1、2.2.1 2.2.1 动动物物细细胞培胞培养养克隆猴中中和华华克隆皮肤 在治疗大面积烧伤时，通常采用的办法是取烧在治疗大面积烧伤时，通常采用的办法是取烧伤病人的健康皮肤进行自体移植。伤病人的健康皮肤进行自体移植。从社会中来克隆皮肤 但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用但对这样的病人来说，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，而且产生免疫排斥反应。他人皮肤来源又不足，而且产生免疫排斥反应。 那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用那么，怎样才能获得大量的自体健康皮肤？能不能用自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？自体皮肤的单个细胞培养出可供移植的皮肤？科学家通过科学家
2、通过动物细胞培养动物细胞培养构建了人造皮肤构建了人造皮肤动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞融合生产单克隆抗体其中动物细胞培养是最基础的技术。 烧伤病人图片异体皮肤移植图片如何解决异体器官移植的免疫排斥反应？思考-讨论:一、动物细胞培养1、概念：从动物体中从动物体中取出取出相关的组织，将它相关的组织，将它分散分散成单个细胞，然后成单个细胞，然后在适当的在适当的培养培养条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。条件下，让这些细胞生长和增殖的技术。2、目的：获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。获得细胞或细胞产物；不能获得完整动物个体。3、原理：细胞增殖（有丝分裂）细胞增殖（有丝分裂）4、实例：那么，
3、获得这些细胞或细胞产物的具体过程又是怎样的？克隆皮肤克隆皮肤皮肤烧伤皮肤烧伤一、动物细胞培养过程胚胎或幼龄动物器官组织胚胎或幼龄动物器官组织取出组织取出组织剪碎剪碎胰蛋白酶处理胰蛋白酶处理单个细胞单个细胞细胞悬液细胞悬液加培养液加培养液培养瓶培养瓶内培养内培养 转入（ 细胞贴壁长成单层细胞,有接触抑制现象）细胞贴壁接触抑制原代培养传代培养（原代培养）(分离组织)(分散组织)少部分突破细胞寿限少部分突破细胞寿限“癌变癌变”，无限传代，无限传代动物细胞培养动物细胞培养不能最终培养不能最终培养成动物体成动物体原代培养传代培养细细胞胞贴贴壁壁剥离、分瓶剥离、分瓶分化程度低，分化程度低，增殖能力强增殖能
4、力强去掉组织去掉组织间蛋白间蛋白（一）加培养液加培养液胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎出现接触抑制思考-讨论:（1 1）培养前为什么分散成单个细胞？）培养前为什么分散成单个细胞？ 成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了生长与增殖 利于与培养液充分接触，保证利于与培养液充分接触，保证O2与营养供应和代谢物及时排出。与营养供应和代谢物及时排出。（2 2）将组织分散成单个细胞时为什么要用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）将组织分散成单个细胞时为什么要用胰蛋白酶（或胶原蛋白酶） 处理？胃蛋白酶可以吗？处理？胃蛋白酶可以吗？胰蛋白酶可以将动物组织细胞间的蛋白质成分酶解，
5、使细胞分散开，胰蛋白酶可以将动物组织细胞间的蛋白质成分酶解，使细胞分散开，获得单个细胞。获得单个细胞。纤维蛋白、胶原蛋白等纤维蛋白、胶原蛋白等胃蛋白酶不可以，胃蛋白酶不可以，pHpH不适宜。不适宜。（3 3）在用胰蛋白酶处理组织时应注意）在用胰蛋白酶处理组织时应注意 什么？什么？细胞膜含有蛋白质，细胞膜含有蛋白质，长时间长时间处理会损伤细胞处理会损伤细胞要控制好时间要控制好时间资料：动物细胞生长特性细胞贴壁培养过程中出现了几个特点：要求：（培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附）要求：（培养瓶（皿）内表面光滑、无毒、易于贴附）细胞的接触抑制细胞的接触抑制（1）细胞贴壁悬液中分散的细胞贴附在瓶壁
6、生长悬液中分散的细胞贴附在瓶壁生长的现象；的现象；（2）接触抑制 当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖的现象细胞就会停止分裂增殖的现象细胞悬浮液细胞悬浮液1010代细胞代细胞5050代细胞代细胞无限传代无限传代原代培养原代培养传代培养传代培养细胞株细胞株细胞系细胞系如何界定原代培养和传代培养？细胞株和细胞系？如何界定原代培养和传代培养？细胞株和细胞系？遗传物质改变遗传物质改变遗传物质有的改变遗传物质有的改变洗涤、稀释洗涤、稀释、分瓶培养、分瓶培养多数细胞多数细胞固定在固定在表面生长和表面生长和分裂分裂随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞
7、增多，细胞就会停止分裂增殖将动物组织将动物组织处理后处理后的的初次培养（初次培养（1010代内）代内）。（3）原代培养：当原代培养的细胞贴满瓶壁时，重新用胰蛋白酶处理，当原代培养的细胞贴满瓶壁时，重新用胰蛋白酶处理，使细胞从瓶壁脱落，加培养液制成细胞悬液，使细胞从瓶壁脱落，加培养液制成细胞悬液，分装分装到到2 2个或个或2 2个以上的培养瓶中继续培养（个以上的培养瓶中继续培养（1010代后代后）。）。（4）传代培养：分瓶培养10代细胞50代细胞无限增殖保持细胞正常二倍体核型部分细胞核型改变遗传物质改变突破细胞寿限危机1危机2培养危机：原代培养传代培养（遗传物质没改变）（遗传物质没改变）（遗传物
8、质有的改变）（遗传物质有的改变）细胞株和细胞系原代细胞一般传至原代细胞一般传至1010代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到死亡，少数细胞存活到40504050代，这种传代细胞为细胞株。代，这种传代细胞为细胞株。细胞株传代至细胞株传代至5050代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。这种传代细胞为细胞系。细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，细胞系的遗传物质改变，具
9、有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。容易传代培养。细胞系：区别：细胞株：欲使动物细胞体外培养顺利进行，应营造怎样的环境？思考-讨论二、动物细胞培养的条件1. 营养： 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、微量元素葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、微量元素（合成培养基合成培养基）+ +动物血清动物血清等等2. 无菌、无毒的环境：培养液和所有培养培养液和所有培养用具灭菌处理，无菌操作。用具灭菌处理，无菌操作。添加一定量的抗生素？添加一定量的抗生素？定期更换定期更换培养液，防止代谢物积累伤害细胞。培养液，防止代谢物积累伤害细胞。3. 温度、PH和渗透压： 温度温度36.536
10、.5+ +0.50.5度，度，pH7.2pH7.27.47.4，也需考虑渗透压因素。，也需考虑渗透压因素。4. 气体环境： O O2 2和和COCO2 2（95%95%空气和空气和5% CO5% CO2 2 ） O2和CO2的作用分别是什么？为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？补充资料：1 1、血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，、血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，2 2、氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物、氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，其中有些氨基酸动物 细胞本身不能合成（称为细胞本身不能合成（称为必需氨基酸必需氨基酸），必须由培养液
11、提供。），必须由培养液提供。3 3、血清激素有胰岛素、生长激素等及多种、血清激素有胰岛素、生长激素等及多种生长因子生长因子；血清还含有多种未；血清还含有多种未 知的知的促细胞生长因子促细胞生长因子、 促贴附因子促贴附因子及及其他活性物质其他活性物质，能促进细胞的，能促进细胞的 生长、增殖和贴附。生长、增殖和贴附。4 4、因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加、因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加 10%10%20%20%的血清的血清。 血清中含有多种未知的促细胞生长因子等营养物质，这是细胞生长和增殖所必需的。思考-讨论动物细胞培养与植物组织培养有什么相
12、同和不同之处？动物胚胎或幼龄动动物胚胎或幼龄动物的组织、器官物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶胰蛋白酶10代细胞50代细胞无限传代单个细胞加培养液加培养液离体的植物器官、离体的植物器官、组织或细胞组织或细胞愈伤组织愈伤组织根、芽根、芽植物体植物体脱分化脱分化再分化再分化接种至培养基接种至培养基比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理培养基性质培养基性质培养基特有成分培养基特有成分培养结果培养结果培养目的培养目的获得获得细胞及细胞及代谢产物代谢产物细胞的全能性细胞的全能性细胞株、细胞系细胞株、细胞系植物体植物体快速繁殖、培育无快速繁殖、培育无病毒植株等病毒植株等葡萄
13、糖、动物血清葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素蔗糖、植物激素液体培养基液体培养基固体培养基固体培养基细胞增殖细胞增殖植物组织培养和动物细胞培养的比较（三）干细胞培养及其应用3 3、干细胞类型：、干细胞类型：1 1、胚胎干细胞、胚胎干细胞：存在于早期胚胎中，具有分化成为成年动物体内任何存在于早期胚胎中，具有分化成为成年动物体内任何一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器一种类型的细胞，并进一步形成机体的所有组织和器官甚至个体的潜能。官甚至个体的潜能。2 2、干细胞分布、干细胞分布：早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中早期胚胎、骨髓和脐带血等多种组织和器官中胚胎干细胞胚胎干细胞（ ES ES
14、细胞）细胞）成体干细胞成体干细胞全能干细胞全能干细胞多能干细胞多能干细胞专能干细胞专能干细胞4 4、胚胎干细胞应用、胚胎干细胞应用：体外诱导小鼠体外诱导小鼠成纤维细胞成纤维细胞诱导多能干细胞诱导多能干细胞iPSiPS临床治疗人类疾病临床治疗人类疾病多种体细胞多种体细胞定向诱导分化定向诱导分化如：白血病、帕金森病、阿而茨海默病等 人人的核移植胚胎干细的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应胞经诱导分化，形成相应的组织、器官后，可用于的组织、器官后，可用于组织器官的移植。组织器官的移植。 干细胞将在干细胞将在再生医学再生医学、药物安全性与有效性检测药物安全性与有效性检测等等领域发挥大作用。领域发挥大作用。
