1、免疫学检测方法中的免疫学检测方法中的干扰因素和对策干扰因素和对策第二军医大学附属长海医院实验诊断科第二军医大学附属长海医院实验诊断科 沈 茜 随着基础免疫学研究的深入和现代免随着基础免疫学研究的深入和现代免疫学理论的建立，使大量免疫学检测技术疫学理论的建立，使大量免疫学检测技术被不断地创新、发明；在临床疾病诊治的被不断地创新、发明；在临床疾病诊治的应用中也不断地推陈出新。应用中也不断地推陈出新。目前应用免疫目前应用免疫学原理检测的检验项目占到三级综合医院学原理检测的检验项目占到三级综合医院检验科全部检验项目的检验科全部检验项目的14，医疗收入约，医疗收入约占占13。这就要求检验人员不断掌握最新
2、这就要求检验人员不断掌握最新的临床免疫学知识和各种新的检验方法，的临床免疫学知识和各种新的检验方法，了解检验项目的基本原理。了解检验项目的基本原理。生化生化临检临检 要保证实验结果的正确性和可靠性，必要保证实验结果的正确性和可靠性，必须对实验整个过程中各个环节中的干扰因素须对实验整个过程中各个环节中的干扰因素有比较清楚的掌握和了解。在本次课中主要有比较清楚的掌握和了解。在本次课中主要讨论的是标本本身内在因素、以及由于人为讨论的是标本本身内在因素、以及由于人为因素对标本处理不当等引起的外在因素、对因素对标本处理不当等引起的外在因素、对免疫检测结果造成的影响。在了解这些因素免疫检测结果造成的影响。
3、在了解这些因素的同时，如何在临床工作中注意和解决这些的同时，如何在临床工作中注意和解决这些干扰，以保证结果的准确性。干扰，以保证结果的准确性。基本概念基本概念 抗原：抗原：是一类能刺激机体免疫系统产生特异是一类能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答、并能与相应免疫应答产物（抗体性免疫应答、并能与相应免疫应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）发生或致敏淋巴细胞）发生特异性结合特异性结合的物质。的物质。抗体：抗体：是由抗原刺激是由抗原刺激B细细胞经分化增殖形成的浆细胞胞经分化增殖形成的浆细胞合成和分泌的，能与相应抗合成和分泌的，能与相应抗原发生原发生特异性结合特异性结合并具有多并具有多方面免疫功能的球蛋白。
4、方面免疫功能的球蛋白。基本概念基本概念 免疫学检测就是利用免疫学检测就是利用抗原和抗体高度特异抗原和抗体高度特异性结合的原理性结合的原理而检测分析微量物质的方法。从而检测分析微量物质的方法。从20世纪世纪50年代美国学者年代美国学者Berson和和Yallow发明发明了放射免疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检了放射免疫测定技术检测胰岛素起，免疫学检测技术经历了从定性到定量；从常量分析到微测技术经历了从定性到定量；从常量分析到微量、超微量分析；从手工检测到全自动化；从量、超微量分析；从手工检测到全自动化；从单个标本检测到高通量检测等一系列长足的进单个标本检测到高通量检测等一系列长足的进步。步。免疫
5、测定技术均是以标记物示踪作为基免疫测定技术均是以标记物示踪作为基础，同位素、荧光素、酶是经典的三大标记础，同位素、荧光素、酶是经典的三大标记免疫测定技术。这三大标记技术发展了各种免疫测定技术。这三大标记技术发展了各种各样的免疫测定方法，如各样的免疫测定方法，如RIA、ELISA、荧光、荧光免疫测定、免疫化学发光测定等，目前应用免疫测定、免疫化学发光测定等，目前应用这三大标记技术的检测试剂盒在临床广为应这三大标记技术的检测试剂盒在临床广为应用。近年来，作为免疫测定发展方向的非同用。近年来，作为免疫测定发展方向的非同位素标记技术以其敏感、安全等倍受关注。位素标记技术以其敏感、安全等倍受关注。免疫检
6、测技术免疫检测技术-标记物标记物标本自身及前处理所造成的干扰因素标本自身及前处理所造成的干扰因素 类风湿因子（类风湿因子（RF）嗜异性抗体嗜异性抗体 自身抗体自身抗体 补体补体 纤维蛋白纤维蛋白 溶血或黄疸溶血或黄疸 交叉反应物质交叉反应物质 外源性物质外源性物质免疫学检测免疫学检测-干扰因素干扰因素干扰因素和对策干扰因素和对策-类风湿因子类风湿因子 患者体内存在的类风湿因子能显著干扰患者体内存在的类风湿因子能显著干扰许多免疫学检测方法，许多免疫学检测方法，IgM、IgG型型RF可以可以与免疫检测系统中的捕获抗体及标记二抗的与免疫检测系统中的捕获抗体及标记二抗的Fc段直接结合，从而导致检测结果
7、假阳性或段直接结合，从而导致检测结果假阳性或假性升高。假性升高。RF对不同检测系统的干扰程度有对不同检测系统的干扰程度有所差异，影响程度并不与所差异，影响程度并不与RF的浓度成正比的浓度成正比。目前，在临床工作中使用的免疫检测试剂盒目前，在临床工作中使用的免疫检测试剂盒大部分均没有很好地防止大部分均没有很好地防止RF干扰的措施，国干扰的措施，国外著名公司要好于国内公司。外著名公司要好于国内公司。干扰因素和对策干扰因素和对策-类风湿因子类风湿因子 收集收集10份份RF311000IU/L的患者血的患者血清，在美国和欧洲清，在美国和欧洲66各临床实验室进行各临床实验室进行74个个项目的免疫竞争法或
8、免疫夹心法检测，仪器项目的免疫竞争法或免疫夹心法检测，仪器和试剂均配套。和试剂均配套。3445个结果中个结果中8.7为假阳性。为假阳性。错误高值结果中的错误高值结果中的21（所有结果的（所有结果的1.8）引起了临床的错误诊断，在使用引起了临床的错误诊断，在使用RF吸附剂后吸附剂后再检测，错误结果得到纠正。再检测，错误结果得到纠正。39的假阳性的假阳性结果也可在使用结果也可在使用RF吸附剂后降低。吸附剂后降低。Clinical Chemistry 2002;48(11):20082016RF的干扰对策的干扰对策u 捕获抗体用捕获抗体用F(ab)2替代完整的替代完整的IgGu 标本用连有热变性（标
9、本用连有热变性（63，10 min）IgG的的 固相吸附剂（固相吸附剂（Euroimmune公司）处理公司）处理（将（将 热变性热变性IgG加入到标本稀释液或血清中同样加入到标本稀释液或血清中同样 有效），有效），4过夜离心后在检测；过夜离心后在检测；u 检测抗原时，可以用终浓度检测抗原时，可以用终浓度0.1mol/L 2-巯巯 基乙醇基乙醇(2-ME)等加入到标本稀释液或标本等加入到标本稀释液或标本 中，使中，使RF（IgM型）降解。型）降解。干扰因素和对策干扰因素和对策-嗜异性抗体嗜异性抗体 嗜异性抗体通常是指与其他种类动物的嗜异性抗体通常是指与其他种类动物的免疫球蛋白产生反应的人类抗体，
10、具有广泛免疫球蛋白产生反应的人类抗体，具有广泛的种特异性。免疫检测系统中大量使用单克的种特异性。免疫检测系统中大量使用单克隆抗体，嗜异性抗体可与啮齿类动物隆抗体，嗜异性抗体可与啮齿类动物IgG的的Fc段结合。这样嗜异性抗体既可与检测系段结合。这样嗜异性抗体既可与检测系统中的捕获抗体结合、又可和标记抗体结合，统中的捕获抗体结合、又可和标记抗体结合，造成检测结果假阳性或假性升高。嗜异性抗造成检测结果假阳性或假性升高。嗜异性抗体干扰的程度、频率与患者的疾病状态、年体干扰的程度、频率与患者的疾病状态、年龄、性别等无关。龄、性别等无关。干扰因素和对策干扰因素和对策-嗜异性抗体嗜异性抗体 将将11261份
11、血清标本使用荧光时间分辨免份血清标本使用荧光时间分辨免疫分析系统（疫分析系统（PE公司，二步法、双位点）检公司，二步法、双位点）检测测CEA，将缓冲液中加入小牛，将缓冲液中加入小牛IgG 约约210个病个病人、人、3.34.7%的标本出现假性升高；加入的标本出现假性升高；加入15mg/L热处理小鼠热处理小鼠IgG（MAK33）（Roche）可将干扰降为）可将干扰降为0.86%；同浓度天；同浓度天然小鼠然小鼠IgG无效；去除捕获抗体或标记抗体的无效；去除捕获抗体或标记抗体的Fc段也可将干扰降至段也可将干扰降至0.1%。Clinical Chemistry 2002；48(4):613621 处理
12、方法处理方法病人数病人数 频率（）频率（）1切除捕获抗体切除捕获抗体Fc段和加入热处段和加入热处理理15mg/LMAK33后结果正常后结果正常 148 3.02仅切除捕获抗体仅切除捕获抗体Fc段后结果正段后结果正常常 41 0.823切除捕获抗体切除捕获抗体Fc段或加入段或加入15mg/L天然天然MAK33或或15mg/L热处理热处理MAK33后结果正常后结果正常 4 0.084仅加入仅加入15mg/L热处理热处理MAK33后后结果正常结果正常 3 0.06表表1.不同处理方法对嗜异性抗体干扰的排除不同处理方法对嗜异性抗体干扰的排除干扰因素和对策干扰因素和对策-嗜异性抗体嗜异性抗体 使用使用A
13、ccess免疫化学发光检测系统测免疫化学发光检测系统测定定TSH、PSA、HCG和皮质醇，前三项为和皮质醇，前三项为双位点非竞争法，后为竞争法。双位点非竞争法，后为竞争法。160份标本份标本测定测定HCG有有5份（份（3.1%)假性升高；假性升高；53份标份标本（本（37.9%)用嗜异性抗体吸附剂吸收后结果用嗜异性抗体吸附剂吸收后结果出现差异性下降；有出现差异性下降；有4份标本的结果出现份标本的结果出现4SD的显著增高，使临床对结果的解释出现的显著增高，使临床对结果的解释出现改变。改变。Clin Chem 2003；49(7):11631169嗜异性抗体嗜异性抗体的干扰的干扰对策对策u 在标本
14、稀释液或待检标本中加入过量的动在标本稀释液或待检标本中加入过量的动 物物Ig(s)，但加入量不足或亚型不同时无，但加入量不足或亚型不同时无 效（要与捕获抗体和标记抗体的效（要与捕获抗体和标记抗体的Ig亚型相亚型相 同）。同）。u 捕获抗体使用捕获抗体使用F(ab)2，切除，切除Fc段。段。干扰因素和对策干扰因素和对策-自身抗体自身抗体 嗜靶抗原的自身抗体，如抗甲状腺球蛋嗜靶抗原的自身抗体，如抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，能与白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，能与靶抗原结合形成复合物，在免疫检测系统中靶抗原结合形成复合物，在免疫检测系统中均可对靶抗原的测定结果造成负性干扰。均可对
15、靶抗原的测定结果造成负性干扰。判断嗜靶抗原的自身抗体对检测的负干判断嗜靶抗原的自身抗体对检测的负干扰，因紧密结合患者的疾病诊断、病史、其扰，因紧密结合患者的疾病诊断、病史、其他实验检查的结果综合分析。如甲亢、甲低、他实验检查的结果综合分析。如甲亢、甲低、I型糖尿病等。型糖尿病等。Erikssion等人采用针对等人采用针对cTnI中心稳定区中心稳定区域抗原位点的捕获和检测抗体，开发了新的域抗原位点的捕获和检测抗体，开发了新的cTnI检测方法，有利于具有检测方法，有利于具有cTnI自身抗体等自身抗体等干扰物质的标本。采用新方法和目前一商品化干扰物质的标本。采用新方法和目前一商品化试剂盒共检测试剂盒
16、共检测541份胸痛患者的血清，其中份胸痛患者的血清，其中13.5%的标本的标本cTnI两种方法检测均阳性，两种方法检测均阳性，14.2%的标本仅采用新方法检测阳性的标本仅采用新方法检测阳性。上述结果。上述结果说明心梗患者存在说明心梗患者存在cTnI自身抗体绝非特例自身抗体绝非特例。干扰因素和对策干扰因素和对策-自身抗体自身抗体 Clin Chem 2005;51(5):848-55嗜靶抗原自身抗体嗜靶抗原自身抗体的干扰的干扰对策对策 为避免以上情况出现，解决的办法是：为避免以上情况出现，解决的办法是：测定前标本需用理化方法将免疫复合物解离测定前标本需用理化方法将免疫复合物解离后再测定。解离液组
17、成：后再测定。解离液组成：0.3%Triton X100 1.5%CHAPS 15%SDS100l标本、标本、50 l解离液混匀，解离液混匀，56 30分分钟处理。钟处理。J Clin Microbiol 1999;37:18021808干扰因素和对策干扰因素和对策-补体补体 免疫检测系统中捕获抗体在向固相包被免疫检测系统中捕获抗体在向固相包被中和标记抗体的标记过程中，抗体分子发生中和标记抗体的标记过程中，抗体分子发生变构，其变构，其Fc段的补体段的补体C1q分子结合位点被暴分子结合位点被暴露出来，使露出来，使C1q 可以将二者连接起来，从而可以将二者连接起来，从而造成假阳性。一些公司为了增加
18、检测的敏感造成假阳性。一些公司为了增加检测的敏感性，使用链霉亲和素包被固相，将捕获抗体性，使用链霉亲和素包被固相，将捕获抗体用亲和素标记，此过程也可引起捕获抗体的用亲和素标记，此过程也可引起捕获抗体的构象发生改变构象发生改变，造成假阳性或假性升高。，造成假阳性或假性升高。补体的干扰补体的干扰对策对策u 用终浓度用终浓度1040mmol/L EDTA处理标本，处理标本，灭活补体。灭活补体。u 用用53、10 min或或56、30 min加热血加热血清使清使C1q灭活。灭活。干扰因素和对策干扰因素和对策-纤维蛋白纤维蛋白 在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液
19、采集后正常血液采集后1/2开始凝固，开始凝固，2h后完全凝固。后完全凝固。临床检验工作中，有时为了争取时间快速检临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时或未完全凝固测，常在血液还未开始凝固时或未完全凝固时即强行离心分离血清，此时血清中仍残留时即强行离心分离血清，此时血清中仍残留部分纤维蛋白原，在免疫检测过程中可以形部分纤维蛋白原，在免疫检测过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果，尤其是在使用果，尤其是在使用ELISA检测时。检测时。干扰因素和对策干扰因素和对策-纤维蛋白纤维蛋白 用用Abbott AxSYM分析了分析了
20、3962份血标本份血标本中中cTnI 水平，其中水平，其中307份份cTnI升高，将这升高，将这307份标本再离心前后测定份标本再离心前后测定cTnI的变化，的变化，24份标份标本在离心后本在离心后cTnI有有45%的降低，这种现象主的降低，这种现象主要出现在要出现在cTnI含量在含量在2.025g/L的标本。离的标本。离心后其中心后其中20份样本份样本cTnI值低于正常值低于正常cutoff值。值。Int J Cardiol 2005;101(1):27-31u为避免上述干扰作用，解决的办法最好是为避免上述干扰作用，解决的办法最好是 血液标本采集后必须使其充分凝固再分离血液标本采集后必须使其
21、充分凝固再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。或于采血管中加入适当的促凝剂。u怀疑检测结果存在纤维蛋白干扰的标本，怀疑检测结果存在纤维蛋白干扰的标本，最好将标本最好将标本410放置过夜，离心后再检放置过夜，离心后再检测。测。纤维蛋白的干扰纤维蛋白的干扰对策对策干扰因素和对策干扰因素和对策-溶血或黄疸溶血或黄疸 各种人为原因引起的标本溶血，导致红细各种人为原因引起的标本溶血，导致红细胞的破坏，血红蛋白以及细胞碎片和蛋白质等胞的破坏，血红蛋白以及细胞碎片和蛋白质等释放出来。溶血对免疫检测的作用不仅是游离释放出来。溶血对免疫检测的
22、作用不仅是游离血红蛋白的影响，更多的是细胞碎片和蛋白质血红蛋白的影响，更多的是细胞碎片和蛋白质等其他溶血产物；血红蛋白具有过氧化物酶活等其他溶血产物；血红蛋白具有过氧化物酶活性，在以辣根过氧化物酶为标记的性，在以辣根过氧化物酶为标记的 ELISA测定测定中，会导致非特异性显色中，会导致非特异性显色。溶血因测定方法的。溶血因测定方法的不同可导致对免疫学检测的正向或负向干扰，不同可导致对免疫学检测的正向或负向干扰，且影响大小也有所差异。且影响大小也有所差异。干扰因素和对策干扰因素和对策-溶血或黄疸溶血或黄疸 一项针对溶血对电化学发光法影响的研一项针对溶血对电化学发光法影响的研究发现，究发现，cTn
23、T测定浓度的负偏倚与血清中血测定浓度的负偏倚与血清中血红蛋白浓度相关，血红蛋白浓度每增红蛋白浓度相关，血红蛋白浓度每增1g/L，cTnT0.1g/L的可能性下降的可能性下降2.5%。Clinical Biochemistry 2004;37(8):398-701 标本中结合胆红素和未结合胆红素任标本中结合胆红素和未结合胆红素任一或两者含量的增高都会对采用免疫学原理一或两者含量的增高都会对采用免疫学原理的检测系统产生负干扰。的检测系统产生负干扰。干扰因素和对策干扰因素和对策-交叉反应物质交叉反应物质 待检标本中存在类地高辛、类待检标本中存在类地高辛、类AFP样样物质等，是一些与检测的靶抗原有交叉
24、反物质等，是一些与检测的靶抗原有交叉反应的物质。在用多克隆抗体测定抗原时对应的物质。在用多克隆抗体测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，会出用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，会出现假阳性结果。现假阳性结果。干扰因素和对策干扰因素和对策-外源性物质外源性物质 外源性物质常常是由于用于免疫测定的外源性物质常常是由于用于免疫测定的血标本采集、贮存等不当所致。血标本采集、贮存等不当所致。u 标本受细菌污染：标本受细菌污染：因菌体中可能含有内源因菌体中可能含
25、有内源性辣根过氧化物酶，被细菌污染的标本在以性辣根过氧化物酶，被细菌污染的标本在以辣根过氧化物酶为标记的辣根过氧化物酶为标记的 ELISA测定中，可测定中，可产生非特异性显色而干扰测定结果。产生非特异性显色而干扰测定结果。标本管中添加物质的影响：标本管中添加物质的影响：抗凝剂、酶抑制抗凝剂、酶抑制剂（如剂（如NaN3可抑制可抑制ELISA系统中系统中HRP活性）及分活性）及分离血清的分离胶等均对免疫检测有一定干扰作用。离血清的分离胶等均对免疫检测有一定干扰作用。应用三种检测系统分别测定应用三种检测系统分别测定100对同时采集的肌钙对同时采集的肌钙蛋白阳性的血清与肝素抗凝血浆两组标本，在两者蛋白
26、阳性的血清与肝素抗凝血浆两组标本，在两者测定值差异大于测定值差异大于20%的结果中，的结果中，ACS:Centaur cTnI占占11%，Elecsys cTnT占占9%，AxSYM cTnI占占2%，其他的抗凝剂如，其他的抗凝剂如EDTA抗凝的血浆肌钙蛋抗凝的血浆肌钙蛋白测定结果也比血清低。白测定结果也比血清低。干扰因素和对策干扰因素和对策-外源性物质外源性物质 Clin Chem 2000;46(9):1338-44干扰因素和对策干扰因素和对策-外源性物质外源性物质 标本保存不当：标本保存不当：在冰箱中保存过久的标在冰箱中保存过久的标本，血清中本，血清中IgG可聚合成多聚体、可聚合成多聚体
27、、AFP可形成可形成二聚体，在间接法二聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性；有时抗原或抗体免疫活深、甚至造成假阳性；有时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰，性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，立即测定，5天内测定的血清标本可存放于天内测定的血清标本可存放于4，1周后测定的血清标本应低温冻存。周后测定的血清标本应低温冻存。冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时分布不均，应充分混
28、合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。标本的反复冻融所应轻柔，不可强烈振荡。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。产生破坏作用，从而引起假阴性结果。干扰因素和对策干扰因素和对策-外源性物质外源性物质操作流程不当操作流程不当造成结果的改变造成结果的改变 我们对我们对HBV血清标志物五项指标仅抗血清标志物五项指标仅抗-HBc总抗体单阳性的血清实行了严格的复检总抗体单阳性的血清实行了严格的复检措施，发现初、复检结果的符合率措施，发现初、复检结果的符合率50%。偏差如此之大是无法用实验人员操作不当解偏差如此之大
29、是无法用实验人员操作不当解释的。抗释的。抗-HBc总抗体采用竞争抑制总抗体采用竞争抑制ELISA法法检测检测,日常工作中无论标本多少，必然是先日常工作中无论标本多少，必然是先加完血清标本后再加抗加完血清标本后再加抗-HBc-HRP。这样，。这样，血清中的抗血清中的抗-HBc与抗与抗-HBc-HRP存在着明显存在着明显的的“不公平竞争不公平竞争”。操作流程不当操作流程不当造成结果的改变造成结果的改变这种这种“不公平竞争不公平竞争”对实对实验结果的影响有多大？验结果的影响有多大？54(57.4)43 18 12 21 3037(39.3)21 17 18 38 2019(20.2)10 12 16
30、 56 1010(10.6)6 8 15 65 5 7(7.4)6 7 13 68 2 0 6 3 10 75 0 临界值标本临界值标本A450nm 假阳性假阳性0.3 0.30.7 0.7 （）（）阴性标阴性标 本数本数放置时间放置时间（min）表表2.加样后放置时间对检测结果的影响加样后放置时间对检测结果的影响放置放置时间时间min A450nm1.251.61.612.02.012.5 2.5 -+-+-+-+0 25 0 20 0 17 0 13 0 2 18 7 20 0 17 0 13 0 5 16 9 19 1 17 0 13 0 10 9 16 18 2 16 1 13 0 2
31、0 2 23 12 8 12 5 12 1 30 0 25 416 7 10 10 3 表表3.在加样放置时间改变后阴性标本在加样放置时间改变后阴性标本A450nm与结果的关系与结果的关系 放置放置时间时间min阴性阴性标本标本数数临界值标本临界值标本A 450nm假阳性假阳性(%)假阴性假阴性(%)0.3 0.30.70.7 0 75 10 3 6 0 0 10 74 11 3 61(1.0)0 20 75 10 3 6 0 0 30 76 9 3 6 01(1.0)40 74 11 3 61(1.0)0表表4.加样同时加入抗加样同时加入抗-HBc-HRP放置放置不同时间对检测结果的影响不同
32、时间对检测结果的影响操作流程不当操作流程不当造成结果的改变造成结果的改变 我们将临床抗我们将临床抗-HBc总抗体的加样方式总抗体的加样方式改为每加入改为每加入10个标本，立即加入抗个标本，立即加入抗-HBc-HRP（时间控制在（时间控制在1min40s左右），直至标左右），直至标本全部加完，再共同本全部加完，再共同37温育温育30 min。经。经过几万例临床标本的检验证实，表明这种加过几万例临床标本的检验证实，表明这种加样方法明显减少了由于操作流程不当造成的样方法明显减少了由于操作流程不当造成的结果假阳性，使检测结果的真实性得到一定结果假阳性，使检测结果的真实性得到一定的保证。的保证。操作不当
33、操作不当交叉污染交叉污染 定性免疫测定已广泛用于感染性病原体抗定性免疫测定已广泛用于感染性病原体抗原和抗体检测，目前国内应用最广泛的是原和抗体检测，目前国内应用最广泛的是ELISA等。由于测定操作和等。由于测定操作和(或或)加样吸头重复加样吸头重复使用的全自动加样系统的使用，常有标本间的使用的全自动加样系统的使用，常有标本间的交叉污染所致交叉污染所致“拖带拖带”现象致假阳性结果的出现象致假阳性结果的出现。标本交叉污染不光是导致假阳性，亦会因现。标本交叉污染不光是导致假阳性，亦会因为乙肝疫苗的普遍免疫，标本中存在的抗为乙肝疫苗的普遍免疫，标本中存在的抗HBs 可使受污染标本中可能存在的可使受污染
34、标本中可能存在的HBsAg检测受检测受抑，而致假阴性。抑，而致假阴性。操作不当操作不当交叉污染交叉污染 样本号样本号 孔位号孔位号S/CO均值均值复检复检S/CO均值均值 1 E 9 20.7 21.2 2 E10 12.2 4.4 3 E11 4.7 1.7经江苏省防疫站经江苏省防疫站HIV确认中心确认，除确认中心确认，除E9孔所对孔所对应的标本为应的标本为HIV阳性外，其余均为阴性。将这阳性外，其余均为阴性。将这3份份新标本进行新标本进行ELISA 检测，结果与印迹法吻合。检测，结果与印迹法吻合。操作不当操作不当交叉污染交叉污染 目前的全自动加样系统，不管是一次性目前的全自动加样系统，不管
35、是一次性加样针还是永久性加样针，均难以避免样本加样针还是永久性加样针，均难以避免样本的污染问题。特别是当遇到高浓度的抗原或的污染问题。特别是当遇到高浓度的抗原或抗体，沿加样方向被污染的甚至可能不止抗体，沿加样方向被污染的甚至可能不止1 个个孔。为了排除这种污染造成的假阳性，建议孔。为了排除这种污染造成的假阳性，建议当同一行当同一行/列上（沿加样方向）出现连续阳性，列上（沿加样方向）出现连续阳性，并经复查仍为阳性时，应同时采取新鲜标本并经复查仍为阳性时，应同时采取新鲜标本进行检测来加以证实。进行检测来加以证实。交叉污染交叉污染-判断判断 当出现交叉污染时当出现交叉污染时,如何从日常检测结如何从日
36、常检测结果来判断假阳性的可能原因以及阴性质控或果来判断假阳性的可能原因以及阴性质控或阳性质控成立，但测定结果中已存在假阳性阳性质控成立，但测定结果中已存在假阳性或假阴性，如何从日常检测结果来观察或假阴性，如何从日常检测结果来观察?在实验室日常检测阳性率比值呈正态分在实验室日常检测阳性率比值呈正态分布时，可采用半布时，可采用半LeveyJennings质控图法；质控图法；不呈正态分布时则可用直接概率法。不呈正态分布时则可用直接概率法。中华检验医学杂志中华检验医学杂志 2006,29(2):173176检测次数检测次数 每次标本数每次标本数 阳性数阳性数 阳性率阳性率 1 184 17 0.092
37、 2 221 20 0.090 3 184 18 0.098 4 152 12 0.079 5 187 23 0.123 6 184 20 0.109 7 184 21 0.114 8 205 29 0.141 9 204 21 0.103 10 184 20 0.109 11 130 16 0.123 12 184 26 0.141 13 182 22 0.121 14 184 24 0.130 15 163 13 0.080 16 184 21 0.114 17 169 16 0.095 18 184 17 0.092 19 153 22 0.144 20 214 29 0.136我科我科
38、20天天HBsAg 阳性率的变化阳性率的变化=0.112S=0.01982S=0.0396+2S=0.1516质控规则：质控规则：当阴性质控样本为阳性时，不管阳性率测定当阴性质控样本为阳性时，不管阳性率测定比值为何，均为失控，比值为何，均为失控，所有阳性标本须重新测定所有阳性标本须重新测定。如果阴性。如果阴性质控样本为阴性，某次测定阳性比值超出质控样本为阴性，某次测定阳性比值超出+2SD，则为失控，则为失控为为1+2S规则。本次结果的阴性结果可根据阳性质控样本的规则。本次结果的阴性结果可根据阳性质控样本的情况决定是否可以发出；情况决定是否可以发出；所有阳性样本结果不能发出，需查所有阳性样本结果
39、不能发出，需查找出现阳性率增高的原因并重新检测。找出现阳性率增高的原因并重新检测。免疫检测中值得注意的问题免疫检测中值得注意的问题钩状效应钩状效应(Hook effect)由于待检标本中抗原浓度的显著升高由于待检标本中抗原浓度的显著升高,而致捕获抗体不足所造成的检测结果假阴性而致捕获抗体不足所造成的检测结果假阴性或假低测定值。这种现象可以出现在任何免或假低测定值。这种现象可以出现在任何免疫学检测中，一步法检测更易见。在我科已疫学检测中，一步法检测更易见。在我科已出现在：出现在：时间分辨免疫荧光分析法时间分辨免疫荧光分析法 速率散射免疫比浊法速率散射免疫比浊法 ELISA（一步法、二步法）（一步
40、法、二步法）免疫滲透层析法免疫滲透层析法在临床检测中密切关注在临床检测中密切关注Hook effect”的几个项目：的几个项目：甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）HBsAg、HBeAg 免疫球蛋白免疫球蛋白 大便隐血（大便隐血（FOB）CA125“Hook effct”的预防和处的预防和处理理u 依据患者的临床诊断依据患者的临床诊断u 关注患者的其他实验室检查结果关注患者的其他实验室检查结果u 不放过任何异常的测定值或模式不放过任何异常的测定值或模式u 使用免疫滲透层析法快速验证使用免疫滲透层析法快速验证u 尽可能使用二步法进行检测尽可能使用二步法进行检测处理：处理：用正常人血清系列用正常人血清系列10倍稀倍稀释再检测释再检测免疫检测中值得注意的问题免疫检测中值得注意的问题u 检测使用一种试剂盒、复检必须使用另一检测使用一种试剂盒、复检必须使用另一种试剂盒，最好方法学也不一样。种试剂盒，最好方法学也不一样。u HBsAg、抗、抗HBs、HBeAg、抗、抗HBe的的检测最后可以使用检测最后可以使用“中和法中和法”来鉴定。来鉴定。u 抗抗HCV的检测目前国内外的试剂盒单独的检测目前国内外的试剂盒单独使用均有可能出现假阴性或假阳性，联合使用使用均有可能出现假阴性或假阳性，联合使用可以减少错误结果；并可用可以减少错误结果；并可用RTPCR鉴定。鉴定。
