1、基因工程基因工程Gene Engineering彭银祥等编著彭银祥等编著华中科技大学出版社2008年2月第二次印刷第3章 基因工程工具酶Tool Enzymes in Gene Engineering高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材高等学校生物工程、生物科学及生物技术专业教材3-2 工具酶 tool enzymes 目的基因 interested gene 载体 vector 受体细胞 receipt cells3-3重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接
2、酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高分子或片段连接；缺口平移制作高比活探针；比活探针；DNA序列分析；填补序列分析；填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常外切活性。常用于用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3
3、 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA；替代；替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记等进行填补，标记等多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基Taq DNA聚合酶聚合酶PCR合成合成DNA片段片段3-4基因工程实验中常用的工具酶基因工程实验中常用的工具酶内切酶内切酶连接酶连接酶聚合酶聚合酶修饰酶修饰酶多核苷酸激酶多核苷酸激酶末端转移酶末端转移酶核酸外切酶核酸外切酶III核酸外切酶核
4、酸外切酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶S1核酸酶核酸酶Bal31 核酸酶核酸酶3-53.1 限制性内切酶限制性内切酶 3.1.1 细菌的限制-修饰系统（R-M系统）GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGG AATTC CTTAA GMeMeRestrictionModificationR EcoRIM EcoRI限制与修饰系统的生物学意义限制与修饰系统的生物学意义1保护自身DNA不被降解；2破坏外源DNA，防止DNA的转化，保证物种的遗传稳定性。3-6第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该
5、细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶3.1.2 限制内切酶的命名限制内切酶的命名 EcoRI：Escherichia coli RI HindIII：Haemophilus influensae d III SacI：Streptomyces achromagenes I 3-73.1.3 限制性内切酶分类限制性内切酶分类 限制修饰系统的种类限制修饰系统的种类 （a）I型：
6、由三个基因构成，hsd R；hsd M；hsd S（host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色体上，三个基因产物构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（腺苷甲硫氨酸）。（b）II型：限制与修饰基因产物独立起作用。（c）III型：修饰酶与型酶相同，hsd与hsd基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。3-8核酸限制性内切酶的类型及主要特性核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性特性I类内切酶
7、类内切酶II类内切酶类内切酶III类内切酶类内切酶限制和修饰限制和修饰活性活性单一多功能的酶单一多功能的酶内切酶和甲基内切酶和甲基化酶分开化酶分开共同亚基的双共同亚基的双功能酶功能酶内切酶的蛋内切酶的蛋白结构白结构3种不同的亚基种不同的亚基单一成分单一成分2种不同的亚种不同的亚基基限制作用所限制作用所需要的辅助需要的辅助因子因子ATP、Mg2+和和SAMMg2+ATP、Mg2+和和SAM寄主特异性寄主特异性位点识别序位点识别序列列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC回文序列回文序列（IIs型除外）型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG3-9切割位
8、点切割位点在距离识别位在距离识别位点至少点至少1000bp处随机切开处随机切开一条单链。一条单链。位于寄主特位于寄主特异性位点或异性位点或其附近其附近距寄主特异距寄主特异性位点性位点3端端2426bp处处酶催转换酶催转换不能不能能能能能DNA易位作用易位作用能能不能不能不能不能甲基化作用的位甲基化作用的位点点寄主特异性位寄主特异性位点点寄主特异性寄主特异性位点位点寄主特异性寄主特异性位点位点识别未甲基化的识别未甲基化的序列进行切割序列进行切割能能能能能能序列特异的切割序列特异的切割不是不是是是是是基因工程中的用基因工程中的用途途无用无用十分有用十分有用3-10 I型限制性内切核酸酶有其特定的D
9、NA识别序列，但酶在DNA上的切割位置远离其识别位置，有的酶可在同识别序列相距1 000 bp的位置上随机切割。l型限制酶对体外重组DNA实验没有多少用处。III型限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列，其酶切位置在识别序列3端之外相距约20个碱基对处，可以产生各种类型的单链末端。型酶有其特定的用途。II限制性内切核酸酶在DNA上有其特定的识别序列即，回文结构，通常为4-8bp，在特定识别位点处切割DNA。是基因工程中主要使用的酶类。3-11限制酶特点：限制酶特点：1.识别识别-8个相连的核苷酸，以个相连的核苷酸，以6个多见；个多见；3.1.4 限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序
10、列 BamH I 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5Not I 5-GCGGCCGC-3 3-CGCCGGCG-52.呈回文结构呈回文结构(palindrome)；3.旋转对称性；旋转对称性；EcoRI 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 4.切点大多数在识别顺序之内，也有例外。切点大多数在识别顺序之内，也有例外。Fok I 5-GGATGNN -3 3-CCTAC NN-5 外侧，产生外侧，产生3-端突起端突起5.识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，识别序列严格，少数有变动，序列中的核苷酸被甲基化后，不能被切割。不能被切割。3-123.1.5 限制性内切酶的切
11、割方式限制性内切酶的切割方式内切酶切割后产生的三种末端内切酶切割后产生的三种末端a)5 突出的粘性末端突出的粘性末端 如如,EcoR I 5-G AATTC-3 3-CTTAA G-5b)3 突出的粘性末端突出的粘性末端 如如,Pst I 5-CTGCA G-3 3-G ACGTC-5c)平末端平末端 如如,Sma I 5-CCC GGG-3 3-GGG CCC-53-13同裂酶同裂酶:能识别相同序列，切割位点可以相同也能识别相同序列，切割位点可以相同也可以不同，来源不同的酶。可以不同，来源不同的酶。（1）同裂酶（）同裂酶（Isoschizomers)完全同裂酶：完全同裂酶：识别位点和切点完全
12、相同。如识别位点和切点完全相同。如Hind 和和Hsu I。3.1.6 同列裂酶和同尾酶同列裂酶和同尾酶3-14Xma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5识别位点相同，但切点不同。如识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和和 Sma I。不完全同裂酶：不完全同裂酶：Asp718I 5-G GTACC-3 3-CCATG G-5Kpn I 5-GGTAC C-3 3-C CATGG-53-15同尾酶同尾酶(Isocaudamers):识别的序列不同，但能切出识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如相同的粘性末端。如BamHI、
13、Bgl、BclI、Xho等等（2）同尾酶）同尾酶(Isocaudamers）3-16 Sau3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点位点一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。？Sau3A3-17同裂酶同裂酶（Isoschizomers）EnzymeSequenceIsoschizomersAcc65IGGTACC CCATGGAsp718 I,Kpn IAhaIIIT T TAAA AAATTTDra IBstMA ICTGCAGGACGTCPst IEcoRIGAATTCCTTAAGFun IINdeICATATGGTATACFauND IN
14、heIGCTAGCCGATCGAsuNH I,Bmt INotIGCGGCCGCCGCCGGCGCciN ISmaICCCGGGGGGCCCCfr9 I,PspA I,Xma I,XmaC I Restriction endonucleases that recognize the same sequence are isoschizomers.3-18同尾酶同尾酶（）EnzymeSequenceIsoschizomersBamHI5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5Bcl I,Bgl II 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5Bcl I5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5B
15、amH I,Bgl IIBgl II5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5Bcl I,BamH IPst I5-CTGCAG-3 3-GACGTC-3Nsi I,5-ATGCAT-3 3-TACGTA-3 Nsi I5-ATGCAT-3 3-TACGTA-5Pst IRestriction endonucleases that recognize the different target sequence and cut down the same sequences sticky ends are isocaudamers.3-193.1.7 限制性内切酶识别序列出现的几率及限制性内切酶
16、识别序列出现的几率及酶切片段的估算酶切片段的估算3-20DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度的纯度 3.1.8 影响限制性内切酶活性的因素影响限制性内切酶活性的因素纯化纯化DNA加大酶的用量加大酶的用量延长保温时间延长保温时间 扩大反应体积（扩大反应体积（20 l）一般采取一般采取3-21大肠杆菌一般有大肠杆菌一般有两种甲基化酶两种甲基化酶修饰质粒：修饰质粒：2.DNA的甲基化程度的甲基化程度 dam甲基化酶（修饰甲基化酶（修饰GATC中的中的A）；）；dcm甲基化酶（修饰甲基化酶（修
17、饰CCA/TGG的的C）。）。基因工程中必须使用甲基化酶失活基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。突变的菌株。3-22对不完全消化具有一定的影响对不完全消化具有一定的影响3.DNA的分子结构的分子结构 DNA的分子结构有三种的分子结构有三种超螺旋结构、线性结构、单链开环结构超螺旋结构、线性结构、单链开环结构3-23是影响限制酶活性的重要因素。是影响限制酶活性的重要因素。4.缓冲液缓冲液(Buffer)缓冲液的化学组成缓冲液的化学组成MgCl2、NaCl/KCl：提供提供Mg2+和离子强度；和离子强度；Tris-HCl：维持维持pH；二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；）：保持酶
18、稳定性；牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；等：有助于酶的稳定；商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。3-24不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是大多数是37 oC，少数要求，少数要求40-65 oC。酶酶最适温最适温度度oC酶酶最适温最适温度度oC酶酶最适温最适温度度oCApa IBcl IMae IITaq I30505065Apy IBstE IIMae III306055Ban IMae ISma I5045255.酶切消化反应的时间和温度酶切消化反应的时间和温度 3-25限制性内切酶储存在
19、含限制性内切酶储存在含50%的甘油缓冲液中，酶切的甘油缓冲液中，酶切时甘油的浓度不应超过时甘油的浓度不应超过1/10体积。否则对酶活性有体积。否则对酶活性有抑制作用。抑制作用。6.反应体积和甘油浓度反应体积和甘油浓度质粒酶切鉴定质粒酶切鉴定通常设定反应体积为通常设定反应体积为10-20l,质粒酶切大量酶切质粒酶切大量酶切通常设定反应体积为通常设定反应体积为80-100l。3-26限制性内切酶的识别和酶切活性一般在限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、一定的温度、离子强度、pHpH等条件下才等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。表现最佳切割能力和位点的专一性。7.星号（星号
20、（*）活性）活性如果改变反应条件就会影响酶的专一性如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（和切割效率，称为星号（*）活性。）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。所以一般使用专一的反应缓冲液。星号（星号（*）活性）活性3-27EcoR I和和BamH I等都有等都有*活性。活性。在低盐、高在低盐、高pH（8）时可识别和切割）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的时候要特别注意！使用的时候要特别注意！3-28大多数酶可用大多数酶可用65 oC温育温育5分钟失活。分钟失活。或用或用乙醇乙醇沉淀沉淀DNA。3.1.9 限制酶酶切反应的
21、终止限制酶酶切反应的终止 几种常用限制酶识别位点几种常用限制酶识别位点3-293-303.2 DNA 连接酶（连接酶（Ligase）DNA连接酶能利用连接酶能利用ATP或或NAD+提供的能提供的能量催化多段量催化多段DNA片段的片段的3-OH和和5-P基团基团之间形成之间形成3，5-磷酸二酯键，把两个磷酸二酯键，把两个DNA片段连接在一起。片段连接在一起。OH POHP HOPHOPPPOHHO连接酶连接酶3-311.ATP（NAD+)提供激活的提供激活的AMP。3.2.1 作用机制及特点作用机制及特点2.ATP与连接酶形成共价与连接酶形成共价“连接酶连接酶-AMP”复复合物，并释放出焦磷酸合
22、物，并释放出焦磷酸PPi。3.AMP与连接酶的与连接酶的赖氨酸赖氨酸-氨基氨基相连。相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+H3NAMPATPPPi3-324.AMP随后从连接酶的赖氨酸随后从连接酶的赖氨酸-氨氨基转移到基转移到DNA一条链的一条链的5端端P上，形上，形成成“DNA-腺苷酸腺苷酸”复合物。复合物。-OH HO-P-AMP-OHO-P-AMP3-335.3-OH对磷原子作亲核攻击，形成对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出磷酸二脂键，释放出AMP。3-34（1）大肠杆菌连接酶）大肠杆菌连接酶1.两种两种DNA连接酶连接酶只能连接只能连接粘性末端粘性末端。（2）
23、T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，不但能连接粘性末端，还能连接还能连接齐平末端齐平末端。3.2.2 DNA连接酶的分类连接酶的分类3-35（1）必须是两条双链）必须是两条双链DNA。（2）DNA3端有游离的端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（P）。）。（3）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：大肠杆菌中：NAD+2.连接条件连接条件3-36连接酶反应的最佳温度是连接酶反应的最佳温度是37 C。3.连接反应的温度连接反应的温度1.最佳温度最佳温度但在但在37下下粘性末端粘性末端的结合很不稳定。的结合很不稳定。2.实用温度实用温
24、度所以一般采用所以一般采用 416 C。3-37增加插入片段与载体的接触机会，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。减少载体自我连接的现象。1.插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度比例 2.反应温度反应温度4.影响连接反应的因素影响连接反应的因素1020倍。倍。一般一般12163-383.3 DNA聚合酶（聚合酶（Polymerase）基因工程中常用的基因工程中常用的DNA聚合酶聚合酶1.大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I2.Klenow fragment3.T7 DNA聚合酶聚合酶4.T4 DNA聚合酶聚合酶5.修饰过的修饰过的T7 DNA聚合酶聚合酶6.逆转录酶逆
25、转录酶3-391.共同特点共同特点把把dNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的3OH端。端。2.主要区别主要区别T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。而不从模板上掉下来。其它几种其它几种DNA聚合酶只能连续添加聚合酶只能连续添加10多多个个dNTPs就会从模板上解离下来。就会从模板上解离下来。常用的常用的DNA聚合酶的特点聚合酶的特点持续合成能力和外切酶活性不同。持续合成能力和外切酶活性不同。3-40DNA聚合酶聚合酶35外切外切酶活性酶活性53外切外切酶活性酶活性聚合聚合速率速率持续能持续能力力大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶低低有有中
26、中低低Klenow fragment低低无无中中低低T4DNA聚合酶聚合酶高高无无中中低低T7DNA聚合酶聚合酶高高无无快快高高化学修饰化学修饰T7DNA聚合酶聚合酶低低无无快快高高遗传修饰遗传修饰T7DNA聚合酶聚合酶无无无无快快高高逆转录酶逆转录酶无无无无低低中中Taq DNA聚合酶聚合酶无无有有快快高高3.常用常用DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较3-413.3.1 DNA聚合酶聚合酶 I主要用来制备带放射性标记的主要用来制备带放射性标记的DNA探针。探针。（1）大肠杆菌）大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶I 的性质的性质一条一条单链多肽单链多肽。用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉用枯草杆菌蛋白酶
27、处理可以切掉N端的端的部分。就成为部分。就成为Klenow fragment。3-42 底物：底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）Mg2+带有带有3-OH游离端的引物游离端的引物 DNA模板模板（2）DNA聚合酶聚合酶I（Pol I）的反应条件）的反应条件-OH53dNTPs3-43 核酸探针（核酸探针（probe）能够同某种被研究的核酸序列特异能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。子。（3）用）用DNA聚合酶聚合酶I 制备探针制备探针标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断显示位置显示位置与互补的待测序列杂交与
28、互补的待测序列杂交3-44标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断 探针的标记方式探针的标记方式标记标记已知序列的核酸片断已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断带有放射性的已知序列的核酸片断533-45 DNA聚合酶聚合酶I 对探针序列的标记对探针序列的标记切口转移法切口转移法(nick translation)：a.放射性同位素标记：放射性同位素标记：DNA聚合酶聚合酶I 同时具备同时具备53外切酶外切酶活活性和性和53的聚合酶的聚合酶活性（以及活性（以及35外外切酶活性）。切酶活性）。3-4653外切酶活性从外切酶活性从DNA切口的下一段切口的下一段DNA5端端除去一个核苷酸
29、后，聚合酶活性就会在切口的上除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段一段DNA的的3一侧补上一个新的核苷酸。一侧补上一个新的核苷酸。切口切口553353533-47纯化的纯化的DNA片断片断DNase I 制制造单链切口造单链切口DNA Pol I 进进行切口转移行切口转移一种一种-32P-dNTP和和dNTPs555555553333333332P-dNTP32P-dNTP从头至尾都被标记从头至尾都被标记3-483.3.2.Klenow fragment具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性。（性。（失去了失去了53外切酶活性外切酶活性）。）。（1）Klenow 片
30、段的性质片段的性质DNA Pol I Klenow fragment(76KD）枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶3-49 3端补平端补平55klenow DNA 3末端标记末端标记补平限制性内切酶切后形成的补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端隐蔽端。在在3隐蔽端隐蔽端加上放射性标记的加上放射性标记的dNTP。klenow（2）主要用途）主要用途3-503隐蔽末端的隐蔽末端的DNA片断片断Klenow fragment补平补平根据末端的顺序选择根据末端的顺序选择一种一种 -32P-dNTPs末端标记的末端标记的DNA限制性内切酶切限制性内切酶切5-G33-CTTAA55-GAA33-CTTAA55-G
31、AATT33-CTTAA55-G33-CCTAG55-GG33-CCTAG55-GGATC33-CCTAG5EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25oC 1h3-51 cDNA第二链的合成第二链的合成mRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow533553引物引物3-52（1）T4 DNA聚合酶的性质聚合酶的性质3.3.3.T4 DNA聚合酶聚合酶从从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由中分离纯化。由噬菌体基因噬菌体基因43编码。编码。有有53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶活外切酶活性（降解单链更快）
32、。性（降解单链更快）。来源来源 酶活性酶活性3-53 特点特点当没有当没有dNTP时，时，T4DNA聚合酶行使聚合酶行使35外切酶功能，制造出外切酶功能，制造出3隐蔽端。隐蔽端。如果只有一种如果只有一种dNTP，则降解到该，则降解到该dNTP的位置。的位置。3-5455335533T4 DNA聚合酶聚合酶无无dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶有有dNTPs553-55（2）T4 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途标记末端（取代合成法）标记末端（取代合成法）用用35外切酶活性作用于外切酶活性作用于所有末端形式所有末端形式的的3端端（平端、（平端、3隐蔽端、隐蔽端、5隐蔽端）制隐蔽端）制造出造出3隐蔽
33、端。隐蔽端。再利用它的再利用它的53聚合酶活性补平，并加聚合酶活性补平，并加入放射性标记的入放射性标记的dNTP。补平隐蔽末端补平隐蔽末端 DNA 3末端标记末端标记3-56酶切中间酶切中间产生两个产生两个末端标记末端标记加入某种加入某种32P-dNTP和和dNTPsT4 DNA聚合酶聚合酶（35外切）外切）DNA酶切片断酶切片断T4 DNA聚合酶聚合酶（53聚合）聚合）55335533553355335533内切酶切内切酶切无无dNTPs3-573.3.4.T7 DNA聚合酶聚合酶（1）来源）来源从从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：出来的，
34、由两个亚基组成：T7T7基因基因5 5编码的大亚基：编码的大亚基：有有53聚合酶和聚合酶和35外切酶活性。外切酶活性。大肠杆菌编码的小亚基：大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白。硫氧还蛋白。增加大亚基对增加大亚基对模板的亲和性模板的亲和性。3-58（2）T7 DNA聚合酶的特点聚合酶的特点 持续合成能力强持续合成能力强一但与模板结合就会不间断地合成一但与模板结合就会不间断地合成互补链。互补链。35外切酶活性高外切酶活性高单链和双链都能降解。单链和双链都能降解。不受不受DNADNA二级结构的影响二级结构的影响其它其它DNA聚合酶受聚合酶受DNA二级结构的阻碍二级结构的阻碍3-59 进行末端标记进行末
35、端标记 以大分子量以大分子量DNA为模板的合成为模板的合成如如M13 补平隐蔽末端补平隐蔽末端（3）T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途取代合成法标记取代合成法标记3末端。末端。与与T4 DNA聚合酶相同。聚合酶相同。合成合成补平补平3隐蔽末端；隐蔽末端；水解水解修平修平3突出末端。突出末端。3-60修饰后的修饰后的T7 DNA聚合酶聚合酶（1）T7DNA聚合酶的化学修饰聚合酶的化学修饰去除去除35外切酶活性，使外切酶活性，使DNA聚聚合能力和聚合速率提高了合能力和聚合速率提高了3倍。倍。（2）修饰后的）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途 DNA测序测序双脱氧法。双脱氧法。标记标记D
36、NA 3隐蔽末端隐蔽末端 更有效地补平末端更有效地补平末端3-613.3.5.反转录酶反转录酶最普遍使用的是来源于最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母鸟类骨髓母细胞瘤病毒细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）：）：依赖依赖RNA的的DNA聚合酶（聚合酶（RNA指指导的导的DNA聚合酶）。聚合酶）。（1）来源）来源RNA肿瘤病毒。肿瘤病毒。（2）AMV的性质的性质由由 和和 两条多肽链组成。两条多肽链组成。3-62 链链有反转录活性和有反转录活性和 RNaseH活性。活性。RNaseH：链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。以以53或或
37、35方向特异地水解方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的杂交双链中的RNA链链。RNaseHRNADNARNADNA3-63（3）逆转录酶的用途）逆转录酶的用途 链链RNA-DNA杂交双链中杂交双链中53DNA外外切酶活性。切酶活性。合成合成cDNA以以oligo dT为引物（与为引物（与mRNA的的polyA尾巴互补结合）。尾巴互补结合）。AAAAATTTTT53mRNA 5cDNA3-64 合成合成DNA探针探针用随机引物（用随机引物（random primer）或）或oligo dT做引物。做引物。随机引物：随机引物：随机顺序形成的寡聚随机顺序形成的寡聚DNA片断。片断。（理论上它能与
38、各种序列的模板结合）（理论上它能与各种序列的模板结合）RT-PCR用的模板用的模板克隆某个基因时，用其克隆某个基因时，用其mRNA反转录反转录出出cDNA第一链。第一链。3-651.碱性磷酸酶种类碱性磷酸酶种类从大肠杆菌中分离出来。从大肠杆菌中分离出来。具有抗热性。具有抗热性。（1）细菌性碱性磷酸酶）细菌性碱性磷酸酶 Bacterial alkaline phosphatase，BAP（2）小牛肠碱性磷酸酶）小牛肠碱性磷酸酶 Calf intestinal alkaline phosphatase，CIP从小牛肠中纯化出来。从小牛肠中纯化出来。SDS中加热中加热68C可完全失活。可完全失活。3
39、.4 其他其他DNA修饰酶修饰酶3.4.1 碱性磷酸酶碱性磷酸酶3-662.碱性磷酸酶的特性碱性磷酸酶的特性催化脱掉催化脱掉DNA（或（或RNA）5端的磷酸端的磷酸根。根。3P-OH53 HO-P553HO-OH53 HO-OH碱性磷酸酶碱性磷酸酶3.碱性磷酸酶的功能碱性磷酸酶的功能（1）防止线性化的载体份子自我连接）防止线性化的载体份子自我连接3-67单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。AAGCTTTTCGAAHind酶切酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTT HO-A碱性磷酸酶碱性磷酸酶5553-68A-OHTTCGA-OHHO-AGCTT H
40、O-AOH与与OH不能形成磷酸二酯键，所以不不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。能自我连接。但同一酶切后的但同一酶切后的外源外源DNA的的5端有端有P，能与脱磷酸的载体能与脱磷酸的载体OH连接。连接。3-69ATTCGAAGCTT AAGCTTAATTCGA连接酶连接酶-OH与与-OH连不住连不住其中每条链上都有一个其中每条链上都有一个nick，但转入细，但转入细菌后会被修复。菌后会被修复。3P-AGCTTA-OH53HO-ATTCGA-P5外源外源DNA3-70是一类从多核苷酸链的一头开始催化是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解降解核苷酸的酶。核苷酸的酶。1、单链、单链DNA外切酶外切酶1
41、)大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）53外切外切识别识别5-OH2)大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶（exo）53、35外切外切识别识别3-OH、5-P3.4.2 核酸外切酶（核酸外切酶（Exonucleases）3-712、双链、双链DNA外切酶外切酶1)核酸外切酶核酸外切酶（exoexo ）35外切外切识别识别3-OH主要用途：主要用途：在在DNA双链的末端产生出单链区域。双链的末端产生出单链区域。5555exo 与与klenow配合进行配合进行3端标记端标记-OHHO-3-722.核酸外切酶（核酸外切酶（exo）53外切。外切。主要用途：主要用途：使使DNA双链变成
42、单链（短）。双链变成单链（短）。5 P-P 555 exo 成为测序模板。成为测序模板。识别识别5-P（但不能降解（但不能降解5-OH）3-733.T7基因基因6核酸外切酶核酸外切酶53外切。外切。用途与用途与 exo一样。一样。既能识别既能识别5-P，又能识别，又能识别5-OH。5555已被克隆到大肠杆菌中表达。已被克隆到大肠杆菌中表达。3-74DNA外切酶外切酶切割方式切割方式识别位点识别位点单单链链大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶I（exo I）535-OH大肠杆菌核酸外切酶大肠杆菌核酸外切酶（exo）53355-P3-OH双双链链核酸外切酶核酸外切酶（exo）353-OH 核酸外切
43、酶（核酸外切酶（exo）535-PT7基因基因6核酸外切酶核酸外切酶535-P5-OH3-751.来源来源稻谷曲霉（稻谷曲霉（Aspergillus oryzae）。）。2.特性特性（1）高度单链特异性）高度单链特异性（2）反应条件）反应条件 低水平低水平Zn2+pH4.04.33.4.3 S1核酸酶核酸酶3-763.S1核酸内切酶的功能核酸内切酶的功能（1）催化单链）催化单链RNA或或DNA降解。降解。（2）切掉双链核酸中的单链区。）切掉双链核酸中的单链区。S1S1发卡或有缺口的部位。发卡或有缺口的部位。3-77（4）不能降解双链）不能降解双链DNA或或RNA-DNA杂交链杂交链ATGCAT
44、 GCATGCTACGTA CGTACGT甚至能识别单个核苷酸的单链区！甚至能识别单个核苷酸的单链区！（3）降解限制酶切形成的单链突出端。）降解限制酶切形成的单链突出端。3-784.S1核酸酶的用途核酸酶的用途（1）定位）定位RNADNARNAS1S1200bp400bp某限制酶切后再与某限制酶切后再与RNA杂交杂交某限制酶位点（参照物）某限制酶位点（参照物）内切酶位点不能位于内含子序列中！内切酶位点不能位于内含子序列中！RNA3-79RNA位于某限制酶位点位于某限制酶位点左左200bp和右和右400bp。RNA位置位置不能配对的内含子区域形成的单链不能配对的内含子区域形成的单链环被环被S1切
45、掉。切掉。mRNADNA（2）用）用mRNA测定基因中的外显子序列测定基因中的外显子序列3-80Bal 31核酸酶核酸酶1.来源来源埃氏交替单胞菌（埃氏交替单胞菌（Alteromonoas espejiana）2.功能功能既有既有单链单链特异的特异的DNA（RNA）内切酶；）内切酶；又有又有双链双链特异的特异的DNA外切酶。外切酶。降解双链降解双链DNA或其上的单链缺口、未或其上的单链缺口、未配对的单链区域。配对的单链区域。3-814.Bal31的用途的用途定位测定定位测定DNA片断中的限制酶位点分布。片断中的限制酶位点分布。3.反应条件反应条件Mg2+、Ca2+EGTA（乙二醇双四乙酸）专一
46、性螯合（乙二醇双四乙酸）专一性螯合Ca2+，可终止反应。，可终止反应。EcoR IEcoR IBamH IHind III3-82与对照组（不用与对照组（不用Bal31消化）只用相同的消化）只用相同的酶切的电泳比较。酶切的电泳比较。根据酶切片断消失的先后顺序，判断这些根据酶切片断消失的先后顺序，判断这些片断在原片断在原DNA中的位置。中的位置。用用Bal31消化线性消化线性DNA，并在，并在不同的时不同的时间间加入加入EGTA终止反应，再酶切电泳。终止反应，再酶切电泳。Bal31控制消化法：控制消化法：3-83EcoR IEcoR IBamH IHind III分别用各个内切酶切后电泳，记录分
47、别用各个内切酶切后电泳，记录片断数目和大小。片断数目和大小。EcoR IBamH IHind IIIMarker3-84EcoR IEcoR IBamH IHind IIIEcoR IEcoR IBamH IHind IIIBal31分别用原内切酶切后分别用原内切酶切后电泳，判断片断数目电泳，判断片断数目和大小。和大小。Hind IIIEcoR IBamH IMarker3-85（a）特点：）特点：具内切酶活性，作用于具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无，但无核苷酸序列特异型，产生核苷酸序列特异型，产生5-P低聚核苷酸低聚核苷酸;Ca2+,Mg 2+或或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值可使
48、酶活达最大值 当酶浓度很低时，当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：下影响：Mg 2+存在时，两条链上的切口独立无存在时，两条链上的切口独立无关关Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位存在时，两条链上的切口几乎在同一位置置 （b）用途）用途 切口平移切口平移（nick translation)，制备，制备DNA探针探针 制备制备RNA样品时除去样品时除去DNA分子分子 基因突变时产生切口基因突变时产生切口 3.4.4 DNA酶酶3-86大部分用于大部分用于RNA的核苷酸
49、序列分析或除去的核苷酸序列分析或除去DNA样样品或蛋白质合成系统中的品或蛋白质合成系统中的RNA分子。分子。RNase的识别的识别（a）RNase A 分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100加热加热15min仍具活性）仍具活性）,用于除去用于除去DNA样品中的样品中的RNA分分子子。（b）RNase H 作用于作用于DNA-RNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链，用于链，用于cDNA文库建立时除去文库建立时除去DNA链以便第二条链链以便第二条链cDNA链的合成。链的合成。3.4.5 RNA酶酶3-873.4.6 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶1.来源来源T4噬
50、菌体的噬菌体的pseT基因编码。基因编码。从从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。2.功能功能催化催化 磷酸从磷酸从ATP转给双链或单链转给双链或单链DNA或或RNA的的5-OH端。端。不论不论5-OH端突出与否。端突出与否。3-8853HO-OH53 HO-OH3P-OH53 HO-P5ATPT4多核苷酸激酶多核苷酸激酶如果如果ATP的的 磷酸带有磷酸带有32P标记，就会被转标记，就会被转移到移到DNA的的5端。端。但天然的但天然的DNA的的5端都是磷酸化的。端都是磷酸化的。3-89多核苷酸激酶的用途多核
