1、第五章第五章 分子发光分析分子发光分析 分子发光分子发光 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生基态时，便产生分子发光分子发光。分类：分类：依据激发模式不同依据激发模式不同 光致发光，场致发光，热致发光，光致发光，场致发光，热致发光，化学发光化学发光等等 光致发光：光致发光：按激发态的类型分按激发态的类型分 荧光和磷光荧光和磷光 第一节第一节 荧光分析法荧光分析法 一、概述一、概述 分子荧光分析法是依据分子分子荧光分析法是依据分子 荧光光谱荧光光谱进行进行
2、定性定性，以以荧光强度荧光强度进行进行定量定量的一种分析方法。的一种分析方法。特点：特点：（1）灵敏度高）灵敏度高 检出限：比分光光度法低检出限：比分光光度法低24个数量级；个数量级；（2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；（3）试样量少）试样量少 缺点缺点：应用范围较分光光度法小。：应用范围较分光光度法小。二、基本原理二、基本原理 (一一)分子荧光光谱的产生分子荧光光谱的产生 1.分子能级与电子能级的多重性分子能级与电子能级的多重性 能量*a.基态基态 S0 b.激发单重态激发单重态 Sn 2S+1=1 c.激发三重态
3、激发三重态 Tn 2S+1=3 a b c 单重态与三重态的区别单重态与三重态的区别?电子的自旋方向不同电子的自旋方向不同?三重态的能量稍低于单重三重态的能量稍低于单重态态 单重态和三重态的单重态和三重态的电子分布图电子分布图 2.荧光的产生荧光的产生 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁跃迁(发光发光)和非辐射跃迁等方式失去能量；和非辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径 辐射跃迁辐射跃迁 非辐射跃迁非辐射跃迁 荧光荧光 磷光磷光 系间窜越系间窜越 内转移内转移 外转移外转移 振动弛豫振动弛豫 激发态激发态基态：多种途径和方式
4、基态：多种途径和方式(见下页能级图见下页能级图)；速度；速度最最快快、激发态、激发态寿命最短寿命最短的途径占的途径占优势优势；内转换 振动弛豫 内转换 S2 S1 能 量 吸吸 收收 发发 射射 荧荧 光光 系间窜越 T1 外转换 T2 发发 射射 磷磷 光光 振动弛豫 S0 l l 1 l l 2 l l?2 l l 3 荧光发射：荧光发射：电子由第一激发电子由第一激发单重态单重态的的最低振动能级最低振动能级基基磷光发射：磷光发射：电子由第一激发电子由第一激发三重态三重态的的最低振动能级最低振动能级基态基态 外转换：外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生激发分子与溶剂或其他分子之间产生的荧
5、光；的荧光；10-7态（态（多为多为 S S 跃迁），发射波长为跃迁），发射波长为 l l（T S 跃迁）；跃迁）；内转换 内转换 021 0 1相互作用而转移能量的非辐射跃迁；相互作用而转移能量的非辐射跃迁；振动弛豫-9 s 电子由电子由S 进入进入T的可能过程：（的可能过程：（S T 禁阻跃迁）禁阻跃迁）S 10。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，010 12 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。系间窜跃 S 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T 01荧光的发射波长比吸收波
6、长要长；荧光的发射波长比吸收波长要长；l l 2 l l 2 l l 1；-410 s。光照停止后，可持续一段时间光照停止后，可持续一段时间 发光速度很慢：发光速度很慢：10S 1内转移内转移 能 量 T1 T2 发发 发发 射射 射射 外转换 吸吸 荧荧 当当两个电子能级两个电子能级非常靠近以至其振动能级有非常靠近以至其振动能级有 重重磷磷 振动驰豫振动驰豫在同一电子能级中，电子由高振动能级转在同一电子能级中，电子由高振动能级转收收 振动弛豫 光光 光光 系间窜跃系间窜跃 系间窜跃。系间窜跃。S 通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态0 l
7、l 3 的最低振动能级。的最低振动能级。l l?2 l l 1 l l 2 叠叠时，常发生电子由高能级以时，常发生电子由高能级以 无辐射跃迁方式无辐射跃迁方式转移转移 至低振动能级，而将多余的能量以至低振动能级，而将多余的能量以 热热 的形式发出。的形式发出。指指不同多重态间的无辐射跃迁不同多重态间的无辐射跃迁，例如，例如S1T1就是一种就是一种至低能级。至低能级。(二二)荧光效率及其影响因素荧光效率及其影响因素 1、荧光效率：、荧光效率：又称又称荧光量子产率，荧光量子产率，就是指激发就是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常
8、用的光子数之比，常用?f表示，表示，?f为为01，即即 发射的光量子数发射的光量子数发荧光的分子数发荧光的分子数?f f?吸收的光量子数吸收的光量子数激发态分子总数激发态分子总数 荧光效率越荧光效率越高高，辐射跃迁概率就越大，辐射跃迁概率就越大，物质发射的荧光也就越强。物质发射的荧光也就越强。K Kf f?f f?K Kf f?K Ki i2、荧光与分子结构的关系、荧光与分子结构的关系（1）跃迁类型：）跃迁类型：?*?的荧光效率的荧光效率高高，系间跨跃系间跨跃过程的速率常数小，有利于荧光的产生；过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：）共轭效应：提高共轭度提高共轭度有利于有利于增加
9、增加荧光效率并荧光效率并产生产生红移红移 含含?*跃迁能级的跃迁能级的芳香族芳香族化合物的荧光最强化合物的荧光最强 化合物（在环己烷中）化合物（在环己烷中）f /nm 苯苯 0.07 283 联苯联苯 0.18 316 对对-联三苯联三苯 0.93 342（3）刚性平面结构）刚性平面结构：可可降低降低分子分子振动振动，减少与溶剂，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：）取代基效应：芳环族化合物苯环上不同取代基芳环族化合物苯环上不同
10、取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响，可对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响，可归为下列几种类型：归为下列几种类型：第一第一 给电子基团使荧光增强给电子基团使荧光增强-OH、-NH2、-NR2、-OR；第二第二 吸电子基团会减弱甚至破坏荧光吸电子基团会减弱甚至破坏荧光-COOH、-NO2；第三第三 卤素等重原子取代基，常导致荧光减弱和磷光卤素等重原子取代基，常导致荧光减弱和磷光增强。增强。第四第四 将一个将一个高原子序数高原子序数的原子引入，常常的原子引入，常常增强磷光增强磷光而减弱荧光；而减弱荧光；第五第五 双取代和多取代较难预测，但若能增加分子的双取代和多取代较难预测，但
11、若能增加分子的平面性，则荧光增强，反之，则荧光减弱。平面性，则荧光增强，反之，则荧光减弱。3、环境因素对荧光的影响、环境因素对荧光的影响(1)溶剂的影响溶剂的影响 由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱的位置和强度都会有显著的不同在不同的溶剂中的荧光光谱的位置和强度都会有显著的不同 如如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况 溶剂溶剂 介电常数介电常数 荧光峰荧光峰/nm 荧光效率荧光效率 四氯化碳四氯化碳 2.24 390 0.002 氯仿氯仿 5.2 398 0.04
12、1 丙酮丙酮 21.5 405 0.055 乙腈乙腈 38.8 410 0.064(2)温度的影响温度的影响 荧光强度对温度变化荧光强度对温度变化 敏感敏感，一般来说，溶液的荧光强度，一般来说，溶液的荧光强度随着温度随着温度升高升高而而降低降低。(3)溶液溶液pH 带有带有酸性或碱性酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都般都与与溶液的溶液的pH有关有关，因此在荧光分析中要因此在荧光分析中要严格控制严格控制溶液的溶液的pH值。值。如如苯酚苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性溶液中，无荧光在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性溶液中，无荧光 再如再如 苯胺苯胺在在
13、pH712溶液中有蓝色荧光，而在溶液中有蓝色荧光，而在pH小于小于2大于大于13的溶液中都不发荧光。的溶液中都不发荧光。另外金属离子与有机试剂形成的另外金属离子与有机试剂形成的发光螯合物发光螯合物也受到溶液的也受到溶液的pH影响影响(4)表面活性剂的影响表面活性剂的影响 表面活性剂的存在，使得处于激发单重态的的表面活性剂的存在，使得处于激发单重态的的荧光物质分子起到保护作用，减少了非辐射跃迁几荧光物质分子起到保护作用，减少了非辐射跃迁几率，提高荧光效率。率，提高荧光效率。(5)顺磁性物质的影响顺磁性物质的影响 顺磁性物质的存在，使得处于激发单重态分子顺磁性物质的存在，使得处于激发单重态分子向三
14、重态的体系间穿越速率增大，向三重态的体系间穿越速率增大，荧光效率降低。荧光效率降低。如如O2。(6)溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭 荧光物质分子荧光物质分子与与溶剂分子溶剂分子或其他溶质分子的或其他溶质分子的相互作用相互作用引引起荧光强度起荧光强度降低降低的现象称为的现象称为荧光猝灭荧光猝灭。能引起荧光强度降低能引起荧光强度降低的物质称为的物质称为猝灭剂。猝灭剂。（1）碰撞猝灭）碰撞猝灭 M+h M*,M*+QM+热热（2）静态猝灭）静态猝灭 M+QMQ 非荧光非荧光（3）转入三重态的猝灭）转入三重态的猝灭 三重态三重态O2（4）发生电子转移反应的猝灭）发生电子转移反应的猝灭 M+Q发生电子转移
15、发生电子转移（5）荧光物质的自猝灭）荧光物质的自猝灭 荧光物质浓度较高荧光物质浓度较高(四四)荧光的激发光谱和发射光谱荧光的激发光谱和发射光谱 1.荧光荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线的激发光谱曲线 固定测量波长固定测量波长(选最大发选最大发射波长射波长)，化合物发射的荧光，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲强度与照射光波长的关系曲线线(图中曲线图中曲线I)。2.荧光荧光(磷光磷光)的发射光谱曲线的发射光谱曲线 固定激发光波长固定激发光波长(选最大激选最大激发波长发波长),化合物发射的荧光与化合物发射的荧光与发射光波长关系曲线发射光波长关系曲线(图中曲线图中曲线II)。3.激发光谱与发射光
16、谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.斯托克斯斯托克斯(Stokes)位移位移 指激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光指激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光荧光发射光谱荧光发射光谱荧光激发光谱荧光激发光谱磷光光谱磷光光谱谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。200260320380440500560室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱620b.发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如如能级图能级图l
17、l 2,l l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发，产生不同吸收带，但均回到第一激发单单重态重态的的最低振动能级最低振动能级再跃迁回到再跃迁回到基态基态，产生波长一定的，产生波长一定的荧光荧光(如如l l 2 )。S2 能 量 内转换 振动弛豫 内转换 系间窜跃 发发 射射 磷磷 光光 S1 吸吸 收收 发发 射射 荧荧 光光 T1 T2 振动弛豫 外转换 S0 l l 1 l l 2 l l?2 l l 3 c.镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与激发光谱成镜像对称关系。通常荧光发射光谱与激发光谱成镜像对称关系。荧光激发光谱荧光激发光谱 荧光发射光谱荧光发射光谱 200 250 300
18、350 400 450 500 nm 蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱 三、荧光分析仪器三、荧光分析仪器 测量荧光的仪器主要由测量荧光的仪器主要由 五个部分五个部分组成：组成：激发光源、样品激发光源、样品池、双单色器系统、检测器和显示器池、双单色器系统、检测器和显示器。特殊点：特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成有两个单色器，光源与检测器通常成直角直角。基本流程如图：基本流程如图：单色器：单色器：选择选择激发光波长激发光波长的第一单色器和选择的第一单色器和选择 发射发射光光(测量测量)波长波长的第二单色器的第二单色器 光源：光源：氙氙灯和高压灯和高压汞汞灯灯 样品池：样品池：石
19、英石英 检测器：检测器：光电倍增管。光电倍增管。四、四、定量分析方法定量分析方法 1 定量依据定量依据 当荧光物质当荧光物质浓度浓度很很小小时，荧光强度时，荧光强度If与荧光物质浓度与荧光物质浓度c之之间的关系式为间的关系式为 If=2.3 fI0bc 式中：式中：f为荧光效率，为荧光效率，I0为激发光的强度，为激发光的强度，荧光物质的摩尔荧光物质的摩尔吸收系数，吸收系数，b为试样池的光程，为试样池的光程，c为荧光物质的浓度。为荧光物质的浓度。在一定条件下，在一定条件下，f、I0、b均为常数，所以上式可写成均为常数，所以上式可写成 If=K c 即荧光强度与荧光物质的浓度即荧光强度与荧光物质的
20、浓度c成正比。成正比。荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀（极稀（A0.05）的的溶液。对于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。溶液。对于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。2 定量分析方法定量分析方法 标准曲线法：标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出未知试样的浓度；出未知试样的浓度；比较法：比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比
21、较；Fs?F0Cs?Fx?F0CxFx?F0Cx?CsFs?F0五、五、荧光分析法的应用荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂形成配合物后测量；可测量近与有机试剂形成配合物后测量；可测量近70多种元素。多种元素。配合物的生成，分子的刚性平面结构增大，使得无荧配合物的生成，分子的刚性平面结构增大，使得无荧光或荧光弱的物质转变为强荧光物质。光或荧光弱的物质转变为强荧光物质。二二 元元 配配 合合 物物 三三 pH=5.0,与与Al3+黄绿色荧光物黄绿色荧光物 元元 荧光镓荧光镓 pH=3.0,与与Ga3+黄色荧光物黄色荧光物 配配 与硼酸盐与硼酸盐绿蓝色荧光物绿蓝色荧光
22、物 合合 安息香安息香 碱性介质中碱性介质中 物物 2+与与Zn绿色荧光物绿色荧光物 罗丹明罗丹明B +Au3+、Ga3+等与等与Cl-、Br-等先形成二元络合物等先形成二元络合物(2)有机化合物的分析有机化合物的分析 芳香族化合物芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发具有共轭的不饱和结构，多能发生荧光，可以生荧光，可以直接直接进行荧光测定；而进行荧光测定；而脂肪族化合物脂肪族化合物的分子结构较简单，本身能发荧光的很少，须与某的分子结构较简单，本身能发荧光的很少，须与某些试剂些试剂反应后反应后才能进行分析。才能进行分析。如：测定丙三醇如：测定丙三醇 芳香族化合物适当的与某些试剂作用后测定可芳
23、香族化合物适当的与某些试剂作用后测定可提高灵敏度。提高灵敏度。第二节第二节 磷光分析法磷光分析法?磷光是从亚稳的三重态跃迁至基态时所产生的辐射磷光是从亚稳的三重态跃迁至基态时所产生的辐射?分子磷光分析法是依据分子分子磷光分析法是依据分子 磷光光谱磷光光谱进行进行定性定性，以，以磷光强度磷光强度进行进行定量定量的一种分析方法。的一种分析方法。?与荧光相比，磷光具有两个特点与荧光相比，磷光具有两个特点 （1）磷光辐射的波长比荧光长）磷光辐射的波长比荧光长（2）磷光的寿命比荧光长）磷光的寿命比荧光长 一、基本原理一、基本原理 1.1.磷光强度与磷光物质浓度的关系磷光强度与磷光物质浓度的关系 当磷光物
24、质浓度很小时，磷光强度当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质与磷光物质浓度浓度c之间的关系式为之间的关系式为 Ip=2.3 pI0bc 式中：式中：p为磷光效率，为磷光效率，I0为激发光的强度，为激发光的强度，磷光物磷光物质的摩尔吸收系数，质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程。为试样池的光程。在一定条件下，在一定条件下，p、I0、b均为常数，所以均为常数，所以上式可写成：上式可写成：Ip=Kc 即磷光强度与磷光物质的即磷光强度与磷光物质的浓度浓度c成正比。成正比。2.温度对磷光强度的影响温度对磷光强度的影响 随着温度的降低，磷光逐渐增强。随着温度的降低，磷光逐渐增强。低温磷光低温磷光:用液
25、氮作冷却剂用液氮作冷却剂 3.重原子效应重原子效应 使用含有使用含有重原子重原子的溶剂或在磷光物质中引入的溶剂或在磷光物质中引入 重原子取代基，都可以重原子取代基，都可以 提高提高磷光物质的磷光物质的磷光强度磷光强度，这种效应称作重原子效应。这种效应称作重原子效应。机理：机理：重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使作用，从而使S1T1的体系间窜跃概率增大，有的体系间窜跃概率增大，有利于增大磷光效率。利于增大磷光效率。4.室温磷光室温磷光 由于低温磷光需要低温实验
26、装置、溶剂选择由于低温磷光需要低温实验装置、溶剂选择 的限制，发展了以下几种室温磷光法：的限制，发展了以下几种室温磷光法：（1）固体表面室温磷光法）固体表面室温磷光法 基于测量室温下基于测量室温下吸附吸附于固体基质于固体基质(载体载体)上的上的有机化合物所发射的磷光。理想的载体是既能有机化合物所发射的磷光。理想的载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加刚性，并减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活刚性，并减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷光背景。化过程，而本身又不产生磷光背景。（2）胶束增稳的溶液室温磷光法）胶束增稳的溶液室温磷
27、光法 当向溶液中加入适量的当向溶液中加入适量的表面活性剂表面活性剂，形成，形成胶胶 束束，由于胶束的多相性，改变了，由于胶束的多相性，改变了磷光团磷光团的微环境的微环境 和定向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理和定向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理 性质，性质，减小减小了内转化和碰撞了内转化和碰撞能量损失能量损失等非辐射去等非辐射去 活化过程的趋势，明显增加了三重态的稳定性，活化过程的趋势，明显增加了三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测量室温磷光。从而可以实现在溶液中测量室温磷光。二二.磷光分析仪磷光分析仪 和荧光分析仪器基本相似。在荧光分光光度计上和荧光分析仪器基本相似。在荧光分光光
28、度计上 配上磷光附件后，即可用于磷光定量。配上磷光附件后，即可用于磷光定量。（1）试样室）试样室 将试样放在盛将试样放在盛液氮液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于的石英杜瓦瓶内，即可用于低温低温 磷光测定。磷光测定。（2）磷光镜）磷光镜 有些物质有些物质同时同时会发生会发生荧光和磷光荧光和磷光，为了能在同时有，为了能在同时有 荧光现象的体系中测定磷光，通常必须在激发光单色器荧光现象的体系中测定磷光，通常必须在激发光单色器 和液槽之间以及在液槽和发射光单色器之间各装一个和液槽之间以及在液槽和发射光单色器之间各装一个斩斩 波片波片，并由一个同步马达带动，这种装置称作，并由一个同步马达带动，这种装置称作磷光
29、镜磷光镜。三、磷光分析法的应用三、磷光分析法的应用 磷光分析法在无机化合物的测定中应用较少，磷光分析法在无机化合物的测定中应用较少，它它主要主要用于测定用于测定有机化合物有机化合物。(1)稠环芳烃分析稠环芳烃分析 采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）芳烃和杂环化合物（致癌物质）(2)农药、生物碱、植物生长激素的分析农药、生物碱、植物生长激素的分析(3)药物分析药物分析 见下表见下表 第三节第三节 化学发光分析化学发光分析 一、概述一、概述 化学发光化学发光 某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生某些物质在进行
30、化学反应过程中，由于吸收了反应产生的的化学能化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光化学发光。化学发光反应存在于生物体化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物萤火虫、海洋发光生物)中中，称，称生物发光生物发光(bioluminescence)。化学发光分析化学发光分析 利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法。析方法。特点特点 characteristics 1.灵敏度极高灵敏度极高 例
31、：荧光素酶和磷酸三腺甙例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测的化学发光分析，可测定定2?10-17mol/L的的ATP，即可检测出，即可检测出一个细菌中一个细菌中的的ATP含量。含量。2.线性范围宽线性范围宽 一般有一般有56个数量级个数量级 3.分析速度快分析速度快 流动注射化学发光测大于流动注射化学发光测大于 100个样个样/h 4.仪器设备简单仪器设备简单 无背景光、散射光等干扰；不需要光源、单色器和背景无背景光、散射光等干扰；不需要光源、单色器和背景校正；校正；缺点：缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中
32、的发光）；机理研究少。物体中的发光）；机理研究少。二、基本原理二、基本原理 (一一)化学发光反应条件化学发光反应条件 在化学反应过程中，在化学反应过程中，某些反应产物接受化学能而被激发某些反应产物接受化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A +B =C +D*D*D+h?（1）能）能快速快速地释放出地释放出足够足够的能量。能产生化学发光的物质大的能量。能产生化学发光的物质大多为有机化合物，芳香族化合物；化学发光反应多为多为有机化合物，芳香族化合物；化学发光反应多为 氧化还氧化还原反应原反应，激发能与，激发能与反应能反应能相当相当，?E
33、=170300 kJ/mol；发光；发光位于可见光区；位于可见光区；（2）反应历程有利于激发态产物的形成；）反应历程有利于激发态产物的形成；（3）激发态分子能够以）激发态分子能够以辐射跃迁辐射跃迁的方式返回基态；的方式返回基态；(二二)化学发光效率和发光强度化学发光效率和发光强度 发射光子的分子数发射光子的分子数?c c l l?r r?f f参加反应的分子数参加反应的分子数激发态分子数激发态分子数化学效率：化学效率：?r r?参加反应的分子数参加反应的分子数发射光子的分子数发射光子的分子数发光效率：发光效率：f f?激发态分子数激发态分子数 化学效率化学效率主要取决于发光所依赖的主要取决于发
34、光所依赖的 化学反应本身化学反应本身；而；而发光效率发光效率则取决于则取决于发光体本身发光体本身的结构和性质，的结构和性质，也受也受环境环境的影响。的影响。发光强度发光强度 化学发光反应的发光强度化学发光反应的发光强度Icl是以单位时间内发射的光子是以单位时间内发射的光子数表示，它与化学发光反应的速率有关。数表示，它与化学发光反应的速率有关。时刻时刻t 的化学发光强度的化学发光强度(单位时间发射的光量子数单位时间发射的光量子数)：dcdcI Ic cl l?t t?c cl l?dtdt 如果反应是一级动力学反应，如果反应是一级动力学反应，t时刻的化学发光强度时刻的化学发光强度Icl与与该时刻
35、的分析物浓度该时刻的分析物浓度c成正比，即化学发光峰值强度与分析成正比，即化学发光峰值强度与分析物浓度物浓度c成线性关系。在化学发光分析中，常用已知时间内成线性关系。在化学发光分析中，常用已知时间内的的发光总强度发光总强度来进行定量分析。来进行定量分析。A A?I Ic c l l?t t?dtdt?c cl l?0 0t tt t0 0dcdcdtdt?c cl l?c cdtdt(三三)化学发光反应的类型化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应）气相化学发光反应 主要有主要有O3，NO，S的化学发光反应，可用于监测的化学发光反应，可用于监测空气中的空气中的O3，NO，NO2，H2S，SO2
36、和和CO等。等。a.一氧化氮与一氧化氮与O3的发光反应的发光反应 NO +O3 NO2*+O2 NO2*NO2+h?发射的光谱范围：发射的光谱范围：600875nm，灵敏度，灵敏度1ng/cm-3；b.乙烯与乙烯与O3的发光反应的发光反应 乙烯与乙烯与O3反应，生成激发态甲醛：反应，生成激发态甲醛：CH2O*CH2O+h?最大发射波长：最大发射波长：435nm；对；对O3的特效反应；线性响应的特效反应；线性响应范围范围1 ng/cm-3 1?g/cm-3；（2）液相中的化学发光反应）液相中的化学发光反应 机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O
37、2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Au、Th等。等。应用最多的发光试剂：应用最多的发光试剂：鲁米诺（鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：化学发光反应效率：0.150.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：（1）该发光反应速度慢，某些该发光反应速度慢，某些金属离子金属离子可可催化催化反应；利用反应；利用这一现象可这一现象可间接测定间接测定这些金属离子。可测痕量的这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等等（2）可检测低至可检测低至
38、10-9 mol/L 的的H2O2；（3）间接测定某些生物试样间接测定某些生物试样 氨基酸氨基酸 +O2?酮酸酮酸 +NH3 +H2O2 葡萄糖葡萄糖 +O2+H2O?葡萄糖酸葡萄糖酸 +H2O2 通过测定生成的通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。，确定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶 二、化学发光分析的仪器二、化学发光分析的仪器 装置流程：装置流程：发光反应室发光反应室 光检测器光检测器 信号放大器信号放大器 显示与记录显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：静态方式：静态方式：用注射器分别
39、将试剂加入到反应器中混合，用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或测最大光强度或总发光强度总发光强度；试样量小，重复性差；试样量小，重复性差；流动注射方式：流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时定时通过测量室，连续发光，测定通过测量室，连续发光，测定最大光强度最大光强度；试样量大；试样量大；本章小结本章小结 一一.荧光与磷光的产生荧光与磷光的产生 辐射跃迁辐射跃迁：荧光及磷光：荧光及磷光;非辐射跃迁非辐射跃迁：振动弛豫，系间窜越，内转换，外转换；：振动弛豫，系间窜越，内转换，外转换；激发光谱与发射光谱激发光谱与发射光谱;荧光量子产率荧
40、光量子产率 Kf发荧光的分子数?f?激发态分子总数K?Kfi 荧光效率与物质分子结构的关系荧光效率与物质分子结构的关系：跃迁类型，共轭：跃迁类型，共轭 效应，刚性平面结构，取代基效应效应，刚性平面结构，取代基效应;荧光效率与环境因素的关系荧光效率与环境因素的关系：溶剂，温度，：溶剂，温度，pHpH。?二二.荧光与磷光分析法荧光与磷光分析法 仪器结构仪器结构：两个单色器，光源与检测器成直角：两个单色器，光源与检测器成直角 定量依据与方法定量依据与方法：If=Kc,Ip=Kc 应用应用：定量，有机，无机：定量，有机，无机 三三.化学发光分析化学发光分析 化学发光的产生化学发光的产生 化学发光效率化
41、学发光效率cl=rf 总发光强度与浓度的关系：总发光强度与浓度的关系：A=clc=Kc 化学发光装置化学发光装置 发光反应室光检测器信号放大显示发光反应室光检测器信号放大显示 本章作业：本章作业：p65-66：1，2，5，7。练习练习 B 1.下列哪种去激发过程是分子荧光发射过程？下列哪种去激发过程是分子荧光发射过程？A分子从第一激发单重态的各振动能级跃迁回基态；分子从第一激发单重态的各振动能级跃迁回基态；B分子从第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态；分子从第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态；C分子从第一激发三重态的各振动能级跃迁回基态；分子从第一激发三重态的各振动能级跃迁回基态；D分子
42、从第一激发三重态的最低振动能级跃迁回基态；分子从第一激发三重态的最低振动能级跃迁回基态；2.下列说法中，正确的是哪一个？下列说法中，正确的是哪一个？D A能发荧光的物质一般具有杂环化合物的刚性结构；能发荧光的物质一般具有杂环化合物的刚性结构；B能发荧光的物质一般具有大环化合物的刚性结构；能发荧光的物质一般具有大环化合物的刚性结构；C能发荧光的物质一般具有对称性质的环状结构；能发荧光的物质一般具有对称性质的环状结构；D能发荧光的物质一般具有能发荧光的物质一般具有共轭体系的刚性结构；共轭体系的刚性结构；3.在下列的四种说法中，哪一种是不正确的？在下列的四种说法中，哪一种是不正确的？C A.分子荧光
43、发射光谱通常与吸收光谱互为镜像关系；分子荧光发射光谱通常与吸收光谱互为镜像关系；B.分子荧光发射光谱与激发波长没有关系；分子荧光发射光谱与激发波长没有关系；C.分子荧光发射光谱随激发波长不同而变化；分子荧光发射光谱随激发波长不同而变化；D.分子荧光发射的强度与激发光的强度成正比的关系。分子荧光发射的强度与激发光的强度成正比的关系。4.在分子荧光测量中，要使荧光强度正比于荧光物质在分子荧光测量中，要使荧光强度正比于荧光物质 的浓度，必要的条件是什么？的浓度，必要的条件是什么？D A.用高灵敏的检测器；用高灵敏的检测器；B.在最大的量子产率下测量；在最大的量子产率下测量；C.在最大的摩尔吸光系数下
44、测量；在最大的摩尔吸光系数下测量；D.在稀溶液中测量。在稀溶液中测量。5.分子荧光的发射波长比激发波长大还是小？为什么？分子荧光的发射波长比激发波长大还是小？为什么？A A大；因为去激发过程中存在各种形式的无辐射跃迁，损大；因为去激发过程中存在各种形式的无辐射跃迁，损失一部分能量；失一部分能量；B小；因为激发过程中，分子吸收一部分外界能量；小；因为激发过程中，分子吸收一部分外界能量；C相同；因为激发和发射在同样的能级上跃迁，只是过程相同；因为激发和发射在同样的能级上跃迁，只是过程相反；相反；D不一定；因为其波长的大小受到测量条件的影响。不一定；因为其波长的大小受到测量条件的影响。6.同一荧光同
45、一荧光(磷光磷光)物质的最大激发波长物质的最大激发波长 ，最大荧光发射，最大荧光发射波长波长 ，最大磷光发射波长，最大磷光发射波长 的大小顺序为：的大小顺序为：D A.A.emem?C.C.emem?P PexexF FexexP PexexB.B.?ememD.D.?ememP PexexF FexexF FexexP PexexF Fexex7.下列四种物质，具有较强荧光的是哪一种？C A；B；C；D。8.分子荧光分析法比紫外可见分光光度法灵敏度高，检测限分子荧光分析法比紫外可见分光光度法灵敏度高，检测限低低24数量级，其主要原因有两方面，即：数量级，其主要原因有两方面，即：D A荧光发射
46、的量子产率高；荧光物质的摩尔吸光系数大；荧光发射的量子产率高；荧光物质的摩尔吸光系数大；B荧光发射的量子产率高；荧光信号是在暗背景下测量的；荧光发射的量子产率高；荧光信号是在暗背景下测量的；C荧光物质的摩尔吸光系数大；提高激发光的强度可以提高荧光物质的摩尔吸光系数大；提高激发光的强度可以提高荧光的强度；荧光的强度；D荧光信号是在暗背景下测量的；提高激发光的强度可以提荧光信号是在暗背景下测量的；提高激发光的强度可以提高荧光的强度。高荧光的强度。9.荧光计与分光光度计的主要不同是什么？磷光计与荧光计的荧光计与分光光度计的主要不同是什么？磷光计与荧光计的主要差别是什么？主要差别是什么？B A光路设计
47、不同；光路设计不同；光路设计不同；光路设计不同；B光路设计不同；磷光计比荧光计多装有液氮的杜瓦瓶及斩波器；光路设计不同；磷光计比荧光计多装有液氮的杜瓦瓶及斩波器；C检测器不同；磷光计比荧光计多装有液氮的杜瓦瓶及斩波器；检测器不同；磷光计比荧光计多装有液氮的杜瓦瓶及斩波器；D检测器不同；光路设计不同。检测器不同；光路设计不同。10.下列说法哪一个是正确的？下列说法哪一个是正确的？B A化学发光是通过化学反应产生光致发光物质所发射的光；化学发光是通过化学反应产生光致发光物质所发射的光；B化学发光是吸收化学反应的化学能使分子激发所发射的光；化学发光是吸收化学反应的化学能使分子激发所发射的光；C化学发光是吸收光能引起化学反应产生发光物质所发射的光；化学发光是吸收光能引起化学反应产生发光物质所发射的光；D化学发光是吸收外界能引起化学反应产生发光物质所发射的光。化学发光是吸收外界能引起化学反应产生发光物质所发射的光。11.下列各组化合物或不同条件中，预测哪一种荧光产率高？下列各组化合物或不同条件中，预测哪一种荧光产率高？为什么？为什么？(1)偶氮苯偶氮苯 二氮杂菲二氮杂菲 （2）(4)
