1、第六章 常用分子生物学技术,第一节 分子杂交技术,具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下 按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列称探针。,在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,二、DNA变性是双链解为单链的过程,双链间氢键的断裂！,2、DNA变性的本质,1、DNA变性的概念,DNA变性曲线 AT区先解链 GC区后解链 阶梯式曲线,DNA变性的动态变化过程,核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DN
2、A或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。,分子杂交,核酸分子杂交,探针技术,探针 (probe) 一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,一、Southern印迹,此技术由Southern 1975年首先设计。被检测对象为DNA。,带有DNA片段的凝胶,Southern 印迹杂交的技术流程,从凝胶上转移DNA,二、Northern 印迹,应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小。
3、其方法类似于Southern印迹杂交。,三、Western 印迹,将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。,三种 印迹比较,三种印迹技术的比较,四、原位杂交 (in situ hybridization),1、定义： 将标记探针与细胞或组织中核酸按碱基配对原则进行特异性杂交，并应用组织化学或免疫组织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或基因表达的检测技术称原位杂交（hybridization in situ)。 2、操作步骤： 载片的清洁与处理；组织与细胞的固定；探针； 湿盒,原位杂交,五、生
4、物芯片chip,生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。,1、生物芯片技术的特点,2、生物芯片使用步骤,芯片制作,把探针固定于载体表面,样品处理,目标分子富集,分子间的杂交,结果检测与数据分析,基因芯片扫描结果,不同的颜色代表一个探针点杂交上的带荧光标记的核酸分子数的差异。红黄绿兰紫,3、生物芯片分类,（1）基因芯片 （2）蛋白质芯片 （3）细胞芯片 （4）组织芯片,基因芯片概念：基因芯片，也叫DNA芯片，是将
5、大量特定序列的DNA片段（分子探针）有序地固定在经过处理后的尼龙膜、玻璃片、硅片等支持物上 ，从而能快速、准确地对大量DNA分子序列进行测定和分析的一种类似电脑的芯片。 原理：利用碱基的互补配对原则（DNA分子杂交） 材料：分子探针，尼龙膜，玻璃片，硅片,可在基因组水平进行基因表达和发现研究、突变、序列测定等，已方泛应用于基因组研究和人类疾病的诊断等多领域。,4、基因芯片应用,5、制作基因芯片的大致步骤,表达芯片的制备检测流程,应用基因微矩阵芯片研究宫颈癌相关基因表达,DNA微点阵已广泛和流行的用于疾病诊断、基因组比较、以及新型癌症的分类。,第二节 目的基因制备技术,Kary Mullis r
6、esearch scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize,一、聚合酶链式反应（PCR）,（一）PCR技术发展简史,PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的；最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。随后使用了1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可
7、能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR进行实用阶段。,1、PCR的基本原理,DNA半保留复制机理,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）,（二）PCR技术的基本原理和操作,模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+,2、PCR的基本成份,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,3、PCR的基本操作,PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n (n 为循环次数),是不是循环次数越多越好？,PCR扩增的平台效应,4、PCR的反应步骤,5、引物设计,（1) 序列应位于高度保守区，与非扩
8、增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制,6、PCR技术的优点,特异性强 灵敏度高 操作简单、省时 对待检原始材料质量要求低 高效率的基因扩增技术,PCR技术的特点：扩增特异的DNA片段,1、目的基因的克隆 2、基因的体外突变 3、DNA和RNA的微量分析 4、DNA序列测定 5、基因突变分析,（三）PCR的主要应用,实时PCR技术原理,目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳
9、比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针； 基因组DNA结构功能的研究,不对称PCR,高浓度引物,低浓度引物,反向PCR (reverse PCR),用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。,未知序列,未知序列,已知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,多重PCR,在同一PCR体系中加入若干对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。 当基因的外显子发生缺失时，根据条带缺失的数目和引物相应的位置，可判断基
10、因中哪一个或哪几个扩增部位发生缺失。,电泳,引物,1,2,3,4,1,2,3,4,DMD：人类肌营养不良基因,A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子819缺失,B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者,C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式,多重PCR检测DMD基因缺失,DMD基因外显子缺失的检测,在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。,LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记, 用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,标记引物
11、,观察,PCR产物,逆转录PCR（RT-PCR）,以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。 主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等,逆转录生成cDNA方式： 以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物，mRNA3末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增。,reverse transcription,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,用目的基因上的一段DNA做成探针与文库中的DNA作核酸杂交，从基因文库中“钓出”有目的基因的克隆。,二、cDNA文库
12、cDNA library,基因组DNA文库 (genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library),基因文库 (gene library),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,基因组DNA文库,从cDNA文库获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,三、化学合成,第三节 基因敲除技术,基因敲除（gene knock out）又称基因剔除，或基因打靶 （gene targeting）是指通过DNA定点同源重组，定向改变基因组中的某一特定基因，使机体特定基因失活或缺失，从而研究此基因的功能的一种分子生物学技术。,转抗凝血酶素V基因、转-干
13、扰素基因羊。,如何敲除其胰岛素基因，成为糖病模型？,猴的基因编码与人类只有1%的差别，通过转基因猴，可以研究各种疾病对人的影响，并开发出相应的治疗方法。如引进老年性痴呆病的基因，加快针对这种疾病疫苗的开发研究。还可引进糖尿病、乳腺癌、帕金森氏症等基因，为人类最终战胜社些疾病提供帮助。,由于胚胎干细胞的这种特殊性，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。 1984年，Bradly等成功地用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，再适当交配，获得源于ES细胞系纯系小鼠。,基因敲除的发展历程
14、,此实验首次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除(Gene knockout)的动物模型。 此后，这项技术得到了普遍应用和长足发展。,一、基因敲除的一般原理,基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。,knock-out ：the
15、gene of interest is disrupted,同源重组,抗性选择,RB,DT-A,DT-A,hpt,En,LB,Waxy,重组,整合,Waxy,hpt,En,Waxy,重组,intron1,表达载体,受体基因组,打靶结果,基因打靶（gene targeting）,发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。,同源重组是最基本的DNA重组方式,Holliday模型的4个关键步骤：,两个同源染色体DNA排列整
16、齐；,一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体；,通过分支移动产生异源双链DNA；,Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：,Holiday中间体,5,片段重组体,拼接重组体,二、基因敲除载体构建,1、获得目的基因的同源片段。 2、从重组质粒中切除目的基因同源片段的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端。 3、将新霉素抗性基因（neo）克隆到带有同源序列的线性质粒中。 4、在目的基因同源序列的外侧线性化重组质粒载体，引入疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）,1、插入性载体(gene-insertion vector
17、)： 断裂位点位于同源序列区域内，选择基因紧邻同源目的序列。基因重组时整个载体整合到染色体靶位点上，载体 DNA 同源序列与染色体靶位点进行一次同源重组。,2、置换型载体(gene-replacement vector)： 断裂位点位于同源序列区域的外侧或两侧，选择基因位于同源目的序列内部或外侧。基因重组时以载体的同源序列取代染色体靶位序列，载体DNA 同源目的序列与染色体靶位点进行两次同源重组。目前，大多数基因敲除都采用置换型载体。,取代型（a）或插入型（b）载体,三、基因敲除载体导入ES细胞,1、ES 细胞的获得 现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也
18、有使用。常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。,ES能在体外培养，保留发育的全能性！,2、基因载体的构建 把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。,Neo（新霉素）阳性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase),常用于基因敲除
19、的靶细胞是小鼠ES细胞。导入方式有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等，目前应用较多的是显微注射法。,3、重组DNA导入ES,（1）显微注射法 (Microinjection technique),显微镜下，用一根极细的玻璃针（直径1-2微米）直接将DNA注射到胚胎的细胞核内，再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。用这种方法生产的动物约有10%是整合外源基因的转基因动物。,（2）电穿孔法 在高压电场的短暂作用下，细胞膜上可出现可逆的孔洞，外源DNA可通过此孔洞进入胞内。,（3）DNA-磷酸钙共沉淀法 将DNA与CaCl溶液混合，再缓慢滴加入含有磷酸的HEPES
20、溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀颗粒。 小心地将颗粒加入到培养的靶细胞表面，保温数小时后，使DNA被靶细胞摄取。,（4）DEAE-右旋糖苷法 该法先用来促进病毒DNA导入，后来发展为一种哺乳动物细胞的基因转移方法。 方法：用外源DNA和DEAE-右旋糖酶的混合物处理细胞。 常用于克隆化基因的瞬间表达，不用于细胞的稳定转化。,（5）逆转录病毒载体 逆转录病毒是一种RNA病毒，基因大小为3-10kb。不同于其它病毒，它具有二倍体基因，即含有两个相同的RNA分子，有典型的真核mRNA结构（包括帽子和尾巴）。,四、筛选与鉴定,由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10-210-5。因此
21、如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选法（PNS法，Positive-Negative Screening），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。 应用最多的是PNS法。,正负双向筛选系统：（ positive and negative selection，PNS），PNS采用置换型载 体，该载体含有正负选择基因各一个，正向选择基因多为neo基因，插入载体的同源序列中；负向选择基因常用HSV-tk基因，置于同源序列的外侧。同源重 组时，载体的同源区发生重组，同源区以外部分将被切除，所以在同源重组时，tk基因将被切除而丢失。而在随机整合时，所有序列
22、均保留。,1、正负筛选法（PNS）,胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。在同源重组时，细胞对 G418和GANC都有抗性，随机整合时只对G418有抗性，而对GANC敏感，细胞将被杀死。未进行任何方式整合的细胞则被G418杀死。,用G418作 正筛选，可得到含有neo基因的细胞株，然后再用丙氧鸟苷做负筛选，淘汰含有tk基因的细胞株，就可以得到不含tk基因的同源重组细胞株。,正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞,2、正向筛选法,正向筛选标记基因Neo具有双重作用，一方面导致了靶基因的插入突变；同时作为重
23、组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养 基中生长。类似的正负基因还有一些，例如gpt (对6 - 巯基尿嘧啶敏感)和dta (diptheria 毒素,直接毒性作用)。 正向筛选法可分为无启动子筛选法、无增强子筛选法和无polyA筛选法。,（1）启动子缺失筛选法 原理是在重组基因载体的目的片段中插入一个启动子缺失的正向选择基因 neo neomycin，同时，目的基因片段也不包含该基因的启动序列。如果基因载体和细胞基因组发生同源重组，则正向选择基因可以在靶位点基因启动子的作用下 得以表达，使阳性细胞具有 G418 抗性，从而在选择培养基中得到同源重组阳性克隆。,（2）Pol
24、y- A缺失筛选法 Poly-A缺失筛选的载体设计与启动子缺失的设计基本相同，当打靶基因不能被诱导表达时，则考虑选用poly- A缺失敲除策略。Poly - A 缺失的正向选择基因 neo位于载体目的片段中, 由于neo 基因转录终止信号的缺失,其表达受到抑制。在重组阳性细胞中，neo基因通过利用基因组靶位基因的转录终止信号得以表达，使阳性细胞获得 G418 抗性，并得以筛选出来。,3、PCR筛选法,其原理是通过在目的突变基因序列中引入特定的PCR引物序列，利用 PCR方法直接检测转化细胞的 DNA结构，然后根据特定扩增 DNA片段的有无,来鉴别中靶阳性细胞克隆。,PCR法鉴定ES细胞的引物设
25、计,获得基因敲除纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中，所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。,五、基因敲除动物的产生,由嵌合体得到基因敲除的纯合体小鼠,运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。,六、基因敲除进展与应用,常规基因敲除的基础上又发展了： 1、条件性基因敲除、 2、体细胞基因敲除、 3、基因诱捕等新技术。,基因诱捕（gene trapping）,基因诱捕又称随机基因敲除，它不是利用外源基因与基因组同源序列进进行同源重组，而是利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法。通常基因捕获载体还包括一个无启动子的报道
26、基因，通常是neo 基因，neo 基因插入到ES 细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES 克隆可以很容易地在含G418 的选择培养基中筛选出来。,基因捕获法的基本原理图,中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。,根据所诱捕的表达调控序列的不同，广义基因诱捕包括了增强子诱捕、基因诱捕、启动子诱捕、polyA诱捕等多种类型。,第四节 RNA干扰技术,2006年10月2日，瑞典卡罗林斯卡医学院宣布将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁法尔和克雷格梅洛，表彰他们发现了“RNA（核糖核酸）干扰”机制。 法尔和梅洛获奖是因为他们“发现
27、了控制遗传信息流动的基本机制”。RNA干扰已被广泛用作研究基因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治疗疾病的新疗法。,梅洛(Craig Mello)生于1960年，是被恐龙骨引入科学世界的。梅洛童年时经常跟着父亲在美国西部寻找化石。从那时起，他就迷上了远古时代、地球历史和人类生命的起源等问题。高中时代，梅洛的兴趣逐渐转移到了基因工程方面。,法尔(Andrew Fire)1959年出生在美国加利福尼亚州，本科在加利福尼亚大学伯克利分校主修数学，仅用3年时间就拿到学位。与梅洛类似，他逐渐对涉及生命奥秘的遗传学产生兴趣，并将其作为自己终身的学术追求。,实验一： Napoli (1990) 将
28、紫色色素基因引入开紫花的矮牵牛。 期望：紫色更深。 结果： 植物产生了白花。 解释：紫色色素基因被抑制了，这种现象称共抑制cosuppression (Jorjensom R, 1990),一、RNAi的发现,实验二,1995年，康乃尔大学的Guo和Kempheus在试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。 但结果是二者同样地切断了par-1基因表达途径。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。,论文：
29、 Guo S, Kemphues KJ, Par L. Cell, 1995,81:611-620.,秀丽新小杆线 虫（C. elegans）,1998年2月，华盛顿卡耐基研究院Fire和马萨诸塞大学医学院的Mello通过大量的工作，证实，Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达，以及反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因表达。该小组将这一现象称RNA干扰（RNA interference ,简称RNAi）。,Nega
30、tive control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3
31、mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.),Effects of mex-3 RNA interference on leve
32、ls of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos.,实验：Fire等（1998）将dsRNA注入线虫合胞腺体。 结论： dsRNA 比反义RNA更能减少 mex-3 mRNA的量， 同时抑制信号可以从细胞到细胞进行传递。,dsRNA的抑制效率,在1999年短短的一年间,发现RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞。2000年，又先后发现小鼠早期胚胎中和大肠杆菌中也存在R
33、NA干扰现象。 2000年提出RNAi作用机制模型。,论文： Hannond SM et al. Nature, 2000, 404(6775):293-296 Zamore PD. Cell, 2000,101(1):25-33,2001年，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基因沉默现象。Nature，2001，411（6836）：494498 RNAi技术被Science评为2001年度的十大科技进展之一。,二、RNAi的作用机制,引入 dsRNA Dicer酶把 dsRNA 切成siRNAs 形成RISC 靶向 mRNA 特异 mRNA 降解,dsRNA：双链RNA，包含正义链和反义
34、链 Dicer：属于RNase 家族，是dsRNA的特异性核酸内切酶 siRNA：small interfering RNA ，RNAi的关键效应分子，21-23个nt大小的双链RNA RISC：RNA-inducing silencing complex，具有核酸内切、外切以及解旋酶活性 RdRP：RNA-dependent RNA polymerases，依赖RNA的RNA聚合酶，是RNAi的调节因子，使RNAi可以在生物体内传递,相关的名词,1、起始阶段,（dsRNA在酶的作用下变成siRNA）,Tuschl（2001）,processing the dsRNA into 21-23 n
35、t fragments,siRNAs have a defined structure,19 nt duplex,2 nt 3 overhangs,Hannon G (2002). RNA interference. Nature 418: 244-251.,2、效应阶段,mRNA 降解,三、RNAi的放大效应机制,siRNA不仅可引导RISC切割靶RNA，而且可作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA。 新合成的长链dsRNA同样可被RNase样核酸酶切割、降解而生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成-切割的循环过程，进一步放大R
36、NAi作用。这种合成-切割的循环过程称为随机降解性PCR（random degradative PCR）。,Gisela Storz, Science, 296(5571):1263-1265, 2002.,四、RNAi的作用特点,1、高度特异性 2、具有高效性 3、受多基因控制 4、需SiRNA介导 5、对靶基因位点的选择性 6、放大效应,五、RNAi的生物学意义,被称为生物体的watchdog消灭病毒，抵抗转座。,六、RNA干扰的应用,1、基因功能研究,由于RNAi具有高度专一性和有效性，可特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变。研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，而
37、抑制时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物。,2、病毒性疾病的治疗-艾滋病,研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA，激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5进入人体外周淋巴细胞，而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4，从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答，由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。,2、病毒性疾病
38、的治疗-HBV,Shlomai 和 Shaul 设计了各针对HBV基因19nt的两种pSUPER载体：pSUPER X-siRNA和pSUPER core-siRNA。已转染含1.3 X wt HBV基因质粒载体的Huh7细胞再被 X-siRNA或 core-siRNA转染后，core蛋白水平分别降低了89%、63%，转染X-siRNA的细胞中HBsAg降低60%，但转染core-siRNA对HBsAg表达无明显影响（X-siRNA干扰沉默了所有的病毒转录物，而core-siRNA仅沉默3.5kb、3.9kb的mRNA）。,2、病毒性疾病的治疗 -HVC,Randall等证明了针对HCV RN
39、A的siRNA转染细胞4天后可使细胞质中复制的HCV RNA降低80倍；将siRNA 转染至已有HCV感染、复制的细胞，siRNA对98%以上可检测到HCV抗原、HCV复制活跃的细胞有抑制作用；siRNA干扰沉默HCV RNA具有剂量依赖性和序列特异性。Kapadia等 也证明了siRNA特异抑制HCV RNA复制、阻止相关蛋白表达的作用。,2、病毒性疾病的治疗 其它病素,RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等，siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫，用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。siRNA在感染的早期阶段能有效地抑制病毒的复制，病毒感染能被
40、针对病毒基因和相关宿主基因的siRNA所阻断，这些结果提示RNAi能胜任许多病毒的治疗。,3、肿瘤治疗,用RNAi特异性地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这类基因保持在静默或休眠状态，从而有望用这种新的手段治疗各种恶性肿瘤。,(1)RNAi可应用于敲除点突变激活的癌基因， (2)RNAi应用于抑制插入基因及融合基因表达， (3)RNAi可应用于抑制基因扩增。,3、肿瘤治疗,Survivin基因是迄今为止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成员，可通过抑制caspase级链反应下游的caspase3，caspase7发挥其抗凋亡作用 。现在研究已证实survivin基因参与了肝癌的发生与发
41、展，并且还与化疗的耐药性相关。降低survivin基因在肝癌细胞中的表达不仅可诱导肝癌细胞的凋亡、抑制肝癌细胞的生长，还可增强其对化疗的敏感性，从而提高肝癌治疗的整体疗效。,3、肿瘤治疗,MDR (Muhidrug resistance)是肿瘤化疗失败的主要原因，形成MDR的最常见的因素是肿瘤细胞MDR基因编码的糖蛋白过度表达，其中，MDR1对于细胞的多重耐药性起着重要的作用。Nieth等表明，特异siRNA可以抑制MDR1基因的表达，从而显著降低肿瘤细胞的耐药性。,4、药物开发,利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快药物开发的研制速度大有益处，因为基因组研究成果和高通量的筛选技
42、术，为更好更快发现药靶和候选药物提供了重要基础。在药物开发过程中，用RNAi技术可以对靶基因的功能进行分析，有助于搞清药物的作用机制以及与基因编码产物，及与相应化合物的相互作用，从而更正确地发现药靶，开发更有效的候选药物。,21-23nt. 2-nt 3 overhangs ( UU overhangs ). G/C 含量: 30-50%. 无不配对碱基. BLAST : eliminate any target sequences with significant homology to other coding sequences. design and test 34 siRNA seq
43、uences,七、SiRNA的设计与制备,发夹结构siRNA中环的长度和序列,hpRNA :55% ihpRNA: 90% ihpRNA overhang :80% 、ihpRNA spacer :89% ihpRNA这种构建抑制效率最高，抑制效率均在90%左右,siRNAs的制备,化学合成； 体外转录； 长链 dsRNA 用 RNase III家族酶如 Dicer, RNaseIII等消化。 质粒和病毒载体,化学合成的siRNA质量高。 量多、纯度高。 非常昂贵。 比较适合需要量大、确定的siRNA 序列。 不适合筛选siRNA序列。 序列： 从起始密码子下游50-100bp. 大约21-2
44、3个核甘酸： AA(N19)TT 5磷酸，3羟基,化学合成,体外转录,费用适中 比较容易转染 比较适合筛选 siRNA序列 不适合需要大量单链siRNA序列的研究,长链dsRNA 用RNaseIII类酶消化,long dsRNA: 2001000 nt (in vitro transcription) digest in vitro with RNase III (or Dicer) remove any undigested dsRNA Transfection,用siRNA表达质粒 或病毒表达载体：高效。,体内表达,电击,病毒载体,溶液注射,磷酸钙转染,脂质体,siRNA 导入细胞的几种方
45、法,第五节 核 酸 序 列 分 析 Nucleic Acid Sequence Analysis,不能忘记的人,F Sanger W Gilbert,桑格（英国化学家）最早测定胰岛素的氨基酸顺序获得1958年诺贝尔化奖。22年后，他因测定了一种噬菌体的一级结构获1980年的诺贝尔化学奖。 吉尔伯特在DNA测序领域，因其卓越的工作获得1980年诺贝尔化学奖。,1. 化学裂解法 (Maxam Gilbert ,1977 ) 2. 双脱氧链末端终止法 (Sanger ,1977) 3. DNA自动化序列分析,Sanger, UK； Maxam Gilbert，共同分享1979 Nobel化学奖,一、
46、DNA序列分析,高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术,PAGE能分离长度为300-500个碱基,差别仅1个碱基的单链寡核苷酸DNA片段。,二、DNA测序技术基础,化学裂解法(Maxam-Gillbert法),基本原理:,基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。,化学降解
47、G反应模式图,Met,Met,Met,Met,(Sanger),双脱氧链末端终止法 （dideoxy chain termination）,以DNA合成反应为基础。,也称为DNA链末端合成终止法,ATP、dATP和ddATP的结构,测序步骤,G A T C,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,三、DNA自动测序,DNA自动测序结果举例,
