示反应是否存在反应抑制，避免假阴性结果避免假阴性结果充分考虑管间反应效率的差异充分考虑管间反应效率的差异，得到可靠精确的结果 Nutley,NJ 5.全自动系统，自动进行核酸提取纯化和PCR反应体系配制INTRON A(Interferon alfa-2b)package insert.治疗结束后24周，未检测到HCV RNAHEPSERA(Adefovir dipivoxil)package insert Gilead Sciences.P
21、egasys(Peginterferon alfa-2a)package insert.12周时HCV RNA拷贝数下降2log10,Journal of Clinical,May ,p.肝移植HBV复发风险的降低（术前，术后）HCV核酸检测的现状与需要全世界第一台用于体外诊断的全自动荧光定量分子诊断系统北京大学人民医院肝炎所（魏来）EPIVIR-HBV检测通量可达4*24测试HEPSERA(Adefovir dipivoxil)package insert Gilead Sciences.COBAS AmpliPrep/COBAS TaqManCOBAS AmpliPrep/COBAS Ta
22、qMan系统系统封闭样品管输入，封闭封闭样品管输入，封闭PCRPCR管输出管输出 标准化，标准化，重复性重复性纯化好纯化好的核酸的核酸主反应液主反应液PCRPCR反应体系的配制反应体系的配制试剂、样品和耗材的装载上机试剂、样品和耗材的装载上机样品处理单元K-枪头K-管样品试剂BranchburgBranchburg生产厂房生产厂房罗氏罗氏 超过亿美金，建成全球最大分子诊断试剂超过亿美金，建成全球最大分子诊断试剂生产基地生产基地目前每月生产目前每月生产1414万套试剂万套试剂罗氏分子诊断严格的生产和质控体系罗氏分子诊断严格的生产和质控体系为整个行业设定了高标准为整个行业设定了高标准1.原料严格把
23、关3.GMP生产2.原料质检4.GMP生产6.成品质检5.试剂盒成品7.资料入档COBAS AmpliPrep/COBAS TaqManCOBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan全自动荧光定量分子诊断系统的应用全自动荧光定量分子诊断系统的应用 抗病毒治疗评估和监测（抗病毒治疗评估和监测（HBV/HCVHBV/HCV），为临床医生和病人提高更准确的结果，指导用药。可针对疑难病例、低病毒载量、长期用药或高端病人 肝移植肝移植的术前术后监控 全国药物、诊断试剂临床评估临床评估实验基地 CAP室间质评时有与国际接轨与国际接轨的平台，评价更科学 基础研究基础研究的工具，文章可信度大大增加国
24、内部分用户国内部分用户省份省份用户用户主要检测项目主要检测项目仪器类型仪器类型北京北京大学人民医院肝炎所（魏来）HBV/HCVCAP/CTM 48北京北京大学基础医学院（庄辉）HBV/HCVCAP/CTM 48北京北京友谊医院（贾继东）HBV/HCVCAP/CTM 48浙江浙江大学附属第一医院（李兰娟）HBV/HCVCAP/CTM 48广东南方医院（侯金林）HBV/HCVCAP/CTM 96北京北京大学第一医院HBV/HCVCAP/CTM 48北京北京协和医院HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48上海上海瑞金医院（张欣欣）HBV/HCVCAP/CTM 48四川华西医科大学附属华西医院（唐红）HBV/HCVCAP/CTM 96湖北武汉同济医院HBV/HCVCAP/CTM 48广东广州第八人民医院HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48上海上海公共卫生中心HBV/HCV/HIVCAP/CTM 48重庆西南医院(毛青)(装机中)HBV/HCVCAP/CTM 48重庆重医大附二院(任红，张大志)(装机中)HBV/HCVCAP/CTM 48国内用户现已超过40家谢谢观看！
