1、第五章 诱变育种第一节第一节 突变的类型突变的类型一、突变的类型一、突变的类型点突变点突变 移码突变移码突变 染色体畸变染色体畸变二、生物体对突变的修复二、生物体对突变的修复光复活光复活 切除修复切除修复 SOS修复系统修复系统诱变育种中常用的名词 基因型和表现型基因型和表现型 野生型和突变型野生型和突变型 抗性突变型抗性突变型 营养缺陷型营养缺陷型 突变概率突变概率第二节 诱变剂的类型及其使用一、物理诱变一、物理诱变1、诱变剂种类和诱变的原理：、诱变剂种类和诱变的原理：电磁辐射电磁辐射引起生物引起生物DNA损伤或断裂，修复时发生错误拼接与复损伤或断裂，修复时发生错误拼接与复制，辐射后代表现型
2、产生变异，对于可遗传的变异可制，辐射后代表现型产生变异，对于可遗传的变异可以加以选择。以加以选择。（1）紫外线：波长）紫外线：波长200-390nm，低能电磁辐射。，低能电磁辐射。激发原子外层电子电磁辐射，非电离辐射。激发原子外层电子电磁辐射，非电离辐射。穿透力弱，只适用于单细胞组织或微生物穿透力弱，只适用于单细胞组织或微生物（2）X 射线：波长射线：波长1nm以下，核外电磁辐射，以下，核外电磁辐射，原子中激发态跃迁到低能态产生射原子中激发态跃迁到低能态产生射线。线。射线特性取决于工作电压和靶材料射线特性取决于工作电压和靶材料（钨、钼）（钨、钼）软软X 射线：射线：0.1-1nm，穿透力弱，穿
3、透力弱(mm)，（微效突变），（微效突变）硬硬X 射线：射线：0.001-0.1nm，穿透力，穿透力(cm)，早期常用，早期常用于诱变育种于诱变育种 高能高能X 射线：射线：10-8-10-3nm，穿透力强，穿透力强（3）射线：波长小于射线：波长小于10-3 nm，核内电离辐射，能量，核内电离辐射，能量高，穿透力强（高，穿透力强（cm)。最常用的物理诱变剂，最常用的物理诱变剂，60%诱变育成品种是利用诱变育成品种是利用 射射线线 防护：水泥墙体、铅板、金属离子溶液、水体等防护：水泥墙体、铅板、金属离子溶液、水体等 辐射源：辐射源：60Co：由非放射性金属钴在中子反应堆中：由非放射性金属钴在中子
4、反应堆中形成；半衰期形成；半衰期5.3年年137Cs：铀裂变产生，半衰期：铀裂变产生，半衰期30年，能量是年，能量是60Co 的一的一半半 处理方式：外照射处理方式：外照射 慢照射：低剂量长时间（几天至整个生育期）的照射慢照射：低剂量长时间（几天至整个生育期）的照射 急照射：高剂量短时间内完成；急照射：高剂量短时间内完成；粒子辐射粒子辐射（4）射线：放射性同位素射线：放射性同位素 32P、35S、14C、131I 穿透力远小于穿透力远小于r 射线（射线（mm）、但电离密度大）、但电离密度大 内照射：同位素溶液浸泡、注射处理，常用内照射：同位素溶液浸泡、注射处理，常用32P（半（半衰期短）衰期短
5、）射线：氦的原子核。穿透力更弱，电离密度更大。射线：氦的原子核。穿透力更弱，电离密度更大。对有机体内产生严重的损伤，诱发染色体断裂的能力对有机体内产生严重的损伤，诱发染色体断裂的能力很强。很强。中子：外照射中子：外照射（5 5）航天育种：航天育种：利用太空微重力、高能粒子、高真空、缺氧和交变磁利用太空微重力、高能粒子、高真空、缺氧和交变磁场等综合物理诱变因子进行诱变和选择育种研究。场等综合物理诱变因子进行诱变和选择育种研究。我国于我国于19871987年开始进行航天搭载育种，由此育成了大年开始进行航天搭载育种，由此育成了大田作物、蔬菜和花卉作物、微生物新品种。田作物、蔬菜和花卉作物、微生物新品
6、种。特点：诱变作用强、变异幅度大、微突变类型多和有特点：诱变作用强、变异幅度大、微突变类型多和有益变异多等优点，益变异多等优点，因此对于产量和品质等经济性状改良作用大。因此对于产量和品质等经济性状改良作用大。2、影响辐射效果的因素、影响辐射效果的因素 原则：目标性状突变率大；诱变当代（原则：目标性状突变率大；诱变当代（M1）死亡率低）死亡率低 微生物诱变剂敏感性微生物诱变剂敏感性 不同目的性状的最佳诱变剂量不同不同目的性状的最佳诱变剂量不同 照射剂量控制照射剂量控制二、化学诱变二、化学诱变 1943年首先发现脲烷诱发月见草、百合等染色体畸变年首先发现脲烷诱发月见草、百合等染色体畸变 1948年
7、，年，Gustafsson等曾用芥子气处理大麦获得突变体等曾用芥子气处理大麦获得突变体 1、诱变剂种类和诱变原理：、诱变剂种类和诱变原理：（1）烷化剂：带有一个或多个烷基烷化剂：带有一个或多个烷基 在在碱性条件碱性条件下，置换碱基（下，置换碱基（G）中的氧原子，）中的氧原子，烷化碱基烷化碱基 烷化烷化DNA中的磷酸中的磷酸 酸性条件没有诱变能力，但引起生理伤害酸性条件没有诱变能力，但引起生理伤害 毒性大，能致癌，易挥发，使用时必须注意通风毒性大，能致癌，易挥发，使用时必须注意通风 主要烷化剂：主要烷化剂：甲基磺酸乙酯（甲基磺酸乙酯（EMS）硫酸二乙酯（硫酸二乙酯（DES）乙烯亚胺（乙烯亚胺（E
8、I）亚硝基乙基脲（烷）亚硝基乙基脲（烷）（2）叠氮化钠）叠氮化钠 等电点等电点PI 4.8，在酸性条件下，产生，在酸性条件下，产生NH3，替，替代碱基上其它基团（氨基化）影响代碱基上其它基团（氨基化）影响DNA的正常合的正常合成，它只作用于复制中的成，它只作用于复制中的DNA 充氧溶液提高诱变效果充氧溶液提高诱变效果 诱变效果较好，使用较为安全诱变效果较好，使用较为安全 碱性条件下无效碱性条件下无效 对多倍体无效对多倍体无效（3）碱基类似物）碱基类似物 DNA 碱基的化学结构相类似的一些物质碱基的化学结构相类似的一些物质 渗入渗入DNA取代原有碱基，导致碱基错配取代原有碱基，导致碱基错配 5-
9、溴尿嘧啶（溴尿嘧啶（5BU）和）和5-溴脱氧尿核苷溴脱氧尿核苷 （BUdR）是胸腺嘧啶（）是胸腺嘧啶（T）的类似物；的类似物；2-氨基嘌呤（氨基嘌呤（2-AP）是腺嘌呤（）是腺嘌呤（A）的类似物）的类似物 2、化学诱变剂的特点：、化学诱变剂的特点：诱发突变率较高，点突变多，染色体损伤诱发突变率较高，点突变多，染色体损伤轻，不引起染色体断裂；轻，不引起染色体断裂；生理代谢损伤大，容易引起生活力和可育性生理代谢损伤大，容易引起生活力和可育性下降；下降；使用所需的设备比较简单，成本较低，诱变使用所需的设备比较简单，成本较低，诱变效果较好；效果较好；对人体更具有危险性对人体更具有危险性第三节第三节 育
10、种的步骤和方法育种的步骤和方法诱变育种诱变育种是通过诱变剂处理提高菌种的突变几率，是通过诱变剂处理提高菌种的突变几率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株。诱变育种和其他育种方法比较，株。诱变育种和其他育种方法比较，具有速度快、具有速度快、收效大、方法简便等优点收效大、方法简便等优点，是当前菌种选育的一，是当前菌种选育的一种重要方法。在生产中应用得十分普遍。但是诱种重要方法。在生产中应用得十分普遍。但是诱发突变发突变缺乏定向性缺乏定向性，因此诱发突变必须与大规模，因此诱发突变必须与大规模的筛选工作相配后才能收到良好的效果。以下分的筛选工作相配后
11、才能收到良好的效果。以下分别叙述别叙述诱变育种工作流程诱变育种工作流程和和诱变育种工作中的三诱变育种工作中的三个重要环节个重要环节：突变的诱发、突变株的筛选、突变突变的诱发、突变株的筛选、突变基因的表达。基因的表达。一、诱变育种的工作流程一、诱变育种的工作流程诱变过程诱变过程筛选过程筛选过程二、突变的诱发二、突变的诱发三、突变株的筛选三、突变株的筛选四、突变基因的表达四、突变基因的表达 一、诱变育种的工作流程一、诱变育种的工作流程原始菌种原始菌种纯化纯化斜面斜面/肉汤培养肉汤培养单孢子单孢子/单细胞悬液单细胞悬液诱变剂处理诱变剂处理平板分离平板分离移至斜面移至斜面小试小试中试中试初筛初筛复筛复
12、筛计算存活率计算存活率观察形态变异，挑观察形态变异，挑单菌落单菌落良种保藏良种保藏原菌种特性鉴定原菌种特性鉴定（一）诱变过程（一）诱变过程 由出发菌种开始，制出新鲜孢子悬浮液由出发菌种开始，制出新鲜孢子悬浮液（或细菌悬浮液）作诱变处理，然后以一定稀释度（或细菌悬浮液）作诱变处理，然后以一定稀释度涂布平板，至平板上长出单菌落为止的各步骤为诱涂布平板，至平板上长出单菌落为止的各步骤为诱变过程。简述如下：变过程。简述如下：（1 1）菌种的斜面）菌种的斜面 出发菌种的斜面非常重要，其出发菌种的斜面非常重要，其培养工艺最好是经过试验已知的最佳培养基和培养培养工艺最好是经过试验已知的最佳培养基和培养条件。
13、要选取对诱变剂最敏感的斜面种龄，要求孢条件。要选取对诱变剂最敏感的斜面种龄，要求孢子数量适中。子数量适中。（2 2）单孢子悬浮液制备）单孢子悬浮液制备要求：要求：菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长；细胞分散且为单细胞，以避免细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象表型迟延现象（phenotypic lag）;方法：方法：玻璃珠打散玻璃珠打散10-15min;加加.3%吐温吐温80（表面活性剂）（表面活性剂）用无菌脱脂棉过滤。用无菌脱脂棉过滤。制备：制备：物理诱变剂物理诱变剂生理盐水（生理盐水（0.85%NaCl)化学诱变剂化学诱变剂缓冲液缓冲液 浓
14、度：浓度：细菌、放线菌细菌、放线菌 108个个/ml 霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌 106个个/ml表型迟延现象表型迟延现象:指某一突变在指某一突变在DNA复制和细胞复制和细胞分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌分裂后，才在表型上显示出来，造成不纯的菌落。落。产生原因：产生原因：分离性迟延现象分离性迟延现象生理性迟延现象生理性迟延现象（3 3）孢子计数）孢子计数 诱变处理前后的孢诱变处理前后的孢子悬液要孢子计数，以控制孢子悬液子悬液要孢子计数，以控制孢子悬液的孢子数和统计诱变致死率，常用于的孢子数和统计诱变致死率，常用于诱变处理的孢子悬液浓度为诱变处理的孢子悬液浓度为10105 510108
15、8个孢子个孢子/毫升。毫升。孢子计数采用血球计数法在显孢子计数采用血球计数法在显微镜下直接计数。微镜下直接计数。诱变致死率采用平板活菌计数诱变致死率采用平板活菌计数来测定。来测定。（4 4）单菌落分离）单菌落分离 平皿内倾入平皿内倾入2020毫升左毫升左右的培养基，凝固后，加入一定量经诱右的培养基，凝固后，加入一定量经诱变处理的孢子液（以控制每一平皿生长变处理的孢子液（以控制每一平皿生长1010 5050个菌落为合适的量），用刮棒涂个菌落为合适的量），用刮棒涂布均匀后进行培养。布均匀后进行培养。（二）筛选过程（二）筛选过程 诱变处理的孢子，经单菌落分离诱变处理的孢子，经单菌落分离长出单菌落后，
16、长出单菌落后，随机随机挑选单菌落进行挑选单菌落进行生产能力测定。每一被挑选的单菌落生产能力测定。每一被挑选的单菌落传种斜面后，在模拟发酵工艺的摇瓶传种斜面后，在模拟发酵工艺的摇瓶中培养，然后测定其生产能力。筛选中培养，然后测定其生产能力。筛选过程主要包括过程主要包括传种斜面传种斜面、菌株保藏菌株保藏和和筛选高产菌株筛选高产菌株这三项工作。这三项工作。（1 1）传种斜面）传种斜面 主要挑选生长良好的正常形态主要挑选生长良好的正常形态的菌落传种斜面，并可适当挑选少数形态或色的菌落传种斜面，并可适当挑选少数形态或色素有变异的菌落。经诱变处理，形态严重变异素有变异的菌落。经诱变处理，形态严重变异的往往
17、为低产菌株。的往往为低产菌株。（2 2）留种保藏菌种）留种保藏菌种 经筛选挑出的比对照生产经筛选挑出的比对照生产能力高能力高10%10%以上的菌株，要制成沙土管或冷冻以上的菌株，要制成沙土管或冷冻管留种保藏。管留种保藏。留种保藏菌种这一步骤很重要，有此一步留种保藏菌种这一步骤很重要，有此一步可保证高产菌株不会得而复失，复筛结果比较可保证高产菌株不会得而复失，复筛结果比较可靠也符合生产过程的特点。可靠也符合生产过程的特点。（3 3）筛选高产菌株）筛选高产菌株 诱变处理后的孢子传种斜面后，进行生产能力诱变处理后的孢子传种斜面后，进行生产能力测试筛选。为了获得优良菌株，初筛菌株的量要大，测试筛选。为
18、了获得优良菌株，初筛菌株的量要大，发酵和测试的条件可粗放一些。发酵和测试的条件可粗放一些。例如可以采用琼脂块筛选法进行初筛，也可以采用例如可以采用琼脂块筛选法进行初筛，也可以采用一个菌株进一个摇瓶的方法进行初筛。一个菌株进一个摇瓶的方法进行初筛。随着以后一随着以后一次一次的复筛，对发酵和测试的要求应逐步提高，次一次的复筛，对发酵和测试的要求应逐步提高，复筛一般每个菌株进复筛一般每个菌株进3 35 5个摇瓶，如果生产能力继个摇瓶，如果生产能力继续保持优异，再重复几次复筛。初筛和复筛均需有续保持优异，再重复几次复筛。初筛和复筛均需有出发菌株作对照以比较生产能力是否优良。复筛后，出发菌株作对照以比较
19、生产能力是否优良。复筛后，对于有发展前途的优良菌株，可考察其稳定性、菌对于有发展前途的优良菌株，可考察其稳定性、菌种特性和最适培养条件等。种特性和最适培养条件等。第一轮：第一轮：一个出发菌株一个出发菌株选出选出200个菌株个菌株选出选出50株株选出选出5株株诱变处理初筛（每瓶一株）复筛（每瓶四株）第二轮：第二轮：5个出发菌株个出发菌株 选出选出50株株 选出选出5株株40株株40株株40株株40株株40株株诱变处理初筛复筛（每瓶一株）（每瓶四株）高效简单的筛选方法高效简单的筛选方法二、突变的诱发二、突变的诱发突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种
20、的生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。（一）出发菌株的选择（一）出发菌株的选择出发菌株就是用来进行诱变试验的菌株。出发菌株出发菌株就是用来进行诱变试验的菌株。出发菌株的选择是诱变育种工作成败的关键。出发菌株的性的选择是诱变育种工作成败的关键。出发菌株的性能，如菌种的纯一性、菌种系谱、菌种的形态、生能，如菌种的纯一性、菌种系谱、菌种的形态、生理、传代、保存等特性，对诱变效果影响很大。挑理、传代、保存等特性，对诱变效果影响很大。挑选出发菌株有如下几点经验。选出发菌株有如下几点经验。1选择纯种作为出发菌株选择纯种作为出发菌株2选择遗传特性好的菌株为出发选择遗传
21、特性好的菌株为出发菌株菌株3选择对诱变剂敏感的菌株为出发菌选择对诱变剂敏感的菌株为出发菌株株1 1选择纯种作为出发菌株选择纯种作为出发菌株选择选择纯种纯种作为出发菌株就是选择遗传性状稳定的菌作为出发菌株就是选择遗传性状稳定的菌株为出发菌株。株为出发菌株。采用纯种可以排除异核体的影响，获得较好的育种效果。在采用纯种可以排除异核体的影响，获得较好的育种效果。在柱晶白霉素产生菌选育过程中，采用不纯的出发菌株，经过柱晶白霉素产生菌选育过程中，采用不纯的出发菌株，经过36代诱变，发酵单位提高幅度不大，仅由代诱变，发酵单位提高幅度不大，仅由30u/m1提高到提高到20002500u/m1。而采用去除异核体
22、的纯出发菌株后，经。而采用去除异核体的纯出发菌株后，经过过32代诱变，可由代诱变，可由30u/m1提高到提高到12000u/m1。选择纯种作为。选择纯种作为出发菌株，从宏观上讲，就是要选择发酵产量稳定、产量波出发菌株，从宏观上讲，就是要选择发酵产量稳定、产量波动范围小的菌株为出发菌株。如果出发菌株遗传性不纯可动范围小的菌株为出发菌株。如果出发菌株遗传性不纯可以先用自然分离或用缓和的诱变剂进行处理，取得纯种作为以先用自然分离或用缓和的诱变剂进行处理，取得纯种作为出发菌株。这样虽然要花一些时间，但育种效果更好。出发菌株。这样虽然要花一些时间，但育种效果更好。2 2选择遗传特性好的菌株为出发菌株选择
23、遗传特性好的菌株为出发菌株选择出发菌株，不仅是选产量高的还应该考虑选择出发菌株，不仅是选产量高的还应该考虑其他与生产工艺、产品质量有关的因素，如产孢其他与生产工艺、产品质量有关的因素，如产孢子多，色素少，生长速度快等有利于发酵产物合子多，色素少，生长速度快等有利于发酵产物合成的性状。特别重要的是选择的出发菌株应当具成的性状。特别重要的是选择的出发菌株应当具有我们所需要的代谢特性。有我们所需要的代谢特性。例如，适合补料工艺的高产菌株是从糖、氮例如，适合补料工艺的高产菌株是从糖、氮代谢速度较快的出发菌株得来的。用生命力旺盛代谢速度较快的出发菌株得来的。用生命力旺盛而发酵产量又不很低的形态回复突变株
24、作为出发而发酵产量又不很低的形态回复突变株作为出发菌株，常可收到好的效果。菌株，常可收到好的效果。3 3选择对诱变剂敏感的菌株为出发菌株选择对诱变剂敏感的菌株为出发菌株选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株，不但选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株，不但可以提高变异频率，而且高产突变株的出现几可以提高变异频率，而且高产突变株的出现几率也大。生产中经过长期选育的菌株，有时会率也大。生产中经过长期选育的菌株，有时会对诱变剂不敏感。在此情况下，应设法改变菌对诱变剂不敏感。在此情况下，应设法改变菌株的遗传型，以提高菌株对诱变剂的敏感性。株的遗传型，以提高菌株对诱变剂的敏感性。杂交、诱发抗性突变和采用大剂量的
25、诱变剂处杂交、诱发抗性突变和采用大剂量的诱变剂处理均能改变菌株的遗传型而提高菌株对诱变剂理均能改变菌株的遗传型而提高菌株对诱变剂的敏感性。的敏感性。（二）诱变剂的选择（二）诱变剂的选择诱变剂的选择主要是根据已经成功的经验诱变剂的选择主要是根据已经成功的经验。诱变作用不但决定于诱变剂，还与出发菌诱变作用不但决定于诱变剂，还与出发菌株的遗传背景有关。一般对于遗传上不稳定的菌株的遗传背景有关。一般对于遗传上不稳定的菌株，可采用温和的诱变剂，或采用已见效果的诱株，可采用温和的诱变剂，或采用已见效果的诱变剂；对于遗传上较稳定的菌株则采用强烈的、变剂；对于遗传上较稳定的菌株则采用强烈的、不常用的、诱变谱广
26、的诱变剂。要重视出发菌株不常用的、诱变谱广的诱变剂。要重视出发菌株的诱变系谱。不要经常采用同一种诱变剂反复处的诱变系谱。不要经常采用同一种诱变剂反复处理，以防止诱变效应饱和；但也不要频频变换诱理，以防止诱变效应饱和；但也不要频频变换诱变剂，以避免造成菌种的遗传背景复杂，不利于变剂，以避免造成菌种的遗传背景复杂，不利于高产菌株的稳定。高产菌株的稳定。选择诱变剂时，还应该考虑诱变剂本身的特点选择诱变剂时，还应该考虑诱变剂本身的特点。例如紫外线主要作用于例如紫外线主要作用于DNADNA分子的嘧啶碱基，而分子的嘧啶碱基，而亚硝酸则主要作用于亚硝酸则主要作用于DNADNA分子的嘌呤碱基。紫外分子的嘌呤碱
27、基。紫外线和亚硝酸复合使用，突变谱宽、诱变效果好。线和亚硝酸复合使用，突变谱宽、诱变效果好。(三三)影响诱变效果的因素影响诱变效果的因素 除了出发菌株的遗传特性和诱变剂会影响诱除了出发菌株的遗传特性和诱变剂会影响诱变效果之外，菌种的生理状态、被处理菌株诱变前变效果之外，菌种的生理状态、被处理菌株诱变前的预培养和诱变后的培养条件以及诱变处理时的外的预培养和诱变后的培养条件以及诱变处理时的外界条件等都会影响诱变效果。界条件等都会影响诱变效果。菌种的生理状态与诱变效果有密切关系菌种的生理状态与诱变效果有密切关系，例如，例如碱基类似物、亚硝基胍碱基类似物、亚硝基胍(NTG)(NTG)等只对分裂中的等只
28、对分裂中的DNADNA有有效，对静止的或休眠的孢子或细胞无效；而另外一效，对静止的或休眠的孢子或细胞无效；而另外一些诱变剂，如紫外线、亚硝酸、烷化剂、电离辐射些诱变剂，如紫外线、亚硝酸、烷化剂、电离辐射等能直接与等能直接与DNADNA起反应，因此对静止的细胞也有诱起反应，因此对静止的细胞也有诱变效应，但是对分裂中的细胞更有效。因此，放线变效应，但是对分裂中的细胞更有效。因此，放线菌、真菌的孢子在诱变前稍加萌发可以提高诱变率。菌、真菌的孢子在诱变前稍加萌发可以提高诱变率。诱变处理前后的培养条件对诱变效果有明显的影响。诱变处理前后的培养条件对诱变效果有明显的影响。可有意地于培养基中添加某些物质（如
29、核酸碱基、可有意地于培养基中添加某些物质（如核酸碱基、咖啡因、氨基酸、氯化锂、重金属离子等等）来影响咖啡因、氨基酸、氯化锂、重金属离子等等）来影响细胞对细胞对DNADNA损伤的修复作用，使之出现更多的差错，损伤的修复作用，使之出现更多的差错，而达到提高诱变率的目的。例如菌种在紫外线处理前，而达到提高诱变率的目的。例如菌种在紫外线处理前，在富有核酸碱基的培养基中培养，能增加其对紫外线在富有核酸碱基的培养基中培养，能增加其对紫外线的敏感。相反，如果菌种在进行紫外线处理以前，培的敏感。相反，如果菌种在进行紫外线处理以前，培养于含有氯霉素养于含有氯霉素(或缺乏色氨酸或缺乏色氨酸)的培养基中，则会降的培
30、养基中，则会降低突变率。紫外线诱变处理后，将孢子液分离于富有低突变率。紫外线诱变处理后，将孢子液分离于富有氨基酸的培养基中，则有利于菌种发生突变。氨基酸的培养基中，则有利于菌种发生突变。三、突变株的筛选三、突变株的筛选菌体细胞经诱变剂处理后，要从大量的变异菌菌体细胞经诱变剂处理后，要从大量的变异菌株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来，株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来，这需要有明确的筛选目标和筛选方法，需要进这需要有明确的筛选目标和筛选方法，需要进行认真细致的筛选工作，育种工作中常采用随行认真细致的筛选工作，育种工作中常采用随机筛选和理性化筛选这两种筛选方法。机筛选和理性化筛选这两种
31、筛选方法。随机筛选随机筛选理性化筛选理性化筛选1.1.摇瓶筛选法摇瓶筛选法2.2.琼脂块筛选法琼脂块筛选法3.3.筛选自动化和筛选工具微型化筛选自动化和筛选工具微型化1 1、初级代谢产物高产菌株的筛选、初级代谢产物高产菌株的筛选2 2次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选的筛选 酶的调节酶的调节 酶的活性酶的活性 酶的合成酶的合成1.1.摇瓶筛选法摇瓶筛选法这是生产上一直使用的传统方法。即将挑出这是生产上一直使用的传统方法。即将挑出的单菌落传种斜面后，再由斜面接入模拟发的单菌落传种斜面后，再由斜面接入模拟发酵工艺的摇瓶中培养，然后测定其发酵生产酵工艺的摇
32、瓶中培养，然后测定其发酵生产能力。选育高产菌株的目的是要在生产发酵能力。选育高产菌株的目的是要在生产发酵罐中推广应用，因此摇瓶的培养条件要尽可罐中推广应用，因此摇瓶的培养条件要尽可能和发酵生产的培养条件相近。但是实际上能和发酵生产的培养条件相近。但是实际上摇瓶培养条件很难和发酵罐培养条件相同。摇瓶培养条件很难和发酵罐培养条件相同。摇瓶筛选的优点是培养条件与生产培养条件摇瓶筛选的优点是培养条件与生产培养条件相接近，但工作量大、时间长、操作复杂。相接近，但工作量大、时间长、操作复杂。2.2.琼脂块筛选法琼脂块筛选法这是一种简便、迅速的初筛方法。将单菌落连同这是一种简便、迅速的初筛方法。将单菌落连同
33、其生长培养基其生长培养基(琼脂块琼脂块)用打孔器取出，培养一段用打孔器取出，培养一段时间后，置于鉴定平板以测定其发酵产量。琼脂时间后，置于鉴定平板以测定其发酵产量。琼脂块筛选法的优点是操作简便、速度快。但是，固块筛选法的优点是操作简便、速度快。但是，固体培养条件和液体培养条件之间是有差异的，利体培养条件和液体培养条件之间是有差异的，利用此法所取得的初筛结果必须经摇瓶复筛验证。用此法所取得的初筛结果必须经摇瓶复筛验证。3.3.筛选自动化和筛选工具微型化筛选自动化和筛选工具微型化近年来，在研究筛选自动化方面有很大进展、筛近年来，在研究筛选自动化方面有很大进展、筛选实验实现了自动化和半自动化，省去了
34、繁琐的选实验实现了自动化和半自动化，省去了繁琐的劳动，大大提高了筛选效率。筛选工具的微型化劳动，大大提高了筛选效率。筛选工具的微型化也是很有意义的，例如将一些小瓶子取代现有的也是很有意义的，例如将一些小瓶子取代现有的发酵摇瓶，在固定框架中振荡培养，可使操作简发酵摇瓶，在固定框架中振荡培养，可使操作简便，又可加大筛选量。但筛选工具微型化的实验便，又可加大筛选量。但筛选工具微型化的实验结果的准确性还有待提高。结果的准确性还有待提高。传统的菌种选育是采用随机筛选的方法。由于正变株出现传统的菌种选育是采用随机筛选的方法。由于正变株出现的几率小，产量提高的范围通常在生物学波动的范围内，的几率小，产量提高
35、的范围通常在生物学波动的范围内，因而选出一株高产菌株需要耗费大量的人力、物力。而且，因而选出一株高产菌株需要耗费大量的人力、物力。而且，随着发酵产量不断提高，用随机筛选方法获得高产菌株的随着发酵产量不断提高，用随机筛选方法获得高产菌株的几率越来越小。近年来，随着遗传学、生物化学知识的积几率越来越小。近年来，随着遗传学、生物化学知识的积累，人们对于代谢途径、代谢调控机制了解得更多了，因累，人们对于代谢途径、代谢调控机制了解得更多了，因而筛选方法逐渐从随机筛选方法转向理性化筛选方法。而筛选方法逐渐从随机筛选方法转向理性化筛选方法。理理性化筛选（性化筛选（rational screeningrati
36、onal screening）是运用遗传学、生物化是运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成发酵以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成发酵产物的高产突变株。微生物的代谢产物不同，其筛选方法产物的高产突变株。微生物的代谢产物不同，其筛选方法也有所不同。也有所不同。1 1初级代谢产物高产菌株的筛选初级代谢产物高产菌株的筛选初级代谢产物是和微生物的生长、繁殖直接有初级
37、代谢产物是和微生物的生长、繁殖直接有关的一类代谢产物，它们是组成细胞的各种大关的一类代谢产物，它们是组成细胞的各种大分子化合物或辅酶的基本成分。氨基酸、核苷分子化合物或辅酶的基本成分。氨基酸、核苷酸、维生素是发酵工业中最常见的初级代谢产酸、维生素是发酵工业中最常见的初级代谢产物。物。根据代谢调控的机理，氨基酸、核苷酸、维根据代谢调控的机理，氨基酸、核苷酸、维生素等小分子初级代谢产物的合成途径中普生素等小分子初级代谢产物的合成途径中普遍存在遍存在反馈阻遏反馈阻遏或或反馈抑制反馈抑制。这对于产生菌。这对于产生菌本身是有意义的，因为可避免合成过多的代本身是有意义的，因为可避免合成过多的代谢物而造成能
38、量的浪费。但是，在工业生产谢物而造成能量的浪费。但是，在工业生产中，需要产生菌产生大量的氨基酸、核苷酸、中，需要产生菌产生大量的氨基酸、核苷酸、维生素。因此，需要打破微生物原有的反馈维生素。因此，需要打破微生物原有的反馈调节。要使微生物大量地积累初级代谢产物，调节。要使微生物大量地积累初级代谢产物，最重要的是需打破反馈抑制调节。最重要的是需打破反馈抑制调节。降低终产降低终产物浓度和抗反馈突变的育种是打破反馈抑制物浓度和抗反馈突变的育种是打破反馈抑制调节的重要措施。调节的重要措施。（1 1）降低终产物浓度）降低终产物浓度 降低终产物浓度有两种方法降低终产物浓度有两种方法可以达到此目的：可以达到此
39、目的：选育终产物的营养缺陷型菌株，选育终产物的营养缺陷型菌株，在培养基中供给限量的终产物使该菌株能生长，但在培养基中供给限量的终产物使该菌株能生长，但不致造成反馈调节，因而积累大量中间代谢产物。不致造成反馈调节，因而积累大量中间代谢产物。假设一代谢产物的生物合成途径为：假设一代谢产物的生物合成途径为：ABCDEABCDE。B B、C C、D D为该代谢途径的中间代为该代谢途径的中间代谢产物谢产物,E,E为该代谢途径的终产物。为该代谢途径的终产物。E E作为终产物，作为终产物，通常对催化该代谢途径第一步反应的酶有反馈抑制通常对催化该代谢途径第一步反应的酶有反馈抑制作用。如果通过诱变处理使得作用。
40、如果通过诱变处理使得CECE代谢途径中断，代谢途径中断，则为则为E E的营养缺陷型，就可以避免终产物的营养缺陷型，就可以避免终产物E E对催化该对催化该代谢途径第一步反应的酶的反馈调节，使得原本不代谢途径第一步反应的酶的反馈调节，使得原本不能大量积累的中间代谢产物能大量积累的中间代谢产物C C能够大量积累。能够大量积累。筛选细胞膜透性改变的突变株筛选细胞膜透性改变的突变株，使之大量分，使之大量分泌终产物，以降低细胞内终产物浓度，从而避泌终产物，以降低细胞内终产物浓度，从而避免终产物反馈调节。例如，用谷氨酸棒杆菌的免终产物反馈调节。例如，用谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型进行谷氨酸发酵，生物素是生
41、物素营养缺陷型进行谷氨酸发酵，生物素是合成脂肪酸所必需的，而脂肪酸又是组成细胞合成脂肪酸所必需的，而脂肪酸又是组成细胞膜类脂的必要成分。该缺陷型在生物素处于限膜类脂的必要成分。该缺陷型在生物素处于限量的情况下，不利于脂肪酸的合成，因而使细量的情况下，不利于脂肪酸的合成，因而使细胞膜的透性发生变化，有利于将谷氨酸分泌至胞膜的透性发生变化，有利于将谷氨酸分泌至菌体细胞外的发酵液中。如果使用油酸缺陷型菌体细胞外的发酵液中。如果使用油酸缺陷型菌株或者甘油缺陷型菌株，即使在生物素过量菌株或者甘油缺陷型菌株，即使在生物素过量的条件下，也可使谷氨酸在体外的发酵液中大的条件下，也可使谷氨酸在体外的发酵液中大量
42、积累。量积累。(2)筛选抗反馈突变菌株筛选抗反馈突变菌株 筛选结构类似物筛选结构类似物(抗代抗代谢物谢物)抗性突变株抗性突变株：分离抗反馈突变菌株最常用：分离抗反馈突变菌株最常用的方法是用与代谢产物结构类似的化合物的方法是用与代谢产物结构类似的化合物(结构结构类似物类似物)处理微生物细胞群体，杀死或抑制绝大处理微生物细胞群体，杀死或抑制绝大多数菌体细胞，选出能大量产生该代谢物的抗反多数菌体细胞，选出能大量产生该代谢物的抗反馈突变株。结构类似物一方面具有和代谢物相似馈突变株。结构类似物一方面具有和代谢物相似的结构，因而具有和代谢物相似的反馈调节作用，的结构，因而具有和代谢物相似的反馈调节作用，阻
43、碍该代谢物的生成；另一方面它不同于代谢物，阻碍该代谢物的生成；另一方面它不同于代谢物，不具有正常的生理功能，对菌体细胞的正常代谢不具有正常的生理功能，对菌体细胞的正常代谢有阻碍作用，会抑制菌的生长或导致菌的死亡。有阻碍作用，会抑制菌的生长或导致菌的死亡。例如，一种氨基酸终产物，在正常的情况下，参与例如，一种氨基酸终产物，在正常的情况下，参与蛋白质合成，过量时可抑制或阻遏它自身的合成酶蛋白质合成，过量时可抑制或阻遏它自身的合成酶类。如果这种氨基酸的结构类似物也显示这种抑制类。如果这种氨基酸的结构类似物也显示这种抑制或阻遏，却不能用于蛋白质的合成，那么当用这种或阻遏，却不能用于蛋白质的合成，那么当
44、用这种结构类似物处理菌种时，大多数菌体细胞将由于缺结构类似物处理菌种时，大多数菌体细胞将由于缺少该种氨基酸而不能生长或者死亡，只有那些对该少该种氨基酸而不能生长或者死亡，只有那些对该结构类似物不敏感的突变株，仍然能够合成该种氨结构类似物不敏感的突变株，仍然能够合成该种氨基酸而继续生长。某些菌株所以能抵抗这种结构类基酸而继续生长。某些菌株所以能抵抗这种结构类似物，是因为被该氨基酸似物，是因为被该氨基酸(或结构类似物或结构类似物)反馈抑制反馈抑制的酶的结构发生了改变（抗反馈抑制），或者被阻的酶的结构发生了改变（抗反馈抑制），或者被阻遏的酶的生成系统发生了改变（抗反馈阻遏）。由遏的酶的生成系统发生了
45、改变（抗反馈阻遏）。由于突破了原有的反馈调节系统，这些突变株就可产于突破了原有的反馈调节系统，这些突变株就可产生大量的该种氨基酸生大量的该种氨基酸利用回复突变筛选抗反馈突变菌株利用回复突变筛选抗反馈突变菌株：经诱变：经诱变处理出发菌株，先选出对产物敏感的营养缺陷处理出发菌株，先选出对产物敏感的营养缺陷型，再将营养缺陷型进行第二次诱变处理得到型，再将营养缺陷型进行第二次诱变处理得到回复突变株。筛选的目的不是要获得完全回复回复突变株。筛选的目的不是要获得完全回复原状的回复突变株，而是希望经过两次诱发突原状的回复突变株，而是希望经过两次诱发突变，所得的回复突变株有可能改变了产物合成变，所得的回复突变
46、株有可能改变了产物合成酶的调节位点的氨基酸的顺序，使之不能和产酶的调节位点的氨基酸的顺序，使之不能和产物结合，因而不受产物的反馈抑制。例如，谷物结合，因而不受产物的反馈抑制。例如，谷氨酸捧杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其氨酸捧杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从而提高了终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从而提高了鸟苷酸的产量。鸟苷酸的产量。2次级代谢产物（主要是抗生素）高产次级代谢产物（主要是抗生素）高产菌株的筛选菌株的筛选次级代谢次级代谢是某些生物为了避免在初级代谢过程是某些生物为了避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生中某些中间产物积累所造成
47、的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。次级代谢有不的一类有利于生存的代谢类型。次级代谢有不同于初级代谢的特点，因此其筛选方法和初级同于初级代谢的特点，因此其筛选方法和初级代谢略有不同。次级代谢产物不是菌株生长、代谢略有不同。次级代谢产物不是菌株生长、繁殖所必需的，往往不能简单地采用筛选营养繁殖所必需的，往往不能简单地采用筛选营养缺陷型或结构类似物抗性菌株的方法来获得高缺陷型或结构类似物抗性菌株的方法来获得高产菌株产菌株次级代谢又受到初级代谢的调节，次级代谢和初次级代谢又受到初级代谢的调节，次级代谢和初级代谢有一些共同的中间产物，这些中间产物可级代谢有一些共同的中间产物，这些中间产物可以进
48、而合成初级代谢产物，也可以进而合成次级以进而合成初级代谢产物，也可以进而合成次级代谢产物，这取决于菌的遗传特性和生理状态。代谢产物，这取决于菌的遗传特性和生理状态。微生物的代谢调节系统趋向于平衡地利用营养物微生物的代谢调节系统趋向于平衡地利用营养物质。当环境中某些营养物质过剩，而某些营养物质。当环境中某些营养物质过剩，而某些营养物质缺乏时，菌体为了避免不平衡生长而导致死亡，质缺乏时，菌体为了避免不平衡生长而导致死亡，在代谢调节系统作用下，菌的生长繁殖速率下降，在代谢调节系统作用下，菌的生长繁殖速率下降，并通过代谢途径的改变将过剩的营养物质转变成并通过代谢途径的改变将过剩的营养物质转变成与生长繁
49、殖无关的次级代谢产物。与生长繁殖无关的次级代谢产物。因此，筛选某些营养缺陷型或初级代谢产物结构因此，筛选某些营养缺陷型或初级代谢产物结构类似物抗性菌株可以消除初级代谢产物对那些与类似物抗性菌株可以消除初级代谢产物对那些与初级代谢产物有共同中间产物的次级代谢产物合初级代谢产物有共同中间产物的次级代谢产物合成的反馈调节，而有利于次级代谢产物的合成。成的反馈调节，而有利于次级代谢产物的合成。次级代谢产物的生物合成受终产物反馈调节的影次级代谢产物的生物合成受终产物反馈调节的影响较小而受分解代谢物调节的影响较大。响较小而受分解代谢物调节的影响较大。大多数大多数菌在被快速利用的菌在被快速利用的碳、氮、磷碳
50、、氮、磷源消耗至一定程度源消耗至一定程度时才出现有活性的次级代谢酶，因此筛选解除分时才出现有活性的次级代谢酶，因此筛选解除分解代谢调节的突变株可以获得高产。解代谢调节的突变株可以获得高产。次级代谢产物高产菌株的筛选方法有许多种，以下介绍次级代谢产物高产菌株的筛选方法有许多种，以下介绍八种较为常用的筛选方法八种较为常用的筛选方法（1 1）利用营养缺陷型筛选）利用营养缺陷型筛选(2)(2)筛选负变株的回复突变株筛选负变株的回复突变株(3)(3)筛选去磷酸盐调节突变株筛选去磷酸盐调节突变株(4)(4)筛选去碳源分解代谢调节突变株筛选去碳源分解代谢调节突变株(5)(5)筛选氨基酸结构类似物抗性突变株筛
