1、细菌感染的实验诊疗细菌感染的实验诊疗感染的诊断感染的诊断有赖于有赖于l从标本中检出病原体或检出病原从标本中检出病原体或检出病原体的可溶性抗原体的可溶性抗原,或病原体的或病原体的DNAl病人血清中检出病原体的抗体病人血清中检出病原体的抗体 本章主要讨论检出病原体的问题本章主要讨论检出病原体的问题细菌感染的实验诊疗2实验诊断的目的与要求实验诊断的目的与要求细菌感染的实验诊疗3l进行病原学诊断进行病原学诊断l进行药敏试验进行药敏试验,指导合理用药指导合理用药l用作流行病学调查用作流行病学调查,追踪传染源追踪传染源l研究病原生物与感染的关系研究病原生物与感染的关系细菌感染的实验诊疗4l时间：时间：19
2、92年年9月月l发病：发病：26名名l死亡：死亡：10名名l地点：某婴儿室地点：某婴儿室l传染源：慢性携带者产妇传染源：慢性携带者产妇l传播方式：通过污染操作台接触传播方式：通过污染操作台接触细菌感染的实验诊疗5l时间：时间：1991年年11月月l地点：某婴儿室地点：某婴儿室l发病：发病：55名名 l 死亡：死亡：23名名l 56件物品（被褥，尿布，奶瓶）中件物品（被褥，尿布，奶瓶）中26件件检出鼠伤寒沙门菌检出鼠伤寒沙门菌细菌感染的实验诊疗6l有价值的有价值的l快速简便的快速简便的l特异性和敏感性高的特异性和敏感性高的细菌感染的实验诊疗7查病原体查病原体:直接涂片直接涂片 分离分离,对纯培养
3、物进行鉴定对纯培养物进行鉴定查可溶性抗原查可溶性抗原:用已知抗体用已知抗体查查DNA:分子生物学方法分子生物学方法查抗体查抗体:用已知抗原用已知抗原 IgM IgG:效价有效价有4倍以上增高倍以上增高细菌感染的实验诊疗8l双歧检索双歧检索:以某一试验分以某一试验分l表解表解:用多种试验整体分析用多种试验整体分析l数字编码数字编码:将多种试验分别编码将多种试验分别编码,数字化后查表数字化后查表细菌感染的实验诊疗9革兰氏阴性杆菌革兰氏阴性杆菌葡萄糖发酵葡萄糖发酵+-氧化酶氧化酶+-弧菌弧菌肠杆菌肠杆菌非发酵菌非发酵菌细菌感染的实验诊疗10A B C D E甲甲 乙乙 丙丙 丁丁+-+-+-+-+细
4、菌感染的实验诊疗11组别组别 试验试验 代码代码 结果结果 结果代码结果代码 总值总值 1 A 4 -0 1 B 2 -0 C 1 +1 2 D 4 +4 5 E 2 -0 F 1 +1 15 细菌感染的实验诊疗12l 各试验孔含不同试验的脱水底物各试验孔含不同试验的脱水底物l 加入纯化的被检菌加入纯化的被检菌l 孵育孵育4-24h观察结果观察结果l 人工读取根据编码资料判定菌种或人工读取根据编码资料判定菌种或 电脑读取电脑读取 细菌感染的实验诊疗13临床标本的采集与处理临床标本的采集与处理细菌感染的实验诊疗14l早期早期,用抗菌药物前用抗菌药物前l根据病原体存在的部位采集相应标根据病原体存在
5、的部位采集相应标本本l无菌技术无菌技术,避免正常菌群污染避免正常菌群污染,防止病防止病原体播散原体播散l采用合适的方法采用合适的方法细菌感染的实验诊疗15l尽快接种到合适的培养基上尽快接种到合适的培养基上l根据抵抗力选择保存和运输条件根据抵抗力选择保存和运输条件 厌氧菌厌氧菌 奈瑟菌奈瑟菌 病毒病毒细菌感染的实验诊疗16细菌的形态学检查细菌的形态学检查细菌感染的实验诊疗17l用悬滴法或压片用悬滴法或压片l细菌是活的细菌是活的,可观察运动可观察运动l加入特异抗体可抑制其运动加入特异抗体可抑制其运动l结合标本来源可作初步诊断结合标本来源可作初步诊断,如霍乱如霍乱,梅毒梅毒l用相差或暗视野显微镜效果
6、更好用相差或暗视野显微镜效果更好细菌感染的实验诊疗18压片压片悬滴法悬滴法细菌感染的实验诊疗19l革兰染色革兰染色(Gram stain):紫色革兰阳性紫色革兰阳性;红红色革兰阴性色革兰阴性.注意细菌的大小注意细菌的大小,形状形状,排列排列以及着色的均一性以及着色的均一性l抗酸染色抗酸染色(acid-fast stain):红色抗酸阳性红色抗酸阳性,蓝色抗酸阴性蓝色抗酸阴性l荧光染色荧光染色:更易观察更易观察细菌感染的实验诊疗20特殊染色可用于观察荚膜特殊染色可用于观察荚膜,鞭毛等鞭毛等细菌的特殊结构细菌的特殊结构细菌感染的实验诊疗21细菌的分离培养细菌的分离培养细菌感染的实验诊疗22 培养基
7、培养基:营养物质营养物质,pH7.4 气体气体:需氧菌需氧菌,厌氧菌厌氧菌,兼性厌氧兼性厌氧 菌菌,微需氧菌微需氧菌 温度温度:一般一般37C 时间时间:一般一般1824h细菌感染的实验诊疗231.对对培养基的基本要求培养基的基本要求l足够的营养物质足够的营养物质l合适的合适的pHl无菌无菌l澄清澄清细菌感染的实验诊疗24l按培养基成分分按培养基成分分:基础培养基基础培养基:满足一般细菌要求满足一般细菌要求 营养培养基营养培养基:满足苛求细菌要求满足苛求细菌要求 鉴别培养基鉴别培养基:加有被利用物和指示剂加有被利用物和指示剂 选择培养基选择培养基:加有抑制剂加有抑制剂,能抑制非目的菌能抑制非目
8、的菌生长生长 特殊培养基特殊培养基:满足特殊细菌要求满足特殊细菌要求细菌感染的实验诊疗25l按培养基物理性状分按培养基物理性状分:液体液体:增菌增菌 固体固体:加加2%琼脂琼脂,平板用于分离纯种平板用于分离纯种,斜面用于传代或保存细菌斜面用于传代或保存细菌 半固体半固体:加加0.5%琼脂琼脂,用于观察动力用于观察动力,保存菌种保存菌种细菌感染的实验诊疗26l分区划线法分区划线法:用于分离纯种用于分离纯种,多次烧灼减少菌多次烧灼减少菌数数,以获取单个菌落以获取单个菌落l连续划线连续划线:不要求单个菌落不要求单个菌落,用于保存或繁殖用于保存或繁殖细菌细菌l涂布涂布:使细菌长成菌苔使细菌长成菌苔,可
9、观察细菌被抑制情可观察细菌被抑制情况或用于繁殖细菌况或用于繁殖细菌l倾注平板倾注平板:少量细菌混于琼脂中倒板少量细菌混于琼脂中倒板,计数计数,分离纯种分离纯种细菌感染的实验诊疗27固体基固体基:菌落形成菌落形成,注意其注意其 大小大小,形状形状 表面表面,边缘边缘 质地质地,透明度透明度 溶血情况溶血情况液体基液体基:浑浊浑浊,菌膜菌膜,沉淀沉淀细菌感染的实验诊疗28l纯种是细菌学工作的基础纯种是细菌学工作的基础l获得方法获得方法:划线分离法划线分离法(倾注平倾注平板法板法)获得大的单个菌落获得大的单个菌落 斜面斜面 纯培养物纯培养物l纯培养物的外观表现应是一致的纯培养物的外观表现应是一致的细
10、菌感染的实验诊疗29细菌感染的实验诊疗30细菌感染的实验诊疗31l确定有无细菌确定有无细菌l鉴定细菌鉴定细菌l药敏试验药敏试验l计数细菌计数细菌l利用细菌利用细菌:制备菌苗制备菌苗,生产抗生素或基生产抗生素或基因工程产品因工程产品细菌感染的实验诊疗32l细菌代谢产物的检测细菌代谢产物的检测细菌感染的实验诊疗33l内毒素内毒素:致热作用致热作用:兔体温兔体温 鲎试验鲎试验l外毒素外毒素:体内体内:毒素与抗毒素的中和试验毒素与抗毒素的中和试验 体外体外:Elek平板法平板法:沉淀反应沉淀反应 ELISA细菌感染的实验诊疗34毒素和抗毒素的中和试验毒素和抗毒素的中和试验 外毒素外毒素?外毒素外毒素?
11、+已知抗体已知抗体 小白鼠小白鼠 小白鼠小白鼠结果结果 发病发病 发病发病 有毒性有毒性,但不是但不是相相 应的应的 发病发病 不发病不发病 是相应毒素是相应毒素 不发病不发病 不发病不发病 无毒性无毒性细菌感染的实验诊疗35抗毒素抗毒素待测细菌待测细菌沉淀线沉淀线Elek 试验试验细菌感染的实验诊疗36 欲检测细菌的生化反应欲检测细菌的生化反应,一一般是在合适的培养基中加入被测般是在合适的培养基中加入被测物和检测其代谢产物的试剂物和检测其代谢产物的试剂,即即在鉴别培养基中进行培养在鉴别培养基中进行培养,或直或直接加试剂于培养物中接加试剂于培养物中,观察呈色观察呈色等现象判定结果等现象判定结果
12、 细菌感染的实验诊疗37l糖糖(醇醇)发酵试验发酵试验:酸酸,气体气体l氧化氧化-发酵发酵(O/F)试验试验:l-半乳糖苷酶半乳糖苷酶(ONPG)试验试验l七叶苷水解试验七叶苷水解试验l甲基红试验甲基红试验lV-P试验试验细菌感染的实验诊疗38l明胶液化试验明胶液化试验lIndol试验试验lUra试验试验lH2S试验试验l苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶试验l氨基酸脱羧酶试验氨基酸脱羧酶试验细菌感染的实验诊疗39l枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验l丙二酸盐利用试验丙二酸盐利用试验细菌感染的实验诊疗40枸橼酸盐利用试验枸橼酸盐利用试验细菌感染的实验诊疗41l氧化酶试验氧化酶试验l过氧化氢酶试验过
13、氧化氢酶试验l硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验l卵磷脂酶试验卵磷脂酶试验l凝固酶试验凝固酶试验lCAMP试验试验l胆汁溶菌试验胆汁溶菌试验细菌感染的实验诊疗42lO/129试验试验l杆菌肽试验杆菌肽试验lOptochin试验试验细菌感染的实验诊疗43l了解微生物的抗原结构了解微生物的抗原结构l 用已知抗体检测细菌的抗原组合用已知抗体检测细菌的抗原组合l 特异性较高特异性较高l 多在鉴定的最后进行多在鉴定的最后进行l 可用多种血清学方法可用多种血清学方法,细菌多细菌多用凝集用凝集反应反应,病毒多用中和试验病毒多用中和试验细菌感染的实验诊疗45l查抗体查抗体:用已知抗原用已知抗原 IgM:感染的指标感
14、染的指标 IgG:效价有效价有4倍以上增高或倍以上增高或 高于当地人群水平高于当地人群水平l多用于病程较长的全身性感染多用于病程较长的全身性感染细菌感染的实验诊疗46感染的分子生物学检测感染的分子生物学检测检出病原体检出病原体DNA证明病原体存在证明病原体存在细菌感染的实验诊疗47l细菌分类细菌分类l临床诊断临床诊断,快速鉴定快速鉴定l耐药性检测耐药性检测l毒素检测毒素检测l流行病学调查流行病学调查细菌感染的实验诊疗48l G+C mol%l PCRl 限制性内切酶片段长度限制性内切酶片段长度l 核酸杂交核酸杂交细菌感染的实验诊疗49l限制性内切酶是能够在一定部位切限制性内切酶是能够在一定部位
15、切开开DNADNA的酶的酶l同样的内切酶可将相同的同样的内切酶可将相同的DNADNA切成同切成同样数目的，同样大小分子量的片段样数目的，同样大小分子量的片段l电泳后对所得图谱进行分析可判断电泳后对所得图谱进行分析可判断DNADNA是否相同是否相同细菌感染的实验诊疗50 1989年国外某医院泌尿科年国外某医院泌尿科3周内从病人血，尿中分出周内从病人血，尿中分出8株不株不动杆菌，具有相同的耐药性，经动杆菌，具有相同的耐药性，经 Smal I 酶切后出现相同片段，但酶切后出现相同片段，但与环境中或其他科室分出的不动与环境中或其他科室分出的不动杆菌不同，表明泌尿科的病人是杆菌不同，表明泌尿科的病人是由
16、同一克隆引起的爆发由同一克隆引起的爆发细菌感染的实验诊疗51 某医院某医院ICU病房，从水病房，从水池和病人标本中分出多株铜池和病人标本中分出多株铜绿假单胞菌，将其染色体绿假单胞菌，将其染色体DNA用用X Bal 酶切，发现彼此酶切，发现彼此之间没有共同的酶切片段图之间没有共同的酶切片段图谱，病人之间图谱的也不相谱，病人之间图谱的也不相同，说明这不是一次爆发同，说明这不是一次爆发细菌感染的实验诊疗52动物实验动物实验细菌感染的实验诊疗53l 分离细菌分离细菌,获取纯种获取纯种l 检测其致病性检测其致病性,观察发病或死亡观察发病或死亡,可同时可同时加抗体进行中和试验或保护试验加抗体进行中和试验或
17、保护试验l 制备抗体制备抗体l 诱导变异诱导变异l 建立感染模型建立感染模型l 检测生物制品的安全性检测生物制品的安全性 细菌感染的实验诊疗54l多用易感的小动物多用易感的小动物,如小白鼠如小白鼠,豚鼠豚鼠l按需要选择按需要选择 纯系纯系,突变系突变系,杂种杂种 无菌动物无菌动物(GF),悉生动物悉生动物(GB),无特无特殊病原体动物殊病原体动物(SPF),最低限度疾病动物最低限度疾病动物(MDA),普通动物普通动物l可选用多种途径注射可选用多种途径注射,如腹腔如腹腔,静脉静脉,皮下皮下,颅内等颅内等细菌感染的实验诊疗55l形态形态:个体个体,菌落菌落,液体基生长情况液体基生长情况l生长需要生
18、长需要:氧氧,温度温度,营养物营养物l生化反应生化反应:观察其酶活性观察其酶活性l抗原性抗原性:用已知抗体用已知抗体l致病性致病性:动物实验动物实验l核酸核酸:PCR,酶切片段长度酶切片段长度,杂交杂交细菌感染的实验诊疗56l界界_门门_纲纲_目目_科科_属属_种种l种是具有相同生物学特性的生物种是具有相同生物学特性的生物聚合群聚合群l型：生化型，血清型，噬菌体型型：生化型，血清型，噬菌体型l株：不同来源株：不同来源l双命名：金黄色葡萄球菌双命名：金黄色葡萄球菌 staphylococcus aureous staphylococcus sp(spp)细菌感染的实验诊疗57l分离培养出病原体分离培养出病原体l患者血清病原体抗体有四倍以上患者血清病原体抗体有四倍以上增高增高l能复制出动物模型能复制出动物模型细菌感染的实验诊疗58
