1、肿瘤的诊断进展南京医科大学第一附属医院肿瘤科 殷咏梅 传统的肿瘤诊断的主要方法和流程传统的肿瘤诊断的主要方法和流程从临床症状体征中入手影像学和实验室检查等为病理检查做准备明确肿瘤的扩散范围（分期）病理学检查以求确诊明确细胞性质、分化的程度（分级）评估肿瘤情况以及对日常活动的影响：体力状况评分（PS）近年来肿瘤诊断方法的进展近年来肿瘤诊断方法的进展对肿瘤更深层次本质的诊断：肿瘤的分子病理诊断以及基因诊断诊断方法的改进：PET-CT、循环肿瘤细胞检测、基因深度测序等等肿瘤的常见症状肿瘤的常见症状早期可无症状肿块疼痛（胸痛、腹痛、肢体疼痛.）出血（黑便、咯血、血尿、不规则阴道流血.）功能受限（气促、
2、便秘、腹泻.）全身症状（发热、消瘦、疲乏）副癌综合症症状缺乏特异性，难以和良性疾病区分，需要结合其他检查以进一步诊断影像学检查影像学检查X线B超CT(Computerized tomography)MRI(Magnetic resonance imaging 磁共振)ECT PET其他肺癌肺癌胸片胸片肺癌肺癌MRI肺癌肺癌骨骼同位素骨骼同位素检查检查乳腺癌乳腺癌钼靶摄片钼靶摄片乳腺癌乳腺癌B超超乳腺癌乳腺癌肝转移（肝转移（CT）PET-CT实验室检查实验室检查三大常规（一般检查）生化指标（一般检查）肿瘤标志物（早期诊断、治疗随访等）T细胞亚群测定（机体免疫状态）其他肿瘤标志物肿瘤标志物 由肿瘤
3、组织和细胞产生的与肿瘤的形成、发生相关的物质,这些物质存在于肿瘤细胞的胞核、胞质、胞膜上或体液中；不存在于正常成人组织而见于胚胎组织,或在肿瘤组织中含量超过正常含量。肿瘤细胞特异或相关抗原肿瘤相关酶含量肿瘤相关激素水平及其受体细胞刺激因子癌胚基因产物、癌基因及其癌基因蛋白、抗癌基因等肿瘤标志物种类肿瘤标志物种类肿瘤的筛选肿瘤的早期诊断肿瘤治疗后随访、疗效监测肿瘤复发的监测、预后判断利用肿瘤细胞表面标志选择性进行单克隆抗体治疗其他肿瘤标志物意义肿瘤标志物意义常见肿瘤标志物与肿瘤常见肿瘤标志物与肿瘤 肿瘤标志物联合应用肿瘤标志物联合应用 单一标志物的检测灵敏度及特异性尚难满足临床对早期诊断、疗效及
4、预后评估的要求，故多采用联合检测的方法 肿瘤 首选标志物 补充标志物 肺癌 CEA、NSE、CYFRA21-1 TPA、SCC、ACTH、降钙素、TSA肝癌 AFP AFU、GT、CEA、ALP乳腺癌 CA15-3、CEA CA549、hCG、降钙素、铁蛋白 胃癌 CA72-4 CEA、CA19-9、CA242前列腺癌 PSA、f-PSA PAP结肠直肠癌 CEA CA19-9、CA50 胰腺癌 CA19-9 CA50、CEA、CA125 卵巢癌 CA125 CEA、hCG、CA19-9 睾丸肿瘤 AFP、hCG宫颈癌 SCC CA125、CEA、TPA 膀胱癌 无 TPA、CEA 骨髓瘤 本
5、-周蛋白、2-M 常用肿瘤标志物联合检测的临床应用常用肿瘤标志物联合检测的临床应用病理学检查病理学检查（确诊的金标准）v标本来源：涂片、针吸活检等细胞学检查组织活检（包括切割穿刺针、各种内窥镜活检钳夹取等）手术切除组织块（诊断级别最高）（诊断级别最高）乳腺癌乳腺癌Fine-needle aspiration biopsyCT引导下经皮肺穿刺引导下经皮肺穿刺肺癌肺癌纤支镜检查纤支镜检查胃癌胃癌胃镜检查胃镜检查超声内镜检查超声内镜检查手术切除标本手术切除标本全面的肿瘤诊断描述全面的肿瘤诊断描述分期：描述肿瘤侵犯程度分期：描述肿瘤侵犯程度国际抗癌联盟（国际抗癌联盟（UICC）TNM分期：分期：根据原
6、发肿瘤的大小及范围（根据原发肿瘤的大小及范围（T,tumor）局部淋巴结（局部淋巴结（N,lymph node）受累情况）受累情况 肿瘤转移情况（肿瘤转移情况（M,metastasis）分化：肿瘤细胞与正常细胞的差异程度分化：肿瘤细胞与正常细胞的差异程度通常分为高、中、低分化通常分为高、中、低分化分化越高，即肿瘤组织越接近正常组织分化越高，即肿瘤组织越接近正常组织分化越低预后常常越差分化越低预后常常越差肿瘤诊断之肿瘤诊断之TNM TNM 分期分期 0 正常活动正常活动 100 能正常活动，无不适及症状能正常活动，无不适及症状 90 可正常可正常活动，有轻微症状活动，有轻微症状1 有症状，活动轻
7、微受限有症状，活动轻微受限 80 可正常活动，可正常活动，有一些症状与体征有一些症状与体征 70 能自理，但不能工作及进行正常活动能自理，但不能工作及进行正常活动2 能自理但不能工作能自理但不能工作 50%60 能自理，偶尔需要帮助能自理，偶尔需要帮助 50 需要一定的帮助和经常性的治疗需要一定的帮助和经常性的治疗3 部分自理，清醒卧床时间部分自理，清醒卧床时间 50%40 需要特殊照顾需要特殊照顾 30 不能自理，需要住院不能自理，需要住院4 不能自理，完全卧床不能自理，完全卧床 20 必须住院，需要积极治疗必须住院，需要积极治疗10 濒死濒死5 死亡死亡0 死亡死亡有重要的判断预后的价值肿
8、瘤诊断之肿瘤诊断之PS评分评分传统的肿瘤诊断包括：传统的肿瘤诊断包括：肿瘤部位病理类型，分期，分化临床分期病人体力状况肿瘤的分子诊断肿瘤从本质上来讲是基因出现了问题，本质上是一种基因病同一种肿瘤其驱动基因可能完全不同，对治疗的反应，肿瘤的发展以及预后可能完全不同不同的肿瘤其驱动基因可能相同，对相同的针对性治疗方案反应相似因此，针对肿瘤的分子诊断愈发重要肿瘤临床分子诊断技术的应用进展样本样本内容内容与遗传有关的基因突变检测技术检测技术PCR基因测序蛋白芯片基因测序免疫化学血液肿瘤组织血浆DNA变化血浆中癌基因表达检测肿瘤标志物的检测肿瘤细胞的基因突变肿瘤细胞的基因表达肿瘤细胞的蛋白表达PCR诊断
9、预后评估判定治疗效果临床应用临床应用乳腺癌基因检测的意义乳腺癌基因检测的意义BRCA1:1990年研究者发现一种直接与遗传性乳腺癌有关的基因，命名为BRCA1，1994年又发现另外一种与乳腺癌有关的基因，称为BRCA2。乳腺癌遗传检测适宜人群乳腺癌遗传检测适宜人群 (如果有以下因素，强烈建议如果有以下因素，强烈建议接受乳腺癌接受乳腺癌BRCABRCA检查检查)一个或多个直系亲属有乳腺癌史，如母亲或姐妹 家族成员里有早发乳腺癌患者，发病年龄早于40岁 家族成员里两代以上出现乳腺癌患者 家族成员有双侧乳腺癌患者 家族成员里有卵巢癌患者 家族成员有男性成员乳腺癌患者 一个或多个家族成员携带BRCA基
10、因突变，即遗传检测阳性 乳腺癌的分子分型乳腺癌的分子分型根据ki-67指数，ER、PR情况以及Her-2情况将乳腺癌分为不同的类型，分别对应不同的预后和治疗手段 lumina Alumina A型型 lumina Blumina B型型 HERHER-2-2型型 基底细胞型基底细胞型肿瘤生物学行为决定乳癌治疗选择NegativePositiveER /PgRHER-2NegativePositive 化疗化疗 Avastin内分泌治疗内分泌治疗抗抗Her-2治疗治疗1.National Institute for Health and Clinical Excellence.London(UK
11、):National Institute for Clinical Excellence(NICE);2002.2.Jackisch C.Oncologist.2006.11 Suppl 1:34-41.复发转移性乳腺癌（MBC）包括乳腺癌III期（局部进展）和IV期乳腺癌（转移）1 HER2阳性乳腺癌是一种特殊类型的乳腺癌，临床上30%复发转移性乳腺癌存在HER2过表达2细胞膜HER2蛋白：正常过表达非小细胞肺癌各种基因突变情况非小细胞肺癌各种基因突变情况 晚期NSCLC鳞癌：驱动基因2012年TCGA研究组报道了178例肺鳞癌患者的全基因组分析结果，发现了可作为靶点的基因或通路变异在69%
12、的肿瘤样本中发现PI3K/AKT通路和受体酪氨酸激酶(RTK)信号的变异RTK信号包括：EGFR扩增，BRAF突变，FGFR扩增或突变未知100%未知39%PIK3CA突变8%PTEN突变/缺失28%FGFR1扩增25%未知21%PIK3CA突变16%PTEN突变/缺失15%FGFR1扩增15%EGFR扩增9%PDGFRA扩增/突变 9%DDR2突变4%BRAF突变4%ERBB2扩增 4%FGFR2突变 3%2010MSKCC(n=52)TCGA(n=178)DDR2突变0%2012Kim HS,et al.Lung Cancer.2013;80(3):249-55.非小细胞肺癌靶向治疗敏感性
13、基因检测非小细胞肺癌靶向治疗敏感性基因检测K-RAS、BRAF基因突变检测基因突变检测不能应用靶向药物不能应用靶向药物EGFR检测检测突变突变无突变无突变突变突变应用靶向药物应用靶向药物Eml4-ALK基因检测基因检测无突变无突变阴性阴性阳性阳性靶向靶向ALK分子治疗分子治疗非小细胞肺癌靶向治疗敏感性基因检测非小细胞肺癌靶向治疗敏感性基因检测大肠癌靶向治疗敏感基因大肠癌靶向治疗敏感基因EGFR的传导通路大肠癌靶向治疗敏感性基因检测大肠癌靶向治疗敏感性基因检测K-RASK-RAS基因检测已经成为大肠癌患者治疗前必基因检测已经成为大肠癌患者治疗前必做的常规检查，是目前医生了解大肠癌患者癌做的常规检
14、查，是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法基因状况最直接、最有效的方法K-RASK-RAS基因检测可以筛选出对抗基因检测可以筛选出对抗EGFR(EGFR(表皮生长表皮生长因子受体因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后。后。早期检测早期检测K-RASK-RAS还可以通过该基因的状态了解还可以通过该基因的状态了解到病人的复发转移风险，为将来选择最佳治疗到病人的复发转移风险，为将来选择最佳治疗做好准备。做好准备。K-RAS的故事还没有结束扩大RAS分析是否会改变西妥昔
15、治疗结果？RAS状态的进一步分析Tabernero J,Presented at 2014 ASCO.外显子1外显子2外显子3外显子4外显子1外显子2外显子3外显子4外显子1外显子15外显子16KRASNRASBRAF1213596111714640%4%5-7%3-5%2-6%0%121359611171466006-10%PRIME1,PEAK2及FIRE-33研究分析在KRAS外显子2野生型患者中发现额外的14-20%其他RAS突变1Douillard JY,NEJM 2013;2Schwartzberg L,JCO 2013(A 3631);3Stintzing S,EJC 2013
16、其他RAS突变型：CRYSTAL KRASNRAS3.3%5.6%外显子3外显子4外显子211759 612.8%0.9%外显子2外显子3外显子412 1311759 6112 13WT3.5%146146666例KRAS密码子12/13野生型肿瘤患者中430例可评估RAS状态其他RAS突变率：14.7%(63/430)比例为RAS可评估的特定外显子突变可评估患者中的比例5例患者同时具有KRAS与NRAS突变;1例患者存在两种NRAS突变Ciardiello F,et al.2014 ASCO Abstract 3506.RAS问题之后，VEGF怎么办？MutationTumor growth
17、VEGF、PDGF、FGF、IGF、etc分子诊断指导化疗药物用药分子诊断指导化疗药物用药 药物基因组学药物基因组学(pharmacogcnomics)(pharmacogcnomics)是是2020世纪世纪9090年代末年代末发展起来的从基因水平研究基因序列的多态性与药物发展起来的从基因水平研究基因序列的多态性与药物效应多样性之间的关系，研究遗传因素对药物效应的效应多样性之间的关系，研究遗传因素对药物效应的影响，确定药物作用的靶点，从表型到基因型的药物影响，确定药物作用的靶点，从表型到基因型的药物反应的个体多样性。即：研究基因本身及其突变体对反应的个体多样性。即：研究基因本身及其突变体对不同
18、个体药物作用效应差异的影响，以此为平台指导不同个体药物作用效应差异的影响，以此为平台指导合理用药，提高用药的安全性和有效性，避免不良反合理用药，提高用药的安全性和有效性，避免不良反应，减少药物治疗的费用和风险。应，减少药物治疗的费用和风险。分子诊断指导化疗药物用药分子诊断指导化疗药物用药药物药物靶基因靶基因检测方法检测方法临床意义临床意义铂类铂类ERCC1核苷酸修复相关基因核苷酸修复相关基因荧光定量荧光定量PCR检测基因表达检测基因表达低表达使肿瘤低表达使肿瘤对药物敏感对药物敏感抗微管类药物抗微管类药物紫杉醇紫杉醇,长春新碱长春新碱TUBB33型微管蛋白型微管蛋白荧光定量荧光定量PCR检测基因
19、表达检测基因表达低表达使肿瘤低表达使肿瘤对药物敏感对药物敏感吉西他滨吉西他滨RRM1核酸核苷还原酶核酸核苷还原酶荧光定量荧光定量PCR检测基因表达检测基因表达低表达使肿瘤低表达使肿瘤对药物敏感对药物敏感抗代谢药物抗代谢药物TYMS胸腺苷合成酶胸腺苷合成酶荧光定量荧光定量PCR检测基因表达检测基因表达低表达使肿瘤低表达使肿瘤对药物敏感对药物敏感伊利替康伊利替康UGT1A1尿苷葡萄糖醛酸尿苷葡萄糖醛酸转移酶转移酶基因测序基因测序检测突变检测突变判定伊立替康判定伊立替康用药的毒性用药的毒性依托泊苷依托泊苷TOP2ADNA解旋酶解旋酶荧光定量荧光定量PCR检测基因表达检测基因表达低表达使肿瘤低表达使肿
20、瘤对药物敏感对药物敏感芳香化酶抑制剂芳香化酶抑制剂CYC19A1 芳香化酶芳香化酶基因测序基因测序检测突变检测突变突变影响突变影响药物疗效药物疗效 ERCC1（excision repair cross complement group1，核苷酸切除修复交叉互补组1）参与DNA 链的切割和损伤修复,其表达产物与DNA 修复酶缺乏互补基因F(XPF)形成紧密的异二聚体(ERCC1-XPF),具有损伤识别和切除5端的双重作用,在核苷酸切除修复(nucleotide excisio n repa ir,NER)中起到限速或调节的重要作用。铂类抗癌药物的细胞毒性作用主要是通过形成铂-DNA 加合物。D
21、NA 基因修复主要是由NER 和链间交联完成的,而ERCC1 是他们中一个关键因素,是参与NER 过程并与顺铂耐药紧密相关的关键因子。研究表明ERCC1 表达与化疗疗效呈负相关,ERCC1 能使顺铂诱导的DNA 络合物的清除增加,从而降低疗效。ERCC1与铂类药物敏感性TUBB3基因与抗有丝分裂类药物敏感性 抗有丝分裂药物分为三类：紫杉烷类（如紫杉醇、紫杉萜）；长春碱类（如长春新碱、长春瑞滨）以及秋水仙素类。紫杉醇通过与微管蛋白结合，形成稳定的微管束，抑制真核细胞的有丝分裂。它使肿瘤细胞停止在G2 期和M期,抑制细胞复制,阻止癌细胞增殖。细胞的微管蛋白分，两个亚型，是细胞骨架的重要组成部分，是
22、有丝分裂时纺锤体的 组成的单位，也是抗微管蛋白的主要作用靶点。-微管蛋白基因（tubulin beta-3 chain，TUBB3基因）编码的3型微管蛋白与抗微管与抗微管化疗药敏感性的关系最密切。在多种肿瘤细胞系的研究和临床研究中，都显示TUBB3 mRNA 表达水平与抗微管类化疗的疗效密切相关。胸苷酸合成酶与5-FU类药物的敏感性 胸苷酸合成酶（Thymidylate Synthetase，TYMS）是DNA合成的关键酶，在DNA合成与修复中起重要作用,是叶酸代谢循环中起中心作用的酶类之一，也是以5-氟尿嘧啶(5-FU)为基础化疗的靶酶。5-Fu在体内须转化为相应的核苷酸类似物才能发挥细胞毒
23、作用，其主要机制为转化为一磷酸氟代脱氧尿苷(FdUMP),后者与TYMS、5,10-亚甲基四氢叶酸形成三联复合物，并抑制TYMS，阻碍dTMP的从头合成；并且以FdUTP或FUTP的形式掺入到DNA或RNA分子中,破坏其结构和功能。临床研究表明，在包括直肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌等多种肿瘤患者中，TYMS 基因低表达水平的患者接受氟类化疗的效果较好。所以，检测肿瘤患者中TYMS的基因表达水平可以预测氟类药物的疗效。1869年 Aust Med J，Ashworth最早在转移性癌症患者血液中观察到。2005年 N Engl J Med，Cristofanilli证实治疗前CTC数目是转移
24、性乳腺癌患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子。循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。循环肿瘤细胞 原发肿瘤血管生成侵润侵入血管内侵入血管外(CTC)血管内增殖(CTM)转移转移播散肿瘤细胞（DTC）微转移休眠灶循环肿瘤细胞（CTC）循环肿瘤微栓（CTM）凋亡的CTC侵润肿瘤细胞扩增血管生成上皮间质转化（EMT）间质上皮转化（MET）转移到骨髓和其他器官CTC能在哪些方面给我们思考和启示？约510年转移无法检测可检测到CTC可用检测到影像临床症状对肿瘤细胞在分子层面分析突变分析CGH（比较基因组杂交）miRNASNP（单核苷酸多态性）RT-PCR,qRT-PCR甲基化
25、分析获取CTC需要解决的技术问题从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等区分开来每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而10mL血液中含有的白细胞约有1亿个，红细胞有500亿个。三种技术 过滤法ISET:Isolation by Size of Epithelial Tumor cells8m孔径过滤膜，漏检体积较小的肿瘤细胞敏感性低 梯度密度法肿瘤细胞和单核细胞密度小于1.077g/mlCTC纯度低，混入较多白细胞肿瘤细胞会迁移至血浆层，而聚集后容易下沉聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)对细胞有毒性免疫磁珠法肿瘤
26、细胞表面抗原EpCAM与包绕着磁珠的特异性单抗相结合CellSearch细胞保存方法长达96小时实验室室间差异小EpCAM的假阳性和假阴性%Probability of SurvivalTime from Baseline(Months)02468101214161822242628300%10%20%30%40%50%60%70%80%90%100%20Logrank p 5 CTCsn=87(49%)5 CTCsn=90(51%)CellSearch 是全球第一也是唯一经FDA批准可用于临床的循环肿瘤细胞（CTC）产品1983 磁流体白细胞白细胞Anti-CD45CD45NucleusDA
27、PI如何鉴别出CTC?藻红蛋白(PE)变藻蓝蛋白(APC)CTCAnti-EpCAM磁珠Anti-CK-PENucleusDAPICKEpCAM在CellSearch检测中，CTC 被设定为：EpCamCK-8,18 和/或19DAPI CD45+-CellSave 储存管CellSearch CTC检测试剂盒CellSearch:自动化的CTC分离、富集和计数CellTracks AutoPrep系统磁巢MagnestCellTracks Analyzer II96小时稳定2004年FDA批准CTC质控试剂盒磁力捕获CellSearch技术的可重复性和高敏感度CellSearch系统是CTC
28、检测目前唯一的自动化、标准化平台减少方法学及人工操作引起的结果差异实验结果的可重复性实验室间结果的可比性系统线性系数：R=0.990，线性范围 0-1238系统最低检测限度：7.5ml外周血中的1个肿瘤细胞 CTC在肿瘤中的研究进展2004N Engl J MedCTC升高，PFS和OS均降低，CTC是预后的独立预测因子2005J Clin OncolCTC在治疗前后都是预后的强烈而独立预测因子2006Clin Cancer ResCTC在治疗的任何时段升高都预示乳腺癌病情进展，预后不良2006Clin Cancer ResCTC计数对于乳腺癌病情状态判断要比当前的影像学方法更早且更具有可重复
29、性2008 Ann Oncol 治疗中CTC的变化提示疾病对于治疗的反应2009J Clin OncolCTC检测达到5个或更多对于MBC的治疗监控优于FDG-PET/CT检查2010Ann Oncol CTC计数越高，越与多处骨转移或多器官转移相关CTC在乳腺癌中的研究结果回顾切点的意义切点的意义评估预后评估预后结合CTC检测比单独的影像学检查预后更准确乳腺癌中：CTCCTC计数计数CTCCTC的分子特性的分子特性n指示预后n辅助检测抗癌药物的反应作为预测和/或药物动力学生物标志物n联合已知的分期因素，获取更精确的预后n判断病人是否需要辅助化疗n检测癌症复发n辅助诊断n实时活检肿瘤的生物学行为n阐明预后和预计的分子学特征n检测抗药情况基于获得连续样本的便利性n提高对生物过程机制的了解n发现并鉴定新治疗靶点CTC的应用：从细胞计数到分子特性
