1、透射电镜的原理和应用基础医学院电镜室 张志刚透射电镜系统透射电镜系统光有波动性,碰到物体会发生衍射.光学透镜由玻璃制成,通过不同外形角度,使光线折射,形成不同长短的聚焦像点波长越短,分辨率越高电子在通过电场和磁场时,受到洛仑兹力的作用,轨迹也发生弯曲,(折射)电子透镜一般分为静电透镜和磁透镜 电子在通过电场和磁场时,受到洛仑兹力的作用,轨迹也发生弯曲,(折射)电子透镜一般分为静电透镜和磁透镜（如图）在这种静电场中，前一半是电透镜，通过电透镜电子轨迹已向轴心折射。，在通过后半个磁透镜（对称磁场）加速之后，形成的电子轨迹具有会聚的特性。螺管线圈 螺管线圈 螺管线圈 照明系统组成：由电子枪、聚光镜（
2、1、2级）和相应的平移对中、倾斜调节装置组成。作用：提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度高、束斑小、束流稳定的照明源。为满足明场和暗场成像需要，照明束可在20-30范围内倾斜。电子枪电子枪是电镜的电子源。其作用是发射并加速电子，并会聚成交叉点。目前电子显微镜使用的电子源有两类：热电子源加热时产生电子，W丝，LaB6场发射源在强电场作用下产生电子，场发射电镜FE热阴极电子源电子枪的结构如图2-2所示，形成自偏压回路，栅极和阴极之间存在数百伏的电位差。电子束在栅极和阳极间会聚为尺寸为d0的交叉点，通常为几十um。栅极的作用：限制和稳定电流。(1)特点 物镜是一块强磁透镜，焦距很短，对材料的质地纯度
3、、加工精度、使用中污染的状况等工作条件都要求极高。致力于提高一台电镜的分辨率指标的核心问题,便是对物镜的性能设计和工艺制作的综合考核。尽可能地使之焦距短、像差小，又希望其空间大，便于样品操作，但这中间存在着不少相互矛盾的环节。(2)作用 进行初步成像放大，改变物镜的工作电流，可以起到调节焦距的作用。电镜操作面板上粗、细调焦旋扭，即为改变物镜工作电流之用。为满足物镜的前述要求，不仅要将样品台设计在物镜内部，以缩短物镜焦距；还要配置良好的冷却水管，以降低物镜电流的热飘移；此外，还装有提高成像反差的可调活动光阑，及其要达到高分辨率的消像散器。对于高性能的电子显微镜，都通过物镜装有以液氮为媒质的防污染
4、冷阱，给样品降温。1.观察室 透射电镜的最终成像结果，显现在观察室内的荧光屏上，观察室处于投影镜下，空间较大，开有13个铅玻璃窗，可供操作者从外部观察分析用。对铅玻璃的要求是既有良好的透光特性，又能阻断X线散射和其他有害射线的逸出，还要能可靠地耐受极高的压力差以隔离真空。成像原理 透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所產生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率為0.10.2nm，放大倍数為几万几十万倍。由於电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常為50
5、100nm）。其制备过程与石蜡切片相似，但要求极严格。组织要在机体死亡后的数分钟钓取材，组织块要小(1立方毫米以内），常用戊二醛和饿酸进行双重固定树脂包埋,切成超薄切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色。称电子密度高。称电子密度高。反之，则称為电子密度低 透射电镜样品制备流程透射电镜样品制备流程 由于透射电镜能观察的样品必须很薄由于透射电镜能观察的样品必须很薄（6070nm），），所以透射电镜的样品准备要求所以透射电镜的样品
6、准备要求很很严格严格，方法也很单一，仅有一下两种方法：，方法也很单一，仅有一下两种方法：一负染色技术一负染色技术 负染色负染色技术简单快速，技术简单快速，可以可以显示生物大分子显示生物大分子、细菌、分离的、细菌、分离的细胞器以及细胞器以及蛋白晶体蛋白晶体等等样品样品的形态、结构、的形态、结构、大小以及大小以及表面结构的特征。尤其表面结构的特征。尤其在病毒学中在病毒学中，负染色技术有着，负染色技术有着广泛的广泛的应用。应用。样品要求：样品要求：样品悬液的纯度不要求很纯样品悬液的纯度不要求很纯，但是如果杂质，但是如果杂质太太多，如多，如大量大量的细胞碎片，培养基的细胞碎片，培养基残残渣渣，糖类，糖
7、类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。观察。尤其是尤其是不能不能有过多的糖类有过多的糖类，因为，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要此样品要适当提纯。样品适当提纯。样品悬液的浓度要适中悬液的浓度要适中，太，太稀在电镜下很难找到稀在电镜下很难找到样品，太样品，太浓浓样品堆积影响观察样品堆积影响观察。操作流程：操作流程：吸取样品吸取样品悬悬液滴液滴到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余到有膜的铜网上，静置数分钟，然后用滤纸吸去多余的的液体液体，滴上负染色液，滴上负染
8、色液，染色染色12min后后滤纸吸去负染色液滤纸吸去负染色液，待，待干后用于电镜观察。干后用于电镜观察。二、超薄切片技术二、超薄切片技术 超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中超薄切片技术是为透射电镜观察提供薄样品的专门技术，是生物学中研究细胞研究细胞超微超微 结构最结构最常用的技术常用的技术。广泛。广泛应用于生物体的各种细胞的超微结构观察应用于生物体的各种细胞的超微结构观察。一般厚度在。一般厚度在10100nm的的切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。超薄切片切片称为超薄切片，制作这种切片的技术叫做超薄切片技术。超薄切片制作制作的过程包括取材的过程包括取
9、材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、切片和染色等几个环节，和一般，和一般光学显微镜光学显微镜的石蜡切片过程相似。但是的石蜡切片过程相似。但是，超薄切片，超薄切片切片过程更为细致与复切片过程更为细致与复杂，要求更严格杂，要求更严格，而且，而且所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌所用的试剂比较昂贵、配制复杂、强致癌。具体。具体操作步骤、操作步骤、注意事项如下：注意事项如下：1取材取材和前固定：快速的切取大小和前固定：快速的切取大小为为0.51.0mm3的样品块，的样品块，一分钟内把组一分钟内把组织（样品）织（样品）块块浸入浸入2.5戊戊二醛（进口品
10、质二醛（进口品质）溶液）溶液（取样前来平台领取（取样前来平台领取），），每个离心管内装每个离心管内装20个以上的个以上的样品块，作为一个样送到样品块，作为一个样送到平台。平台。要求要求：取材前一定：取材前一定要和要和工作人员取得工作人员取得电话联系！电话联系！取材取材选择部位选择部位要准确要准确可靠，可靠，确保确保每块材料都是要观察的每块材料都是要观察的部位。部位。所有植物样品所有植物样品一定要抽真空，能够沉底的样品一定要抽真空，能够沉底的样品也抽也抽真空真空15mins，不能沉底的样品一定要抽不能沉底的样品一定要抽真空真空致致沉底！沉底！细菌、散在细胞等细菌、散在细胞等不能成块的样品，加戊二
11、醛固定液不能成块的样品，加戊二醛固定液，离心，离心沉淀沉淀后送到平台，后送到平台，由平台工作人员处由平台工作人员处理。泡在前固定液的理。泡在前固定液的材料最多材料最多可以可以放放2周。周。2漂洗漂洗：用用1MPBSBufferPh7.2冲洗冲洗3次次，每次每次15mins。3后后固定：固定：加入加入1锇酸处理锇酸处理到样品到样品变变黑。植物黑。植物样品一般样品一般处理处理2.5hours，真菌、真菌、细菌细菌一般处理一般处理2hours，动物样品动物样品处理处理1hours。注意事项：注意事项：锇锇酸剧毒酸剧毒物质，物质，易挥发，易挥发，操作操作时要在毒品柜中谨慎使用。锇酸比较昂贵，需特别节约
12、使用时要在毒品柜中谨慎使用。锇酸比较昂贵，需特别节约使用。4漂洗：用漂洗：用1MPBSBufferPh7.2冲洗冲洗3次次，每次每次15mins。5脱水脱水：室温下，：室温下，丙酮丙酮050708090每每级级作用作用30mins，纯丙酮在作纯丙酮在作 用用3次，次，每次每次作用作用30mins。6渗透渗透：其目的是使包埋剂逐步渗入组织细胞内：其目的是使包埋剂逐步渗入组织细胞内。植物。植物样品需要的渗透梯度多、样品需要的渗透梯度多、渗渗透时间长。透时间长。其他样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。以其他样品可以适当减少或缩短渗透梯度和时间。以二叶龄水稻二叶龄水稻叶片为叶片为例例，其，其渗透流程
13、如下：无水渗透流程如下：无水丙酮丙酮/包埋剂包埋剂5：1作用作用12hours无水无水丙酮丙酮/包埋剂包埋剂3：1作用作用12hours无水无水丙酮丙酮/包埋剂包埋剂1：1作用作用12hours无水无水丙酮丙酮/包埋剂包埋剂1：3作用作用12hours无水无水丙酮丙酮/包埋剂包埋剂1：5作用作用12hours纯包埋剂纯包埋剂作用作用45作用作用12hours。注意注意事项事项：包埋剂：包埋剂为强为强致癌剂，致癌剂，特别要注意规范操作！特别要注意规范操作！7包埋包埋：用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中：用牙签将渗透好的样品挑到包埋板中，45聚合聚合12hours，60聚合聚合36 48hours。
14、8超薄切片：超薄切片：超薄切片的切片超薄切片的切片面积最大不能面积最大不能超过超过0.5mm0.3mm，比较难切比较难切的植物的植物样样 品要求切片面积更品要求切片面积更小。小。超薄切片是在超薄切片机上进行，但是切出比较理想的超薄切片是在超薄切片机上进行，但是切出比较理想的超超薄切片薄切片，却是一件不容易的工作，却是一件不容易的工作。做好。做好需要有渗透、包埋好的包埋块，还要有好需要有渗透、包埋好的包埋块，还要有好的的切刀切刀以及操作者的熟练技术以及操作者的熟练技术等。等。超薄切片前期超薄切片前期需要准备需要准备载网和支持膜、修块、载网和支持膜、修块、制刀制刀等，等，前期准备工作前期准备工作至
15、少需要至少需要半天半天时间。时间。超薄切片是极其精细超薄切片是极其精细、耗费、耗费眼力的眼力的工作，工作，需要需要静下静下心来慢慢操作心来慢慢操作，切切好一个样品好一个样品至少至少需要需要1小时。小时。9正染色正染色：由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。这些元素原子对电子：由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。这些元素原子对电子 的散射的散射能力很弱，相互之间的差别也很能力很弱，相互之间的差别也很小。小。尤其生物超薄切片被树脂所包埋，这些尤其生物超薄切片被树脂所包埋，这些包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。因此生物因此生物样
16、品超薄切片观察时像样品超薄切片观察时像的反差极的反差极弱。弱。为了提高图像的反差，要对超薄切片进行电子染色。为了提高图像的反差，要对超薄切片进行电子染色。这里所谓这里所谓电子染色电子染色是根本不同于光学显微镜的是根本不同于光学显微镜的染色，染色，它是利用重金属盐（如铅盐、铀它是利用重金属盐（如铅盐、铀盐等）与盐等）与细胞的细胞的某些成分或结构结合，某些成分或结构结合，由于重金属由于重金属对电子散射能力很强，使那些与其对电子散射能力很强，使那些与其结合的结合的结构或结构或成份对电子散射能力成份对电子散射能力增强，增强，从而达到提高样品本身反差的。目前最常用从而达到提高样品本身反差的。目前最常用的
17、的染色剂是醋酸染色剂是醋酸铀和柠檬酸铅染色铀和柠檬酸铅染色液。液。操作流程是：操作流程是：超薄切片先柠檬酸铅超薄切片先柠檬酸铅染色染色10分钟分钟，去，去二氧化碳二氧化碳的双蒸水的双蒸水清洗清洗3次次，再用醋酸铀，再用醋酸铀染色染色30分分钟钟，双蒸水，双蒸水清洗清洗3次，次，等等超薄切片干燥超薄切片干燥后，即可上透射电镜观察。注意事项：后，即可上透射电镜观察。注意事项：醋酸醋酸铀铀具有具有放射性，放射性，使用时要特别使用时要特别注意注意。柠檬酸铅。柠檬酸铅染液极染液极易和空气中的二氧化碳反应形成易和空气中的二氧化碳反应形成不溶解的黑色颗粒，污染不溶解的黑色颗粒，污染切片。切片。柠檬酸铅染液一
18、定柠檬酸铅染液一定要现要现用用相配，相配，所用的双蒸水一定要所用的双蒸水一定要煮沸除去二氧化碳。煮沸除去二氧化碳。由于由于染色不可控制因素较多，产生污染的几率染色不可控制因素较多，产生污染的几率有有40，所以每所以每个样品的切片一定要个样品的切片一定要留出留出铜网作备份。铜网作备份。电镜应用举例正常细胞凋亡细胞正常线粒体水肿线粒体细胞自噬 嗜铬细胞瘤-分泌颗粒乙肝乙肝病毒病毒肾小球EpMCRBCMMMCEnEn肾小管肾小管近端小管近端小管近端小管近端小管远端小管远端小管神经纤维束神经纤维束胶原纤维胶原纤维病例 患者男性,16岁,因反复发作的泡沫尿2年余,近来加重3个月入院.体检一般状态尚好,脸面轻度浮肿,心肺检查正常尿检查:蛋白尿 3+,红细胞31,其他肾功能正常肾穿刺组织光镜：4个肾小球，肾小球少数节段系膜细胞轻度增生伴基质轻度增多，个别节段与球囊壁粘连；肾小管少量有蛋白管型或细胞管型，部分小管再生；间质少量炎症细胞散在浸润，伴纤维组织轻度增生（5%）；肾血管未见明显病变。印象：肾小球轻微病变（小球太少，待电镜进一步证实）诊断诊断:肾脏肾脏Fabry 病病 是一种遗传性疾病,溶酶体a-半乳糖苷酶A缺乏.讲课结束，谢谢。下周三晚上透射电镜实习透射电镜实习在西7号楼底楼120室派出所对面小门分三组1)18:302)19:003)19:30
