1、 刘军刘军 博士博士加拿大多伦多大学医学遗传和微生物系加拿大多伦多大学医学遗传和微生物系 终身教授终身教授多伦多大学肺结核和艾滋病研究中心多伦多大学肺结核和艾滋病研究中心 主任主任加拿大加拿大McLaughlin 分子医学中心分子医学中心 科学家科学家加拿大国立卫生研究院加拿大国立卫生研究院 研究员研究员中国国家自然科学基金国家杰出青年中国国家自然科学基金国家杰出青年(海外海外)成都永安制药有限公司成都永安制药有限公司 研发总监研发总监结核诊断新技术的理结核诊断新技术的理论探讨论探讨结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛1世界结核病疫情 目前全球目前全球1/3的人口（约的人口（约20亿）已经感
2、染了结亿）已经感染了结核菌，每一秒钟就会产生一位新的感染者，如核菌，每一秒钟就会产生一位新的感染者，如不控制，近不控制，近10年将有年将有3亿人受感染亿人受感染.全球有全球有20002000万人患结核病，每年新发病人数达万人患结核病，每年新发病人数达800-1000800-1000万人，全球每年约万人，全球每年约300300万人死于结核万人死于结核病。与病。与艾滋病、疟疾并列为影响全球健康的三艾滋病、疟疾并列为影响全球健康的三大传染病杀手大传染病杀手.与艾滋病形成致命的交叉感染与艾滋病形成致命的交叉感染 30%30%的的HIV携携带者死于结核带者死于结核.耐药结核在全球的出现和持续增加耐药结核
3、在全球的出现和持续增加(20%),(20%),严重威胁目前结核的有效治疗严重威胁目前结核的有效治疗结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛2我国结核病疫情中国结核病患者数量居世界第二位，每中国结核病患者数量居世界第二位，每年因结核病死亡的人数大大超过其他传年因结核病死亡的人数大大超过其他传染病死亡人数的总和，且中国人群结核染病死亡人数的总和，且中国人群结核分枝杆菌感染人数达到分枝杆菌感染人数达到5.55.5亿。亿。（卫生部副部长王陇德2006年新闻会客厅语）结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛3我国结核病疫情我国我国2003年对结核病的治愈率平均已达年对结核病的治愈率平均已达到到87%以上，但
4、对结核病的发现率约为以上，但对结核病的发现率约为29%。发现率极低已成为我国有效控制结核病发现率极低已成为我国有效控制结核病大规模传染的最大障碍和隐患！大规模传染的最大障碍和隐患！世界卫生组织已向我国明确提出，要求世界卫生组织已向我国明确提出，要求尽快将结核发现率提高到尽快将结核发现率提高到70%以上。以上。结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛4结核病传统的常规诊断方法诊断方法诊断方法原理原理不足之处不足之处结核菌素试 验结核菌蛋白混合物（几十种）皮下注射 敏感性和特异性均较差，对成年患者尤其明显；存在大量假阳性。胸部X线检 查 用X光检测结核病灶 不能检测近期感染或转移到其他器官的播散型结
5、核。可靠性差，漏检率高达40%左右。痰涂片检 查 用显微镜检测病人痰样中的细菌 只有当标本中含104105条/ml时方能检出，且阳性率不过40%左右，存在50%的假阴性。痰培养 用培养液从病人痰样中长出结核菌培养周期长达48周，目前最快也需要7-9天，而阴性结果需42天；处理过程可能导致细菌死亡，产生假阴性结果；不能检测菌阴病人.结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛5结核病诊断方法现状菌阳肺结核病诊断:痰涂片,痰培养方法:敏感性(检出率)低,时间长,肺外结核、排细菌较少的结核病人诊断困难，几乎很难检测到菌阴肺结核病诊断:皮下结核素,X-光方法,病理综合诊断:敏感性(检出率)低,特异性差,假阳
6、性高同时使用以上四种诊断方法对疑似病人进行筛选，在中国的发现率低于30%.全球目前对于菌阴结核的诊断没有有效和统一的方法和标准.而菌结核可占结核病人的60-70%.结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛6结核病诊断方法发展趋势目前国际学术界正竭力寻找：目前国际学术界正竭力寻找：特异性高的结核分枝杆菌抗原特异性高的结核分枝杆菌抗原结核分枝杆菌特异性靶位结核分枝杆菌特异性靶位DNADNA序列序列 以便作为免疫诊断或分子生物以便作为免疫诊断或分子生物学诊断的基础，为准确诊断结核病学诊断的基础，为准确诊断结核病提供依据。提供依据。结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛7名称生产公司靶位基因/检测方法敏
7、感性痰涂片阳性肺结核(%)敏感性痰涂片阴性肺结核(%)敏感性肺外结核(%)特异性(%0缺点Amplicor Roche16S DNA/PCR+DNA杂交90-10050-7127.3-8293.7-100操作复杂(DNA 杂交)，技术要求高,价格昂贵,假阳性有报道,痰涂片阴性检出率底AMTD2 GenProbe16S RNA/转录复制+RNA杂交91.7-10065.5-92.963.6-10092.1-100操作复杂(RNA 杂交)，技术要求高,价格昂贵,假阳性有报道,与环境分枝杆菌有交叉反应LCx MTB ABBOTT 抗原85b 基因/LCR 复制81.8-10035.3-79.237.
8、5-7195.8-100敏感性较底,主要用于快速区分结核杆菌和其它分枝杆菌 DTB BD 16S DNA和 IS6110/SDA复制98.5-10033.3-85.740.3-6996-99.1样本处理技术要求很高,操作复杂,价格昂贵假阴性，有些结核杆菌不带有IS6110结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛8国际市场上国际市场上PCR试剂盒的主要缺陷试剂盒的主要缺陷操作复杂操作复杂:由于所选用的靶位基因特异性差由于所选用的靶位基因特异性差,需要多步骤的操作需要多步骤的操作检测的基因对象特异性差检测的基因对象特异性差:许多不同的靶位序列包括许多不同的靶位序列包括DNADNA和和RNARNA片断
9、被推荐片断被推荐使用使用,但最普遍的是但最普遍的是1616S S 核糖体核糖体(ribosomal)ribosomal)DNA(rDNA),16S DNA(rDNA),16S 核糖体核糖体RNA(rRNA)RNA(rRNA)和和IS6110IS6110重复片断重复片断.这些基因片断的特异性差这些基因片断的特异性差.结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛9价格昂贵价格昂贵虽然虽然Gen-ProbeGen-Probe公司的公司的AMTDAMTD和和RocheRoche公司的公司的AMPLICORAMPLICOR早在早在19961996年已被年已被美国美国FDAFDA批准上市，但是这些试剂盒在包扩美
10、国在内的发达国家医批准上市，但是这些试剂盒在包扩美国在内的发达国家医疗机构中的推广应用却很有限，其最主要原因是它们的价格昂贵。疗机构中的推广应用却很有限，其最主要原因是它们的价格昂贵。DowdyDowdy等人在美国医院所作的研究表明，等人在美国医院所作的研究表明，Gen-ProbeGen-Probe公司公司AMTDAMTD试剂盒试剂盒用作痰涂片阳性病人诊断的最低费用为用作痰涂片阳性病人诊断的最低费用为338338美元美元/每人每人，而用作早，而用作早期排除病例期排除病例(根据根据AMTDAMTD阴性结果判断阴性结果判断)的费用为的费用为494494美元美元/每人每人。DowdyDowdy等人更
11、进一步比较了治疗结核病人的费用等人更进一步比较了治疗结核病人的费用(201(201美元美元/每人每人)并并得出结论：得出结论：AMTDAMTD试剂盒不是经济实效试剂盒不是经济实效(cost effective)cost effective)的手段。可的手段。可想而知想而知,这些诊断试剂在结核病高发的发展中国家的推广应用更为这些诊断试剂在结核病高发的发展中国家的推广应用更为有限。有限。结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛10名称名称检测方法检测方法所用抗原所用抗原缺点缺点MycoDotDot-blotLAM 对活动性肺结对活动性肺结核检测敏感性不是很理核检测敏感性不是很理想。想。38 kD蛋白
12、同源蛋白同源蛋白在其他分枝杆菌中蛋白在其他分枝杆菌中也存在，不具有特异性。也存在，不具有特异性。LAM是分枝杆是分枝杆菌细胞壁上共有的磷脂菌细胞壁上共有的磷脂糖糖,同样不具有特异性同样不具有特异性。Pathozyme MycoELISA38 kD and LAMPathozyme TBELISA38 kDITC diagnosticsMembrane based38 kD结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛11现有血清诊断方法的缺陷 其他选用抗原：其他选用抗原：14 14 kDa,kDa,MPT63,19 kD,MPT64,MPT63,19 kD,MPT64,MPT51,MTC28,A85B
13、,KatG,Esat-6MPT51,MTC28,A85B,KatG,Esat-6等等灵敏度不够高：灵敏度不够高：12-58%12-58%，尤其是菌阴病人尤其是菌阴病人容易产生假阳性：容易产生假阳性：所选用的抗原在非结核分枝杆菌所选用的抗原在非结核分枝杆菌,尤其是环尤其是环境中的分枝杆菌境中的分枝杆菌(environmental mycobacteria)environmental mycobacteria)中也存在中也存在,从而导致交叉反应从而导致交叉反应结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛12结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛13Mycobacterium Genus(分枝杆菌属类)包
14、括85个种(Mycobacterium species)人类致病菌:l肺结核分枝杆菌(M.tuberculosis),牛型分枝杆菌(M.bovis),通称为M.tb complexl麻风分枝杆菌(M.leprae)机会感染菌:免疫能力低下者感染lM.avium-intracelluare complex(MAC),M.marinum,M.fortuitum,M.ulcerans,M.terrae,M.kansasii,M.genavense,M.chelonae,M.xenopi,M.abscessus环境中的分枝杆菌:占大多数,不引起疾病lM.smegmatis,M.vaccae,M.aur
15、um结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛14结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛15诊断检测对象(靶位)S.T.Cole,et al.Nature(1998)393:537-544 结核分枝杆菌H37Rv基因组:4,039个基因(ORF)结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛16分枝杆菌基因组测定M.tuberculosis CDC1551:4237 基因基因M.bovis:3970 3970 基因基因M.bovis-BCG Pasteur:40044004基因基因M.leprae:1655 基因基因M.avium:5170 5170 基因基因M.paratuberculosis:4398
16、 4398 基因基因M.marinum:5485 基因基因M.ulcerans:4210 基因基因M.gilvum:5296 基因基因M.vanbaalenii:6037 基因基因M.smegmatis:6770 6770 基因基因 Mycobacterium sp.KMS:5527 基因基因Mycobacterium sp.JLS:5796 基因基因致病菌致病菌环境中的环境中的分枝杆菌分枝杆菌(非致病菌非致病菌)结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛17结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛18结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛19结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛20结核诊断新技术
17、的理论探讨结核病国际论坛21结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛22结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛23Presence of IS6110 is variable in clinical strains 结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛24Moatter,T.et al.,1998,Detection of Mycobacteriumtuberculosis in paraffin embedded intestinal tissue specimensby polymerase chain reaction:characterization of IS6110 negativ
18、e Strains.J.Pak.Med.Assoc.48,174-178.IS6110 is absent in some clinical strains of M.tuberculosisVan soolingen et al.,1993,Comparison of various DNA repetitive elements as genetic markers for strain Differentiation and epidemiology of M.tuberculosis.J.Clin.Microbiol.31,1987-1995.结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛25
19、M.tuberculosis CDC1551:4237 基因基因M.bovis:3970 3970 基因基因M.bovis-BCG Pasteur:40044004基因基因M.leprae:1655 基因基因M.avium:5170 5170 基因基因M.paratuberculosis:4398 4398 基因基因M.marinum:5485 基因基因M.ulcerans:4210 基因基因M.gilvum:5296 基因基因M.vanbaalenii:6037 基因基因M.smegmatis:6770 6770 基因基因 Mycobacterium sp.KMS:5527 基因基因Myco
20、bacterium sp.JLS:5796 基因基因致病菌致病菌环境中的环境中的分枝杆菌分枝杆菌(非致病菌非致病菌)TB-SA抗原抗原存在存在TB-SA抗原抗原不存在不存在TB-SA 基因基因/蛋白具有技高的特异性蛋白具有技高的特异性结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛26血清诊断的理想抗原-TB-SATB-SA蛋白抗原蛋白抗原 TB-SA具有极高的特异性，只存在于结核分枝杆菌具有极高的特异性，只存在于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和与其紧密相和与其紧密相关的同类致病菌中。关的同类致病菌中。TB-SA基因的表达，只有在结核杆菌侵入人体巨噬基因的表达，只有
21、在结核杆菌侵入人体巨噬细胞（细胞（macrophages）内才发生。排除接种卡介）内才发生。排除接种卡介苗的人群对实验结果的影响，有效控制假阳性苗的人群对实验结果的影响，有效控制假阳性。TB-SA抗原蛋白是一种分泌性蛋白，容易被机体识抗原蛋白是一种分泌性蛋白，容易被机体识别并引起免疫应答从而产生特异性抗体，是结核分别并引起免疫应答从而产生特异性抗体，是结核分枝杆菌血清诊断的理想抗原。枝杆菌血清诊断的理想抗原。结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛27PCRPCR检测的理想对象检测的理想对象 -TB-TB-SASA基因基因TB-SA基因只存在于结核分枝杆菌和其它几种致病基因只存在于结核分枝杆菌和
22、其它几种致病的分枝杆菌中，具有极高的特异性，可以避免由非的分枝杆菌中，具有极高的特异性，可以避免由非致病的分枝杆菌和其它不相关细菌而引起的交叉反致病的分枝杆菌和其它不相关细菌而引起的交叉反应；应；TB-SA基因是结核杆菌染色体上的基因，不是移动基因是结核杆菌染色体上的基因，不是移动子，因此在所有的结核分枝杆菌菌株中都稳定存在。子，因此在所有的结核分枝杆菌菌株中都稳定存在。TB-SA同源基因的同源基因的DNA序列不完全一致，因此可序列不完全一致，因此可以通过设计引物而检测以通过设计引物而检测DNA序列有差别的片段将序列有差别的片段将结核杆菌从其它分枝杆菌中区分出来。结核杆菌从其它分枝杆菌中区分出
23、来。结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛28CYPCO试剂的研究基础在上述研究的基础上与成都永安制药有限公在上述研究的基础上与成都永安制药有限公司成功开发出司成功开发出结核分枝杆菌抗体（结核分枝杆菌抗体（IgGIgG）检测试剂盒（酶）检测试剂盒（酶联免疫法）联免疫法）结核分枝杆菌（结核分枝杆菌（TB-SATB-SA）核酸扩增（）核酸扩增（PCRPCR）荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛29CYPCO试剂的临床研究临床研究单位临床研究单位多中心多中心v北京结核病胸部肿瘤医院（组长单位）北京结核病胸部肿瘤医院（组长单位）v山东省胸科医院山东省胸科医院v成都市结核
24、病防治院成都市结核病防治院临床研究考核方法临床研究考核方法采用采用双盲法双盲法临床考核对象临床考核对象细菌学检查及临床诊断为细菌学检查及临床诊断为结核结核病患者（病患者（菌阳、菌阴、肺外结核菌阳、菌阴、肺外结核）；）；细菌学与临床诊断为细菌学与临床诊断为非结核病的呼吸系统疾病或肺癌患者非结核病的呼吸系统疾病或肺癌患者；无肺部疾患的无肺部疾患的健康志愿者健康志愿者。临床研究样本量远远大于国内外文献中所报道的临床试验临床研究样本量远远大于国内外文献中所报道的临床试验结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛30结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛31入选病例分布结核分枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（
25、酶联免疫法）临床应用考核入选病例入选病例12321232肺结核肺结核690690肺外结核肺外结核139139非结核非结核278278健康健康125125菌阳菌阳362362菌阴菌阴328328结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛32(包括健康人群和其他肺部疾病包括健康人群和其他肺部疾病:健康人群特异健康人群特异性性:86.4%;:86.4%;其他肺部疾病特异性其他肺部疾病特异性:80.2%):80.2%)结核分枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）临床应用考核菌阳菌阳肺结核肺结核菌阴菌阴肺结核肺结核肺外肺外结核结核结核病结核病敏感敏感性性2 272/36272/362=75.1%75.
26、1%2 226/32826/328=6=68.9%8.9%99/13999/139=71.2%71.2%n特异特异性性3 331/40331/4038080结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛3300.20.40.60.811.21.41.61.8PPDELISA reading20 mmTB-SA ELISA not influenced by PPD reactionP=0.98 between data of(20 mm)结核分枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）临床应用考核结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛34结核分枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）临床应用考核
27、 提高了菌阴结核病及肺外结核病的检出率提高了菌阴结核病及肺外结核病的检出率0.00%20.00%40.00%60.00%80.00%肺结核肺外结核829例结核病人三种方法阳性检测检出率比较ELISA培养涂片结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛35结 论 对菌阴肺结核和肺外结核诊断价值高。对菌阴肺结核和肺外结核诊断价值高。与传统的涂片法和培养法比较，该方法明显提高结核与传统的涂片法和培养法比较，该方法明显提高结核病的阳性检出率，具有统计学意义。病的阳性检出率，具有统计学意义。操作简便，快速，价格低廉，无需特殊仪器，适合基操作简便，快速，价格低廉，无需特殊仪器，适合基层医院，可作为临床结核病诊断
28、和鉴别诊断的辅助手层医院，可作为临床结核病诊断和鉴别诊断的辅助手段。段。TB-SA ELISATB-SA ELISA试剂盒对结核病人的诊断不受患者试剂盒对结核病人的诊断不受患者PPDPPD反反应的影响。这对在卡介苗广泛推广的高危地区的推广应的影响。这对在卡介苗广泛推广的高危地区的推广应用有积极意义。应用有积极意义。结核分枝杆菌抗体（IgG）检测试剂盒（酶联免疫法）临床应用考核结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛36入选病例分布入选病例入选病例12391239肺结核肺结核704704肺外结核肺外结核146146非结核非结核263263健康健康126126菌阳菌阳302302菌阴菌阴402402
29、结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛37菌阳菌阳肺结核肺结核菌阴菌阴肺结核肺结核肺外肺外结核结核结核病结核病敏感性敏感性292/302292/302=96.7%=96.7%273/402273/402=67.9%=67.9%76/14676/146=52.1%=52.1%特异性特异性382/389382/38998.298.2结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛38对涂片、培养漏检标本的高检出率 850例结核病人PCR、培养、涂片阳性检出率比较 0.00%10.00%20.00%30.00%40.00%50.00%60.00%70.00%80.00%90.00%肺结核肺外结核PCR培养涂片
30、结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛39高特异性有助于临床诊断和鉴别诊断 0102030405060708090100北京山东成都非结核性呼吸系统疾病健康人群结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛40赛普克赛普克CYPCOCYPCO结核分枝杆菌核酸扩增（结核分枝杆菌核酸扩增（PCRPCR）荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 高灵敏度：检测限度可达到10菌/ml，可以检出约2/3涂片、培养漏检标本，有助于菌阴肺结核及肺外结核诊断与鉴别诊断。高特异性：仅检出致病结核菌，对非致病结核杆菌和其他非结核杆菌的检测保持良好的阴性结果。防污染：完全闭管扩增和检测，有效地防止了PCR扩增产物的污染，避免假阳性结果
31、。临床适用范围广：可用于痰、胸水、腹水、脑脊液、心包积液、骨髓等标本中结核杆菌的检测。操作简单、耗时短、不受机型限制，可以在ABI和Roche等不同公司的实时PCR仪上通用。结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛41敏感性/阳性检出率肺TB+肺TB-肺外TB永安PCR93%93%69%69%55%55%永安ELISA74%74%65%65%66%66%联合检测PCR+ELISA98%98%90%90%78%78%结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛42新型生物诊断试剂盒产品 1、结核分枝杆菌抗体、结核分枝杆菌抗体IgG（抗体）检测试剂盒（酶联免疫法）抗体）检测试剂盒（酶联免疫法）新药证书新药证书生产批件生产批件成都永安制药有限公司成都永安制药有限公司结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛43新型生物诊断试剂盒产品2、结核分枝杆菌（、结核分枝杆菌（TB-SA）核酸扩增（核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒新药证书新药证书生产批件生产批件成都永安制药有限公司成都永安制药有限公司结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛44THANK YOUTHANK YOU！结核诊断新技术的理论探讨结核病国际论坛45
