1、.1第第 五五 章章蛋蛋 白白 质质 组组 学学(Proteomics)医学检验系临床生化教研室医学检验系临床生化教研室 周周 琳琳.2重点重点蛋白质与蛋白质组学的概念蛋白质与蛋白质组学的概念难点难点二维凝胶电泳、酵母双杂交等技术的原理与方法二维凝胶电泳、酵母双杂交等技术的原理与方法了解了解蛋白质组学在医学中的应用蛋白质组学在医学中的应用.3蛋白质组学研究背景蛋白质组学研究背景1.1.基因研究是基因研究是2020世纪生命科学的主线世纪生命科学的主线 19531953年，年，DNADNA双螺旋结构的提出双螺旋结构的提出 19541954年，年，“中心法则中心法则”的问世的问世 2020世纪世纪9
2、090年代，全球性基因组计划尤其是人类基因组计年代，全球性基因组计划尤其是人类基因组计 划（划（HGPHGP）的大力推进）的大力推进 20002000年年6 6月，月，HGPHGP计划完成计划完成结构基因组学时代结构基因组学时代.4蛋白质组学研究背景蛋白质组学研究背景2.“2.“后基因组时代后基因组时代”（postgenome erapostgenome era）功能基因组学（功能基因组学（functional genomics)functional genomics)成为研成为研究的重心，蛋白质组学（究的重心，蛋白质组学（proteomicsproteomics）则是其）则是其“中中流砥柱流
3、砥柱”。转录组学转录组学蛋白质组学蛋白质组学代谢组学代谢组学表型组学表型组学相互作用组学相互作用组学 功能基因组学功能基因组学.5 蛋白质组学蛋白质组学是后基因组学时代研究的中是后基因组学时代研究的中心，而以阐明生物体内心，而以阐明生物体内蛋白质表达模式蛋白质表达模式与与功能功能模式模式为目标的蛋白质组学成为功能基因组学研为目标的蛋白质组学成为功能基因组学研究的重要内容之一。究的重要内容之一。.6 第一节第一节 蛋白质组及蛋白质组学基本概念蛋白质组及蛋白质组学基本概念.7蛋白质组蛋白质组(proteome)：PROTEOME=PROTE in+genOME Proteins expressed
4、 by a genome.是指是指“特定细胞、组织乃至机体作为一个特定细胞、组织乃至机体作为一个生命单元中生命单元中所有蛋白质的集合所有蛋白质的集合，即生命体中携，即生命体中携带的基因信息在带的基因信息在某一时段所表达的全部蛋白质某一时段所表达的全部蛋白质。什么是蛋白质组？什么是蛋白质组？.8 1.1.对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。不是局限于一个或几个蛋白质。2.2.同一基因组在不同细胞、不同组织中的表同一基因组在不同细胞、不同组织中的表 达情况各不相同达情况各不相同 。3.3.在空间和时间上动态变化着的整体。在空间和时间上
5、动态变化着的整体。蛋白质组蛋白质组.9Genome=static compositionProteome=highly flexible compositionIdentical Genome but different looks.?proteome comparison蛋白质组与基因组的联系与区别蛋白质组与基因组的联系与区别.10蛋白质组学（蛋白质组学（proteomics）：）：以蛋白质组为以蛋白质组为研究对象研究对象，分析分析细胞内动态细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，饰状态，了解了解蛋白质之间的相互作用与蛋白质之间的相互作用与联系，
6、联系，在整体水平上在整体水平上揭示蛋白质功能与揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。细胞生命活动规律。什么是蛋白质组学？什么是蛋白质组学？.11 表达蛋白质组学表达蛋白质组学（expression proteomics)：即把细胞、即把细胞、组织中的蛋白，建立蛋白定量表达图谱，组织中的蛋白，建立蛋白定量表达图谱，观察某种细胞或组织观察某种细胞或组织中蛋白质的整体表达中蛋白质的整体表达,并分析不同情况下表达图谱的变化。并分析不同情况下表达图谱的变化。蛋白质组学的分类与研究内容蛋白质组学的分类与研究内容 细胞图谱蛋白质组学细胞图谱蛋白质组学（cellmap proteomics）：即确）：即确定蛋白质
7、在亚细胞结构中的位置；通过纯化细胞器或用质谱仪定蛋白质在亚细胞结构中的位置；通过纯化细胞器或用质谱仪鉴定蛋白复合物组成等，来确定蛋白质鉴定蛋白复合物组成等，来确定蛋白质-蛋白质的相互作用。蛋白质的相互作用。组成蛋白质组组成蛋白质组学学 比较蛋白质组比较蛋白质组学学 功能蛋白质组学功能蛋白质组学结构蛋白质组学结构蛋白质组学.12人类蛋白质组学研究进展人类蛋白质组学研究进展 2001年成立国际人类蛋白质组组织（年成立国际人类蛋白质组组织（HUPO），），2003.12.15启动两个首批行动计划启动两个首批行动计划 1.人类肝脏蛋白质组计划（人类肝脏蛋白质组计划（HLPP）由中国军事医学科学）由中国
8、军事医学科学 院副院长贺福初院士领导，院副院长贺福初院士领导，16国国80多个实验室参加。多个实验室参加。中国第一次领导重大国际协作计划。中国第一次领导重大国际协作计划。2.人类血浆蛋白质组计划（人类血浆蛋白质组计划（HPPP）由美国科学家牵头，）由美国科学家牵头，13国国47个实验室参加。个实验室参加。.13第二节第二节 蛋白质组学研究的内容及所采用的主要技术蛋白质组学研究的内容及所采用的主要技术.14蛋白质组学蛋白质组学表达模式研究表达模式研究功能模式研功能模式研究究二维电泳二维电泳高效液相色谱高效液相色谱HPLC质谱技术质谱技术生物信息学生物信息学噬菌体展示技术噬菌体展示技术酵母双杂交系
9、统酵母双杂交系统蛋白芯片技术蛋白芯片技术蛋白质组学的研究内容与技术蛋白质组学的研究内容与技术.15一、蛋白质组学主要研究技术一、蛋白质组学主要研究技术 （Technology of Proteomics）1.1.蛋白质分离技术蛋白质分离技术 凝胶二维电泳、凝胶二维电泳、HPLC；2.2.蛋白质鉴定技术蛋白质鉴定技术 Edman测序、质谱技术；测序、质谱技术；3 3.图像分析与生物信息图像分析与生物信息 图像分析软件，数据库；图像分析软件，数据库；4.4.相互作用研究技术相互作用研究技术 酵母双杂交技术、免疫共沉淀、蛋白质芯片等。酵母双杂交技术、免疫共沉淀、蛋白质芯片等。.16 蛋白质样品制备蛋
10、白质样品制备(sample preparation)(sample preparation)蛋白质的分离蛋白质的分离 蛋白质的鉴定蛋白质的鉴定 生物信息学研究生物信息学研究Protein ExtractionProtein PrefractionationProtein SeparationProtein Identification二、蛋白质组表达模式研究流程图二、蛋白质组表达模式研究流程图Database utilization.171、蛋白质的分离、蛋白质的分离 大规模蛋白质的分离技术大规模蛋白质的分离技术二维凝胶电泳二维凝胶电泳（2-DE2-DE）是将不同种类的蛋白质以电荷差异和相对分
11、子量差是将不同种类的蛋白质以电荷差异和相对分子量差异为基础进行的高分辨率分离分析方法。异为基础进行的高分辨率分离分析方法。工作原理：工作原理：(1)1st dimension:等电聚焦凝胶电泳等电聚焦凝胶电泳(IEF)根据蛋白质的净电荷或等电点的不同进行分离根据蛋白质的净电荷或等电点的不同进行分离 (2)2nd dimension:SDS-PAGE 根据蛋白质相对分子质量大小不同进行分离根据蛋白质相对分子质量大小不同进行分离.18 双向电泳后的凝胶双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维经染色后蛋白呈现二维分布图：分布图：水平方向水平方向反映出蛋反映出蛋白在白在pI上的差异，上的差异，垂直方向垂直
12、方向反映出它反映出它们在分子量上的差别们在分子量上的差别。第一向电第一向电泳：等电泳：等电聚焦电泳聚焦电泳聚焦后凝聚焦后凝胶放置在胶放置在SDS凝胶凝胶上，进行上，进行第二向电第二向电泳泳第二向电泳：第二向电泳：SDS-PAGE分子量大分子量大分子分子量小量小pH9pH3pH9pH3.19凝胶中加凝胶中加有两性电有两性电解质溶液解质溶液（pH9-3）加电场后加电场后在凝胶内形在凝胶内形成一个稳定成一个稳定pH梯度梯度 加样品，加样品，然后继续然后继续电泳电泳凝胶染色表明凝胶染色表明样品按照各自样品按照各自pI值沿着值沿着pH梯度分布梯度分布(1)(1)等电聚焦等电聚焦凝胶电泳凝胶电泳（IFEI
13、FE）利用载体两利用载体两性电解质在电场性电解质在电场作用下沿电场方作用下沿电场方向在凝胶内形成向在凝胶内形成一个连续而稳定一个连续而稳定的的pHpH梯度。梯度。每种蛋白质每种蛋白质都将迁移至与它都将迁移至与它的的pI pI 相一致的相一致的pHpH处。处。.20 所用介质为拥有所用介质为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的结构的8种丙烯酰种丙烯酰胺衍生物系列，其中胺衍生物系列，其中R为弱酸性或弱碱性基团，它们构为弱酸性或弱碱性基团，它们构成了分布在成了分布在pH3-9不同值的缓冲体系。不同值的缓冲体系。根据一定的配方计算后，将适宜的根据一定的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混试剂添加至
14、混合物中用于凝胶聚合，在聚合中合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度梯度。通过这种方。通过这种方式生成的式生成的IPG不会发生电渗作用，因而可以进行特别稳不会发生电渗作用，因而可以进行特别稳定的定的IEF分离达到真正的平衡状态。分离达到真正的平衡状态。固相固相pH梯度等电聚焦（梯度等电聚焦（IPG-IEF）等电聚焦凝胶电泳（等电聚焦凝胶电泳（IFE）.21上样上样去除胶条保去除胶条保护层、电泳护层、电泳转移胶条转移胶条固相等电聚焦电泳固相等电聚焦电泳.22 垂直板电泳装置垂直板电泳装置样品迁样品迁
15、移方向移方向(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)是一种去污是一种去污剂，从而使蛋白质剂，从而使蛋白质获得负电荷，屏蔽获得负电荷，屏蔽蛋白质，因此电泳蛋白质，因此电泳迁移率仅与分子大迁移率仅与分子大小相关。小相关。.23电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳.24(3)双向电泳双向电泳：等电聚焦电泳：等电聚焦电泳：SDS-PAGE 双向电泳后的凝胶双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维经染色后蛋白呈现二维分布图：分布图：水平方
16、向反映出蛋水平方向反映出蛋白在白在pI上的差异，上的差异，垂直方向反映出它垂直方向反映出它们在分子量上的差别们在分子量上的差别。第一向电第一向电泳：等电泳：等电聚焦电泳聚焦电泳聚焦后凝聚焦后凝胶放置在胶放置在SDS凝胶凝胶上，进行上，进行第二向电第二向电泳泳第二向电泳：第二向电泳：SDS-PAGE分子量大分子量大分子分子量小量小pH9pH3pH9pH3.25大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片.26.27二维电泳的优点与缺陷二维电泳的优点与缺陷优点：优点：能溶解大量蛋白质并进行定量，具有高通量、重复能溶解大量蛋白质并进行定量，具有高通量、重复性好
17、、敏感性较高等特点。性好、敏感性较高等特点。缺点：缺点：1.蛋白表达水平的差异较大，一些低丰度蛋白不易检蛋白表达水平的差异较大，一些低丰度蛋白不易检测。测。2.分辨率不能满足蛋白质组学研究的需要。分辨率不能满足蛋白质组学研究的需要。3.对极酸极碱性和疏水性膜蛋白的分离效果不佳。对极酸极碱性和疏水性膜蛋白的分离效果不佳。.28如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的如何有效的对双向凝胶电泳图像分析，如何对图谱上的蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有蛋白质点进行检测、定量、比较、分析和归类，挖掘有价值的蛋白质点的信息并对图像进行数字化处理等分析价值的蛋白质点的信息并对图像进行数
18、字化处理等分析 是双向电泳分析软件所要解决的问题。是双向电泳分析软件所要解决的问题。2 2、电泳图谱的图像分析、电泳图谱的图像分析染色完毕后，利用计算机软件对凝胶图像进行分析，染色完毕后，利用计算机软件对凝胶图像进行分析，如如PD-QUEST软件，软件，LIPS，HERMES，GEMINI等，等，.293、蛋白质的鉴定、蛋白质的鉴定生物质谱技术获得生物质谱技术获得2002年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖质谱技术（质谱技术（mass spectrometry,MS）.30 样品分子离子化后，根据不同离子间的质样品分子离子化后，根据不同离子间的质量、电荷比（质荷比）差异来确定相对分子量、电荷比（质荷比
19、）差异来确定相对分子质量的技术。质量的技术。通过正确测定蛋白质分子的质量而进行蛋白质通过正确测定蛋白质分子的质量而进行蛋白质分子鉴定、蛋白质分子的修饰和蛋白质分子相互作分子鉴定、蛋白质分子的修饰和蛋白质分子相互作用的研究。用的研究。质谱技术质谱技术.31SampleInletIonizationMass AnalyzerMass Sorting(filtering)Ion DetectorDetectionIon SourceSample/Matrix dried on MALDI Plate(Autoloader Cassette)Detect ionsForms ions(charged
20、molecules)Sort Ions by Mass(m/z)质谱的基本组成元件质谱的基本组成元件Vacuum EnvelopeRelative Abundancem/z 1000 2000 Mass SpectrumData System基本步骤：基本步骤：1.样品离子化样品离子化2.根据荷质比不同分离离子根据荷质比不同分离离子3.检测每种质量离子的数目检测每种质量离子的数目4.收集处理数据得到质谱图收集处理数据得到质谱图.32“鸟枪法鸟枪法(shotgun)”定量蛋白质组学技术定量蛋白质组学技术 蛋白质溶液或经蛋白质溶液或经SDS-PAGE分离的蛋白质条带分离的蛋白质条带肽段混合物肽段混
21、合物酶解酶解液相色谱分离液相色谱分离串联质谱分析串联质谱分析数据检索，鉴定蛋白数据检索，鉴定蛋白.334 4、蛋白质核酸间相互作用的研究、蛋白质核酸间相互作用的研究蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，电泳时蛋白质蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，电泳时蛋白质核酸的复合物比无蛋白质的探针在凝胶中泳动速度漫，表现核酸的复合物比无蛋白质的探针在凝胶中泳动速度漫，表现为相对滞后。为相对滞后。4.1 4.1 凝胶迁移滞后实验（凝胶迁移滞后实验（EMSA）.34Dnase I 可可以切割以切割DNA中磷酸二酯中磷酸二酯键，而结合键，而结合蛋白质的蛋白质的DNA免于免于Dnase I水水解，不
22、能被解，不能被切割。切割。4.2 Dnase I 4.2 Dnase I 足纹分析足纹分析蛋白质精确结蛋白质精确结合位点的研究合位点的研究方法。方法。.355 5、蛋白质与蛋白质相互作用、蛋白质与蛋白质相互作用酵母双杂交系统酵母双杂交系统酵母杂交系统是将酵母杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因待研究的两种蛋白质的基因(X(X、Y)Y)分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子如分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子如Gal4Gal4的的DNADNA结合功能域（结合功能域（BDBD）和和转录激活结构域转录激活结构域(AD)(AD)，构建，构建成融合表达载体，从成融合表达载体，从报告基因报告基因表达产物表
23、达产物分析两种蛋分析两种蛋白质相互作用的系统白质相互作用的系统。BD-X+AD-Y 报告基因转录报告基因转录诱饵蛋诱饵蛋白白捕获蛋白捕获蛋白.36GAL4GAL4转录因子的分子机理转录因子的分子机理在在GAL4 basedGAL4 based双杂交系统中双杂交系统中:正常情况在酵母细胞内正常情况在酵母细胞内:Promotergal metabolic geneGAL UASTranscriptionADBDReporter GeneGAL4 AD.37.38 酵母双杂交系统原理示意酵母双杂交系统原理示意图图XYBDAD.39细胞或组织样品细胞或组织样品蛋白样品制备蛋白样品制备二维凝胶二维凝胶电
24、泳（电泳（2D2DPAGEPAGE）分离蛋白质）分离蛋白质计算机辅助分计算机辅助分析析2D2DPAGEPAGE图象图象对感兴趣的蛋白质进行酶对感兴趣的蛋白质进行酶解解质谱分析质谱分析数据库检索数据库检索蛋白质鉴蛋白质鉴定定分析蛋白质在细胞与组织中的表达情况分析蛋白质在细胞与组织中的表达情况。一般流程一般流程小小 结结Shotgun技术技术.40第三节第三节蛋白质组学在医学中的应用蛋白质组学在医学中的应用.411 1、在临床肿瘤研究方面的应用、在临床肿瘤研究方面的应用 癌细胞不仅有许多特异蛋白质产物癌细胞不仅有许多特异蛋白质产物,而且这些产物还会而且这些产物还会影响其他蛋白质的翻译后加工及许多蛋白质的表达水平，因影响其他蛋白质的翻译后加工及许多蛋白质的表达水平，因此寻找有价值的肿瘤标志物意义重大。此寻找有价值的肿瘤标志物意义重大。2 2、在检验医学中的应用、在检验医学中的应用 血清血浆蛋白质组研究、尿液蛋白质组研究以及其他体血清血浆蛋白质组研究、尿液蛋白质组研究以及其他体液蛋白质组研究，筛选疾病标志物。液蛋白质组研究，筛选疾病标志物。3 3、传染病、传染病4 4、神经性疾病、神经性疾病5 5、糖尿病、肥胖症、糖尿病、肥胖症.42个人观点供参考，欢迎讨论！
