1、 第四节第四节 酶活性浓度的测定技术酶活性浓度的测定技术一、概一、概 述述1 1量气法：量气法：此法很少采用。此法很少采用。2 2分光光度法：分光光度法：其最大优点在于扩大了测定范围，波长范围更宽。结其最大优点在于扩大了测定范围，波长范围更宽。结合各种工具酶的偶联反应，如应用合各种工具酶的偶联反应，如应用NAD(P)HNAD(P)H和和NAD(P)NAD(P)+吸收吸收光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度的方法，使分光光谱差异建立的测定各种脱氢酶活性浓度的方法，使分光光度法得到了进一步发展，几乎可应用于各种血清酶活性光度法得到了进一步发展，几乎可应用于各种血清酶活性的测定。随着各种自动生物化学
2、仪和配套用试剂盒的普及的测定。随着各种自动生物化学仪和配套用试剂盒的普及应用，这一方法在临床酶学测定中起着十分重要的作用。应用，这一方法在临床酶学测定中起着十分重要的作用。3 3荧光法和放射性核素法荧光法和放射性核素法:对于一些酶浓度很低的标本，可考虑改用灵敏度对于一些酶浓度很低的标本，可考虑改用灵敏度较高的荧光法或放射性核素法。荧光法取决于酶促反较高的荧光法或放射性核素法。荧光法取决于酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比，并应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比，并通过荧光光度计进行测定，根据荧光强弱的变化换算通过荧光光度计进行测定，根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。例如，还
3、原型的出酶的活性。例如，还原型的NAD(P)HNAD(P)H有强烈的荧光，有强烈的荧光，故所有以故所有以NAD(P)NAD(P)+为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法进行测定。核素法因有污染且操作烦杂，目前应用较进行测定。核素法因有污染且操作烦杂，目前应用较少。少。4 4其他方法其他方法:二、酶活性浓度的测定二、酶活性浓度的测定 测定酶的催化活性浓度是临床酶学分测定酶的催化活性浓度是临床酶学分析最为常用的方法，具有迅速、灵敏、成析最为常用的方法，具有迅速、灵敏、成本低等特点。可根据酶促反应进程曲线，本低等特点。可根据酶促反应进程曲线，采用合理的方法进行酶活性浓度的测
4、定。采用合理的方法进行酶活性浓度的测定。(一一)酶促反应进程酶促反应进程 (二二)酶活性浓度测定方法酶活性浓度测定方法 酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度速度(v)(v)达到最大速度达到最大速度VmaxVmax，即在过量底物存在，即在过量底物存在下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度 EE之间有线性关系。如按反应时间将酶活性浓之间有线性关系。如按反应时间将酶活性浓度测定方法进行分类，可分为定时法度测定方法进行分类，可分为定时法(fixed(fixed time assay)time assay)和连续监测法和连
5、续监测法(continuous(continuous monitoring assay)monitoring assay)两大类。两大类。1 1定时法定时法 这是早期测定酶活性浓度的方法这是早期测定酶活性浓度的方法。大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应平均速度。这类方法有多种命名，如应平均速度。这类方法有多种命名，如“取样取样法法”、“终点法终点法”或或“两点法两点法”。用定时法测定酶活
6、性浓度，必用定时法测定酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则会引起较作用时间要很精确，否则会引起较大误差。这种方法的优点是比较简大误差。这种方法的优点是比较简单，因测定时酶促反应已被终止，单，因测定时酶促反应已被终止，故比色计或分光光度计无需保温设故比色计或分光光度计无需保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点是无法知道在整活性的影响。缺点是无法知道在整个酶促反应进程中是否都是零级反个酶促反应进程中是否都是零级反应。应。2 2连续监测法连续监测法 连续测定酶反应过程中某一反应连续测定酶反应过程中
7、某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。酶活性浓度的方法称为连续监测法。2 2连续监测法连续监测法 连续测定酶反应过程中某一反应产物或连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称为连续监测法。与定时法不同的是，这类方为连续监测法。与定时法不同的是，这类方法勿需停止酶促反应，不需添加其他呈色试法勿需停止酶促反应，不需添加其他呈色试
8、剂，就可测定反应物的变化，很容易观察到剂，就可测定反应物的变化，很容易观察到反应的整个过程。反应的整个过程。这类测定方法简单，优点是可将多点的这类测定方法简单，优点是可将多点的测定结果连接成线，很容易找到成直线的区测定结果连接成线，很容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反应。通常截取反应开始后较短的时间，就能应。通常截取反应开始后较短的时间，就能近似地建立这种反应量与反应时间的线性关近似地建立这种反应量与反应时间的线性关系，不过这种时间范围因酶种类和反应条件系，不
9、过这种时间范围因酶种类和反应条件而异，必须用实验方法进行确定。而异，必须用实验方法进行确定。连续监测法连续监测法NAD(P)H为指示酶的双波长(340nm380nm)检测法有两种类型：如组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将干扰各种还原酶的测定。连续监测法全程用双波长读吸光度，由于NAD(P)H在次波长有吸光度，所以要用主波长的减去次波长的来计算系数K值。测定酶活性浓度方法所选择的测定条件应是酶促反应的“最适条件”，即指在所选择温度下能使酶促反应的催化活性达到最大所需的条件。化学试剂必须具有一定纯度，不含影响临床实际工作中，仪器诸多因素如波长的准确性、半波宽的大小，比色池光径及磨损
10、与清洁度，温控的准确性，加样系统状况等若不符合要求或发生变化都会影响指示物的值或上述公式中的有关项。随着产物B增加到一定程度时，Ex和 Ei反应速率相同，达到了稳态期。不同型号分析仪的设计不一样。如将ULN进一步适当分级，制定出轻度、中度及极度增加的范围，则更一目了然。如微量重金属可使酶失活，残留的表面活性剂可能抑制酶活性。不难发现，使用不同的方法、其单位、测定值和参考值均不一致，在解释来自不同方法的结果时，几乎很难看出其间确实有差异，但如果将各测定值分别转换成ULN值，则比较容易多了。另一类是目前应用最多，最为广泛的酶偶联法，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反应偶联
11、起来。示反应，相应的偶联酶(第二个酶)酶称指示001，也就是仪器保证对同一溶液反复测定时，吸光度误差控制在0.与定时法不同的是，平衡法是在酶促反应平衡期(S或P不变)任何一点进行测定，无需终止反应。随着各种自动生物化学仪和配套用试剂盒的普及应用，这一方法在临床酶学测定中起着十分重要的作用。如样品所占比例过小会降低灵敏度，样品量过大，则测定线性下降，样品要稀释后复检的机会增多。随着各种自动生物化学仪和配套用试剂盒的普及应用，这一方法在临床酶学测定中起着十分重要的作用。随着科学技术的不断进步与发展，各种自动生物化学分析仪的广泛使用，连续监测法已逐步取代定时法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方
12、法。应尽可能全部采用连续监测法，少用或不用定时法。连续监测法测定结果常较定时法高，连续监测法测定结果常较定时法高，且因在酶促反应初始阶段底物最充裕，而且因在酶促反应初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小，因而测定结果也较取样法准确。很小，因而测定结果也较取样法准确。3 3平衡法平衡法 通过测定酶促反应开始至反应达通过测定酶促反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度的总变化量到平衡时产物或底物浓度的总变化量来求出酶活性浓度的方法，称为终点来求出酶活性浓度的方法，称为终点法。与定时法不同的是，平衡法是在法。与定时法不同的是，平衡法是在酶促反
13、应平衡期酶促反应平衡期(S(S或或PP不变不变)任何任何一点进行测定，无需终止反应。目前一点进行测定，无需终止反应。目前此法已少使用。此法已少使用。三、连续监测法测定酶活性浓度三、连续监测法测定酶活性浓度 随着科学技术的不断进步与发展，各随着科学技术的不断进步与发展，各种自动生物化学分析仪的广泛使用，连种自动生物化学分析仪的广泛使用，连续监测法已逐步取代定时法而成为临床续监测法已逐步取代定时法而成为临床实验室测定酶活性浓度最常用的方法。实验室测定酶活性浓度最常用的方法。(一一)连续监测法的种类连续监测法的种类1 1直接法直接法 2.2.间接法间接法 1 1直接法直接法 这类方法是在不终止酶促反
14、应条件下，直这类方法是在不终止酶促反应条件下，直接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的变化如吸光度、荧光、旋光性、变化如吸光度、荧光、旋光性、pHpH、电导率、电导率、粘度等，从而计算出酶活性浓度。其中以分光粘度等，从而计算出酶活性浓度。其中以分光光度法应用最为广泛，也是方法学上最成熟的光度法应用最为广泛，也是方法学上最成熟的一种。一种。利用利用NAD(P)HNAD(P)H在在340nm340nm处的吸光度的变化测定各处的吸光度的变化测定各种脱氢酶的方法是应用最广的一类方法。种脱氢酶的方法是应用最广的一类方法。NAD(P)HNAD(P)H在在260nm
15、260nm波长和波长和340nm340nm波长处有吸收峰，而氧化型波长处有吸收峰，而氧化型NAD+NAD+NADP+NADP+只在只在260nm260nm波长处有吸收峰，这是因为分子波长处有吸收峰，这是因为分子中有腺嘌呤的缘故。中有腺嘌呤的缘故。340nm340nm波长处吸光度的变化可以波长处吸光度的变化可以反映反应体系中反映反应体系中NAD(P)HNAD(P)H量的增减。还可利用一类人量的增减。还可利用一类人工合成的所谓工合成的所谓“色素原色素原”底物，其本身为无色或微底物，其本身为无色或微黄色，酶作用后生成有色化合物，如目前应用硝基黄色，酶作用后生成有色化合物，如目前应用硝基苯酚和硝基苯胺
16、的衍生物进行水解酶和一些还原酶苯酚和硝基苯胺的衍生物进行水解酶和一些还原酶的测定。的测定。2.2.间接法间接法 直接法虽然简单，但只有底物与产物直接法虽然简单，但只有底物与产物之间，在理化性质等方面有显著差异时，之间，在理化性质等方面有显著差异时，才能使用直接法。故至今也只有很少一部才能使用直接法。故至今也只有很少一部分酶能用直接法进行测定。目前可采用两分酶能用直接法进行测定。目前可采用两类间接法进行酶学测定。类间接法进行酶学测定。一类方法是在原来反应体系中加入一些试剂，一类方法是在原来反应体系中加入一些试剂，这些试剂只和酶反应物迅速作用，产生可被仪器检这些试剂只和酶反应物迅速作用，产生可被仪
17、器检出的物质变化，但同时又不和酶作用也不影响酶活出的物质变化，但同时又不和酶作用也不影响酶活性。典型的例子是血清性。典型的例子是血清ChEChE的丁酰硫代胆碱测定法。的丁酰硫代胆碱测定法。另一类是目前应用最多，最为广泛的酶偶联法，另一类是目前应用最多，最为广泛的酶偶联法，即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。促反应和被测酶反应偶联起来。(二二)酶偶联反应酶偶联反应 最简单的酶偶联反应最简单的酶偶联反应(单底物反应且只单底物反应且只有一个工具酶有一个工具酶)模式为：模式为：CBAEiEx 被测定酶被测定酶(Ex)(Ex
18、)催化的反应称为始发反应；催化的反应称为始发反应；产生被检测物质产物产生被检测物质产物C(C(如如NADH)NADH)的反应称为指的反应称为指示反应，相应的偶联酶示反应，相应的偶联酶(第二个酶第二个酶)酶称指示酶称指示酶酶(Ei)(Ei)。如果一些酶促反应找不到合适的指示如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时往往还可在始发反应酶与其直接偶联，此时往往还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接起来，此反应称为辅助反应。模式为：起来，此反应称为辅助反应。模式为：DCBAEiEaEx一般习惯将最后一个酶称指示酶一般习惯将最后一个酶称指示酶
19、EiEi，其他外加，其他外加的酶称为辅助酶的酶称为辅助酶(Ea)(Ea)。个别情况还可能使用两。个别情况还可能使用两种或以上的辅助酶。将这一连串酶促反应称为种或以上的辅助酶。将这一连串酶促反应称为酶偶联体系。酶偶联体系。临床常规酶学分析所用的酶偶联法临床常规酶学分析所用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶。通过监测其中，多以脱氢酶为指示酶。通过监测其反应物反应物NADHNADH或或NADPHNADPH于于340nm340nm处吸光度的处吸光度的变化速率，可以很容易地监测指示酶反变化速率，可以很容易地监测指示酶反应。应。用酶偶联法测定酶活性浓度时，并不是一开始反应用酶偶联法测定酶活性浓度时，并不是一
20、开始反应就全部反映了测定酶活性。这是因为在偶联反应中存在就全部反映了测定酶活性。这是因为在偶联反应中存在几个时相：一是预孵育期，反应一开始只存在底物几个时相：一是预孵育期，反应一开始只存在底物 A A，不存在指示酶的反应，在此时相中使存在于样品中的干不存在指示酶的反应，在此时相中使存在于样品中的干扰物质充分进行反应，将试剂中的扰物质充分进行反应，将试剂中的NADHNADH变为变为NAD+NAD+。二。二是延滞期，加入底物启动反应，在启动后的一段短时间是延滞期，加入底物启动反应，在启动后的一段短时间内，产物内，产物 B B开始出现并逐渐增加，处于较低水平，指示开始出现并逐渐增加，处于较低水平，指
21、示酶反应速度也较低，不能代表测定酶的反应速率酶反应速度也较低，不能代表测定酶的反应速率VxVx，这，这一时期称为延滞期。随着产物一时期称为延滞期。随着产物B B增加到一定程度时，增加到一定程度时，ExEx和和 EiEi反应速率相同，达到了稳态期。此阶段反应速率相同，达到了稳态期。此阶段 340nm340nm波长处波长处吸光度才会有明显的线性变化。最后由于底物消耗，反吸光度才会有明显的线性变化。最后由于底物消耗，反应速度又复减慢。应速度又复减慢。有些酶测定要考虑到不同性别、年龄时间时，用ULN换算更能正确表达，就不致发生误判。由于酶学测定中，一般以酶增加的异常较多，故不取正常下限值作为倍数指数。
22、(一)常用工具酶及其质量要求目前利用此类反应的测定项目至少有葡萄糖、尿素、-羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、ALT、AST、LD、GLD、CK、ALD、G6PD和lCD等。(四)自动生物化学分析仪参数的设置到1976年对酶活性单位的定义为：在特定的条件下，一分钟内使底物转变一微摩尔的酶量为一个国际单位。草酸盐、枸橼酸盐和EDTA等抗凝剂为金属螯合剂，可抑制需要Ca2+的AMY，也可抑制需Mg2+的CK和5-NT；这类方法有多种命名，如“取样法”、“终点法”或“两点法”。酶促反应最适pH应与工具酶的反应最适 pH 相接两种稀释水的量应在复溶试剂时按比例扣除。2酶的污染不同型号分析仪的设计不一样。临
23、床实际工作中，仪器诸多因素如波长的准确性、半波宽的大小，比色池光径及磨损与清洁度，温控的准确性，加样系统状况等若不符合要求或发生变化都会影响指示物的值或上述公式中的有关项。五、血清酶活性浓度测定条件的优化(一)系数K值的意义与设置将这一连串酶促反应称为酶偶联体系。荧光法取决于酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比，并通过荧光光度计进行测定，根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。线性度百分数大，说明A之间已不成线性；001，也就是仪器保证对同一溶液反复测定时，吸光度误差控制在0.如样品所占比例过小会降低灵敏度，样品量过大，则测定线性下降，样品要稀释后复检的机会增多。设计或选择酶测定方法时，
24、如用酶偶联法，延设计或选择酶测定方法时，如用酶偶联法，延滞期越短越好，测定时间一定要避开此期。滞期越短越好，测定时间一定要避开此期。为了保证准确测定酶活性，酶偶联反应的反为了保证准确测定酶活性，酶偶联反应的反应速率应超过或等于测定酶的反应速率，指示酶应速率应超过或等于测定酶的反应速率，指示酶反应必须是一级反应，即指示酶反应速率应和测反应必须是一级反应，即指示酶反应速率应和测定酶的产物定酶的产物 B B浓度成正比。只有当使用大量的指浓度成正比。只有当使用大量的指示酶，以及指示酶的示酶，以及指示酶的KmKm很小时，才能做到这一点。很小时，才能做到这一点。一般说来酶偶联法中所用的指示酶一般说来酶偶联
25、法中所用的指示酶 KmKm值都很小，值都很小，酶促反应最适酶促反应最适pHpH应与工具酶的反应最适应与工具酶的反应最适 pH pH 相接相接近。当然在选用指示酶时还应从经济方面考虑选近。当然在选用指示酶时还应从经济方面考虑选用一些来源容易且价格便宜的酶制剂。用一些来源容易且价格便宜的酶制剂。(三三)干扰因素干扰因素 临床测定酶活性浓度标本都是体液，其临床测定酶活性浓度标本都是体液，其中除测定酶外，还存在着其他各种酶和其他物中除测定酶外，还存在着其他各种酶和其他物质，因此在实测反应中可能出现一些副反应或质，因此在实测反应中可能出现一些副反应或旁路反应，这些都会对测定反应产生干扰。旁路反应，这些都
26、会对测定反应产生干扰。1 1其他酶和物质的干扰其他酶和物质的干扰 反应体系各成分除可能引起测定酶反反应体系各成分除可能引起测定酶反应外，还有可能引起其他酶的反应而干扰应外，还有可能引起其他酶的反应而干扰测定。例如酶偶联法测测定。例如酶偶联法测 ALTALT时，由于反应时，由于反应体系中含有大量体系中含有大量NADHNADH和和LDLD，可与血液标本，可与血液标本中所含丙酮酸反应，引起中所含丙酮酸反应，引起 340 nm340 nm波长处波长处吸光度下降，从而引起吸光度下降，从而引起ALTALT活性测定误差。活性测定误差。2 2酶的污染酶的污染 因试剂用酶多从动物组织或细菌中提取，因试剂用酶多从
27、动物组织或细菌中提取，易污染其他酶，如不设法除去将引起测定误差。易污染其他酶，如不设法除去将引起测定误差。如组织匀浆中往往含有如组织匀浆中往往含有NADH-NADH-细胞色素细胞色素C C还原酶，还原酶，它将干扰各种还原酶的测定。使用的酶制剂它将干扰各种还原酶的测定。使用的酶制剂(如工具酶如工具酶)必须提纯。例如测必须提纯。例如测ASTAST时，被苹果时，被苹果酸脱氢酶所污染的酸脱氢酶所污染的ASTAST不应超过相对量的不应超过相对量的5x105x10-5 5(0.005(0.005)。3 3非酶反应非酶反应 有些底物不稳定，没有酶的作用就会自行反有些底物不稳定，没有酶的作用就会自行反应。例如
28、很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不应。例如很多硝基酚的酯类衍生物在水溶液中不稳定，放置一段时间可自行水解释放出硝基酚。稳定，放置一段时间可自行水解释放出硝基酚。类似情况还可见于一些内部因素如类似情况还可见于一些内部因素如pHpH变化而引起变化而引起的空白对照的变化。又如测定的空白对照的变化。又如测定ALDALD时，其底物醛时，其底物醛类化合物可以和类化合物可以和NAD+NAD+起非酶反应产生一种具有类起非酶反应产生一种具有类似似NADHNADH的吸收光谱的衍生物，给测定带来困难。的吸收光谱的衍生物，给测定带来困难。4 4分析容器的污染分析容器的污染 如分析容器或管道污染而混杂有其他一些如分析容
29、器或管道污染而混杂有其他一些物质，可能影响酶的活性。如微量重金属可使物质，可能影响酶的活性。如微量重金属可使酶失活，残留的表面活性剂可能抑制酶活性。酶失活，残留的表面活性剂可能抑制酶活性。5 5沉淀形成沉淀形成 使用分光光度法测定酶活性时，如使用分光光度法测定酶活性时，如有沉淀形成或组织匀浆中颗粒的下沉都有沉淀形成或组织匀浆中颗粒的下沉都会引起吸光度变化。常加入表面活性剂会引起吸光度变化。常加入表面活性剂以防止颗粒从匀浆中析出。有些酶反应以防止颗粒从匀浆中析出。有些酶反应需镁离子作为辅因子，如反应液中含有需镁离子作为辅因子，如反应液中含有多余磷酸根时将有沉淀出现。多余磷酸根时将有沉淀出现。解决
30、上述干扰问题的方法之一可通过试剂解决上述干扰问题的方法之一可通过试剂空白管检出并加以校正。即有时不仅要作标本空白管检出并加以校正。即有时不仅要作标本对照管，还要作试剂空白管。另一个有效途径对照管，还要作试剂空白管。另一个有效途径就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。就是不用单一试剂而改用双试剂测定酶活性。四、工四、工 具具 酶酶 通常把酶学分析中作为试剂用于测通常把酶学分析中作为试剂用于测定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为定化合物浓度或酶活性浓度的酶称为工工具酶具酶。常使用酶偶联体系进行测定，指。常使用酶偶联体系进行测定，指示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。示酶和辅助酶作为反应系统中的试剂。D
31、CBAEiEaEx(一一)常用工具酶及其质量要求常用工具酶及其质量要求 常用工具酶多为氧化还原酶类，这是因为常用工具酶多为氧化还原酶类，这是因为其产物最易被直接监测而成为指示酶。在一系其产物最易被直接监测而成为指示酶。在一系列利用工具酶的反应中，主要限速因子应该是列利用工具酶的反应中，主要限速因子应该是待测化合物和待测酶，工具酶和其辅助底物应待测化合物和待测酶，工具酶和其辅助底物应过量。过量。DCBAEiEaEx (二二)工具酶参与的指示反应工具酶参与的指示反应 近年来，在临床生物化学检验中，许多项近年来，在临床生物化学检验中，许多项目的测定往往使用有工具酶的参与的类似的反目的测定往往使用有工
32、具酶的参与的类似的反应原理，即所谓共通应原理，即所谓共通(或通用或通用)反应途径。反应途径。最常用的有两类分光光度法：最常用的有两类分光光度法：一类是利用较高特异性的氧化酶产生过氧一类是利用较高特异性的氧化酶产生过氧化氢化氢(H(H2 2O O2 2)，再加氧化发色剂比色；，再加氧化发色剂比色；一类是利用氧化一类是利用氧化-还原酶反应使其连接到还原酶反应使其连接到NAD(P)NAD(P)HNAD(P)NAD(P)H的正逆反应后，直接通过分的正逆反应后，直接通过分光光度法或其他方法测定光光度法或其他方法测定NAD(P)HNAD(P)H的变化量。的变化量。个别酶如LD及其同工酶(LD4和LD5)在
33、低温反而不如室温稳定，即所谓“冷变性”。与定时法不同的是，这类方法勿需停止酶促反应，不需添加其他呈色试剂，就可测定反应物的变化，很容易观察到反应的整个过程。线性度百分数大，说明A之间已不成线性；随着产物B增加到一定程度时，Ex和 Ei反应速率相同，达到了稳态期。1其他酶和物质的干扰草酸盐、枸橼酸盐和EDTA等抗凝剂为金属螯合剂，可抑制需要Ca2+的AMY，也可抑制需Mg2+的CK和5-NT；许多氧化还原反应，尤其是作为工具酶的脱氢酶如LD、GLD、G6PD等参与时，常将底物的氢原子去除后传递给NAD(P)+而形成NAD(P)H。摩尔消光系数()的定义为：在特定条件下，一定波长的光，光径为1.随
34、着产物B增加到一定程度时，Ex和 Ei反应速率相同，达到了稳态期。例如，还原型的NAD(P)H有强烈的荧光，故所有以NAD(P)+为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法进行测定。因NAD(P)H在340nm有特征性光吸收，可借此用分光光度法进行检测。如样品所占比例过小会降低灵敏度，样品量过大，则测定线性下降，样品要稀释后复检的机会增多。血清蛋白对酶蛋白有稳定作用，如无细菌污染，某些酶(如 AST、-GT和ALP等)存在于清蛋白中，可在室温保存l3天，而活性不受影响。7延迟时间这些物质的定值可溯源到各自的参考方法或推荐方法，能用于校正一个或多个常规方法。可根据所测定的酶所用方法的不同，利用标准管法、标
35、准曲线法或摩尔消光系数法进行计算求取酶活性浓度单位。典型的例子是血清ChE的丁酰硫代胆碱测定法。有些底物不稳定，没有酶的作用就会自行反应。如红细胞内的LD、AST和ALT活性分别较血清超过限额说明样品的酶活性非常高，底物将要耗尽，随后监测的吸光度已不可靠，不打印结果而只打印出底物耗尽警号，样品应稀释510倍重测。1 1偶联偶联H H2 20 02 2的工具酶及其指示反应的工具酶及其指示反应 临床化学测定中，可利用葡萄糖氧化酶、尿酸临床化学测定中，可利用葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶等工具酶分别用于葡萄糖、尿酸的测定，氧化酶等工具酶分别用于葡萄糖、尿酸的测定，可使相应底物被氧化生成可使相应底物被氧化生
36、成H H2 20 02 2。H H2 20 02 2主要通过以氢主要通过以氢(或电子或电子)为受体的指示酶和以为受体的指示酶和以NAD(P)HNAD(P)H为辅酶参与为辅酶参与的两类指示反应进行检测。前者主要有两类工具的两类指示反应进行检测。前者主要有两类工具酶参与反应：过氧化氢酶或称触酶酶参与反应：过氧化氢酶或称触酶(catalase)(catalase)及及过氧化物酶过氧化物酶(peroxidase,POD)(peroxidase,POD)，两者均为含三价，两者均为含三价铁的指示酶。以指示酶铁的指示酶。以指示酶PODPOD最为常用，主要催化以最为常用，主要催化以下两种反应。下两种反应。一种
37、是在一种是在PODPOD的直接催化下，的直接催化下，H H2 20 02 2氧化芳氧化芳香族胺色素原生成有色的色素，此类色素原香族胺色素原生成有色的色素，此类色素原供氢体有邻联甲苯胺供氢体有邻联甲苯胺(OT)(OT)、联苯胺、联苯胺(DAB)(DAB)、邻、邻联茴香胺联茴香胺(ODA)(ODA)和和3 3，33，5 5，5-5-四甲基联四甲基联苯胺苯胺(TMB)(TMB)。其中只有。其中只有TMBTMB无致癌性，且其生无致癌性，且其生色的灵敏度最高。色的灵敏度最高。2 2NAD(P)+NAD(P)+或或NAD(P)HNAD(P)H偶联的偶联的 脱氢酶及其指示反应脱氢酶及其指示反应 许多氧化还原
38、反应，尤其是作为工具酶的脱许多氧化还原反应，尤其是作为工具酶的脱氢酶如氢酶如LDLD、GLDGLD、G6PDG6PD等参与时，常将底物的氢原等参与时，常将底物的氢原子去除后传递给子去除后传递给NAD(P)+NAD(P)+而形成而形成NAD(P)HNAD(P)H。LDLD主要主要以以NAD+NAD+NADHNADH为辅酶，而为辅酶，而GLDGLD则不论来自肝或细菌，则不论来自肝或细菌，均可以均可以NAD+NAD+NADP+NADP+或其还原型为辅酶。因或其还原型为辅酶。因NAD(P)HNAD(P)H在在340nm340nm有特征性光吸收，可借此用分光有特征性光吸收，可借此用分光光度法进行检测。目
39、前利用此类反应的测定项目光度法进行检测。目前利用此类反应的测定项目至少有葡萄糖、尿素、至少有葡萄糖、尿素、-羟丁酸、甘油三酯、甲羟丁酸、甘油三酯、甲醇、血氨、醇、血氨、ALTALT、ASTAST、LDLD、GLDGLD、CKCK、ALDALD、G6PDG6PD和和lCDlCD等。等。为了简化操作过程，并使酶试剂得以方便或反为了简化操作过程，并使酶试剂得以方便或反复使用，已有许多研究将水溶性的酶通过吸附、包复使用，已有许多研究将水溶性的酶通过吸附、包埋、载体共价结合或通过酶分子间共价交联等方法埋、载体共价结合或通过酶分子间共价交联等方法固定在支持物上，并保持其原有的活性，这样制备固定在支持物上，
40、并保持其原有的活性，这样制备的酶称为固相酶的酶称为固相酶(或固定酶或固定酶)(immobilized enzyme)(immobilized enzyme)。近些年来，固相酶技术发展迅速，特别是固相酶膜近些年来，固相酶技术发展迅速，特别是固相酶膜的应用使临床生物化学检验进入了干化学的时代，的应用使临床生物化学检验进入了干化学的时代，一些测定变得更加方便、快速。酶电极、酶探针等一些测定变得更加方便、快速。酶电极、酶探针等也在不断研制开发中，相信此类技术将成为临床生也在不断研制开发中，相信此类技术将成为临床生物化学发展的一个新方向物化学发展的一个新方向。五、血清酶活性浓度测定条件的优化五、血清酶活
41、性浓度测定条件的优化 测定酶活性浓度方法所选择的测定条件测定酶活性浓度方法所选择的测定条件应是酶促反应的应是酶促反应的“最适条件最适条件”，即指在所选，即指在所选择温度下能使酶促反应的催化活性达到最大择温度下能使酶促反应的催化活性达到最大所需的条件。所需的条件。最适条件主要与下述一些因素有关：最适条件主要与下述一些因素有关：(1)(1)底物、辅因子、激活剂、缓冲液和变构剂种底物、辅因子、激活剂、缓冲液和变构剂种类和浓度；类和浓度；(2)(2)指示酶和辅助酶的种类和浓度；指示酶和辅助酶的种类和浓度；(3)(3)反应混合液的反应混合液的pHpH和离子强度；和离子强度；(4)(4)其他可变因素，如已
42、知抑制剂的去除。其他可变因素，如已知抑制剂的去除。在某些情况下，为了使最终测定系统达到最大在某些情况下，为了使最终测定系统达到最大的测定重复性，可考虑对最适条件进行适当修改。的测定重复性，可考虑对最适条件进行适当修改。(一一)方法选择方法选择 应尽可能全部采用连续监测法，少用应尽可能全部采用连续监测法，少用或不用定时法。尽量减少操作步骤，以避或不用定时法。尽量减少操作步骤，以避免过多的吸量和接触太多的容器表面而引免过多的吸量和接触太多的容器表面而引起的误差。起的误差。(二二)仪器和设备仪器和设备 应明确规定仪器和设备的各种性能规范，应明确规定仪器和设备的各种性能规范，推荐使用性能符合要求或经检
43、定合格的分光推荐使用性能符合要求或经检定合格的分光光度计、半自动或全自动生物化学分析仪及光度计、半自动或全自动生物化学分析仪及其他相应的配套设备。任何接触标本、试剂其他相应的配套设备。任何接触标本、试剂或反应混合物的表面都必须经化学清洗，去或反应混合物的表面都必须经化学清洗，去除干扰酶活性测定的一些物质，如极少量的除干扰酶活性测定的一些物质，如极少量的酸、金属、去垢剂或其他复合物等。酸、金属、去垢剂或其他复合物等。(三三)试剂试剂 化学试剂必须具有一定纯度，不含影响化学试剂必须具有一定纯度，不含影响反应速度的杂质。反应速度的杂质。试验用水最好是纯水或双试验用水最好是纯水或双蒸水蒸水。如果水中存
44、在酶的抑制剂，其浓度应。如果水中存在酶的抑制剂，其浓度应低于最小抑制浓度。低于最小抑制浓度。如所配制试剂需保存较如所配制试剂需保存较长时间，则应使用无菌水长时间，则应使用无菌水。选用符合临床实。选用符合临床实验室要求的试剂，建议用液体双试剂。验室要求的试剂，建议用液体双试剂。有些底物不稳定，没有酶的作用就会自行反应。八、临床酶学测定的标准化001，也就是仪器保证对同一溶液反复测定时，吸光度误差控制在0.荧光法取决于酶促反应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比，并通过荧光光度计进行测定，根据荧光强弱的变化换算出酶的活性。线性度百分数大，说明A之间已不成线性；以原有的30的参考方法作为基础，制
45、定了一套37的标准操作方法(SOPs)。酶与底物混合后需要一定的时间让酶被激活，直至线性反应期才能开始监测，有的项目需要用工具酶将内源性代谢产物耗尽。12试剂空白速率酶与底物混合后需要一定的时间让酶被激活，直至线性反应期才能开始监测，有的项目需要用工具酶将内源性代谢产物耗尽。001微小变化，根据上式，结果将出现8UL左右的误差，这对于一些参考值较低的酶如转氨酶来说显然太大。按试剂质量而设置，超过范围应增加样品量IFCC于2002年发表了关于酶催化浓度的原级参考方法总则及CK、LD、ALT、AST和-GT的SOPs。340nm干涉滤光片的NAD(P)H的可用葡萄糖的己糖激酶法实测，即对已知浓度的
46、葡萄糖标准品进行终点法测定，产生与葡萄糖相等摩尔数的NAD(P)H，计算其实测的，再计算实测K值。示反应，相应的偶联酶(第二个酶)酶称指示酶测定中最理想的校正方法是用稳定的定值准确的酶校正物或酶参考物对测定全过程进行校正。3Katal单位因此，应在具体仪器条件下，定期检查和实际测定指示物的和系数K值(即仪器实测K值)。终点法可配制系列浓度的标准液，按分析项目的波长、样品量与试剂量、孵育时间，测定各浓度的吸光度，绘制标准曲线，在线性内的最高浓度为线性上限。用连续监测法进行酶活性测定时，不需作标准管或标准曲线，根据摩尔消光系数很容易进行酶活性浓度的计算。此阶段 340nm波长处吸光度才会有明显的线
47、性变化。因此，应根据实际情况进行合理的设置与应用。1参考测定方法(四四)自动生物化学分析仪参数的设置自动生物化学分析仪参数的设置 方法中应详细列出测定酶催化浓度的全部方法中应详细列出测定酶催化浓度的全部操作过程。可参考仪器及试剂给出的方法和参操作过程。可参考仪器及试剂给出的方法和参数进行设置。数进行设置。1 1方法类型方法类型 定时法或连续监测法。反应方向分正向向定时法或连续监测法。反应方向分正向向上上+(+(吸光度增加吸光度增加)或负向向下或负向向下/-(/-(吸光度减吸光度减低低)。如。如ALTALT、ASTAST测定选用负向反应。测定选用负向反应。2 2波长波长 选择酶促反应体系吸光度最
48、大的选择酶促反应体系吸光度最大的波长，如用双波长应写明主波长次波长，如用双波长应写明主波长次波长。因双波长能有效消除干扰的影波长。因双波长能有效消除干扰的影响，故常被采用。响，故常被采用。3 3样品量与试剂量样品量与试剂量 应考虑测定的灵敏度和测定上限选用合应考虑测定的灵敏度和测定上限选用合适的样品与试剂体积比。适的样品与试剂体积比。一般推荐样品与试剂一般推荐样品与试剂体积比为体积比为1 1：1010。如样品所占比例过小会降低。如样品所占比例过小会降低灵敏度，样品量过大，则测定线性下降，样品灵敏度，样品量过大，则测定线性下降，样品要稀释后复检的机会增多。要稀释后复检的机会增多。4 4稀释水量稀
49、释水量 添加添加样品稀释水样品稀释水的目的是为了洗出粘附在采样的目的是为了洗出粘附在采样针内壁上的微量血清，减少加样误差。针内壁上的微量血清，减少加样误差。添加试剂稀添加试剂稀释水释水是为了避免试剂间的交叉污染。两种稀释水的是为了避免试剂间的交叉污染。两种稀释水的量应在复溶试剂时按比例扣除。如用液体试剂盒时量应在复溶试剂时按比例扣除。如用液体试剂盒时因不再加水，无法扣除稀释水量，所以两种稀释水因不再加水，无法扣除稀释水量，所以两种稀释水的量应尽量减少，以免试剂被过量稀释。的量应尽量减少，以免试剂被过量稀释。5 5反应时间反应时间 观察反应进程曲线测出预孵育时间、观察反应进程曲线测出预孵育时间、
50、延迟时间及连续监测时间，求出反应线性延迟时间及连续监测时间，求出反应线性时间范围。线性反应时间范围越宽者，越时间范围。线性反应时间范围越宽者，越适用于临床应用。适用于临床应用。6 6孵育时间孵育时间 葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等都采葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等都采用酶法的用酶法的TrinderTrinder反应进行测定，但反应进行测定，但3737酶反应较慢，必须测定这些酶试剂反应达酶反应较慢，必须测定这些酶试剂反应达到终点的时间。自动分析仪用试剂盒一般到终点的时间。自动分析仪用试剂盒一般可以在全部加样后可以在全部加样后5min5min内反应完全，所以内反应完全，所以应选择分析仪的最大反应时间。
