1、“生物导弹”追踪癌细胞抗体植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养温故而知新：温故而知新： 植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术跨越跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，不同种植物之间生殖隔离的屏障，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出新的作物克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出新的作物类型。类型。 有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细有没有技术让不同种动物的体细胞杂交，培育出集不同细胞优势于一身的动物细胞呢？胞优势于一身的动物细胞呢？19701970年年荧光标记的荧光标记的人人- -鼠细胞融合实验模式图鼠细胞融合实验模式图实例： 如果如果让动物细胞进行让动物细胞进行融合，与植物有哪些不同之处
2、？融合，与植物有哪些不同之处？无需去除细胞壁无需去除细胞壁全能性全能性受限制受限制，不能培育成新的动物个体，不能培育成新的动物个体思考：一、动物细胞融合技术1、概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。的技术。4、结果：2、原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性3、诱导方式物理法：离心、振动、电激物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（化学法：聚乙二醇（PEG)PEG)生物法：灭活的病毒生物法：灭活的病毒时间成果19世纪30年代观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多核细胞核细胞1
3、858年观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。1876年在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。1962年日本学者冈田发现日本学者冈田发现仙台病毒仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。具有触发动物细胞融合的效应。1965年英国科学家证实了英国科学家证实了灭活的病毒灭活的病毒可诱发动物细胞融合可诱发动物细胞融合1974年华裔加拿大学者高国楠创立了华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（聚乙
4、二醇（PEGPEG）化学融合法。化学融合法。1975年KohlerKohler和和MilsteinMilstein成功地融合了小鼠成功地融合了小鼠B-B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代发展出了发展出了电融合技术电融合技术(1985(1985年酵母原生质体电融合年酵母原生质体电融合) )（1）补充资料：动物细胞融合技术的发展历史1、什么是病毒的灭活？2、灭活病毒诱导细胞融合的原理（2）问题：（三）灭活病毒诱导细胞融合过程：（四）动物细胞融合技术全过程:动物细胞融合动物细胞培养（五）动物细胞融
5、合实例：（六）植物（六）植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理融合前处理诱导融合的方法意义和用途克服远源杂交的障碍克服远源杂交的障碍，获得获得杂种植株杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性植物细胞的全能性植物细胞的全能性去除细胞壁后诱导原生去除细胞壁后诱导原生质体融合质体融合使细胞分散后诱导细胞融使细胞分散后诱导细胞融合合物理（离心、振荡、物理（离心、振荡、电激）电激）化学（化学（ PEG ）物理、化学物理、化学方法（方法（ PEG ） 灭活的病毒灭活的病毒制备单克隆抗体制备单克隆抗体1.1.概念：概念：
6、2.2.结果：结果：3.3.原理：原理：细胞膜的细胞膜的流动性流动性5.5.意义：意义：突破了有性杂交方法的局限突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。之间）成为可能。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别特别是利用杂交瘤技术是利用杂交瘤技术制造制造单克隆抗体。单克隆抗体。6.6.应用：应用：4.4.诱导方法：诱导方法：物理法物理法; ;化学法和化学法和生物法生物法动物细胞融合技术是指使动物细胞融合技术是指使 _ _ 动物细胞结合
7、成一个细胞动物细胞结合成一个细胞的技术。的技术。 形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的细胞，称为形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的细胞，称为 _。（七）小（七）小结：结：抗原不纯抗体不纯（八）传统抗体制备方法及缺陷缺陷：缺陷： 产量产量低、纯度低低、纯度低， 且且抗体的特异性差、灵敏度低。抗体的特异性差、灵敏度低。不能无限增殖产生大量抗体动物体内抗原 刺激浆细胞抗体 筛选单一B细胞增殖分化）体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上）每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体1、科学家发现：单单 克克 隆隆抗抗 体体 一个一个B淋巴细胞淋巴细胞 抗体 细胞群克隆如何获得大量、单一的抗体？体外培养时
8、，一个B淋巴细胞不能无限增殖2、需解决问题：3、遗憾：如何解决这一难题？癌细胞癌细胞动物细胞融合动物细胞融合思考：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的思考：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力 和无限增殖能力同时具备思考：一个极富创造力的方案：动物细胞融合杂交细胞动物细胞培养单克隆抗体杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体骨髓瘤细胞（癌细骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖胞）能无限增殖一个一个B B淋巴细胞只分淋巴细胞只分泌一种特异性抗体泌一种特异性抗体由由单个单个B B淋巴细胞淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所形成基因型相同的细胞群，这一细
9、胞群所产生的产生的化学性质单一、特异性强的抗体化学性质单一、特异性强的抗体称称为单克隆抗体。为单克隆抗体。 用抗原注射小鼠用抗原注射小鼠从患骨髓瘤的小鼠体内取从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养骨髓瘤细胞的培养已免疫已免疫B B淋巴淋巴细胞细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞诱导融合诱导融合多种杂交细胞多种杂交细胞小鼠的脾脏中获取2、单克隆抗体的制备过程置于置于选择性培养基选择性培养基上培养上培养 2杂交瘤细胞杂交瘤细胞 13第一次筛选第一次筛选多种杂交多种杂交瘤细胞瘤细胞融合融合的细胞的细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞自身融合自身融合B B细胞自身细胞自身融合融合杂交细胞杂交细胞 132未融合的未融合的B B
10、淋巴细胞淋巴细胞未融合的骨未融合的骨髓瘤细胞髓瘤细胞克隆化培养克隆化培养抗体检测抗体检测第二次筛选第二次筛选( (抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交技术技术) )多种多种杂交瘤细胞杂交瘤细胞能分泌能分泌所需所需抗体抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞阳性细胞阳性细胞注射到小鼠体内体外培养分离、提纯单克隆抗体分离、提纯单克隆抗体体内或体外培养能分泌能分泌所需所需抗体抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞细胞培养工程师在工作细胞培养工程师在工作单克隆抗体骨髓瘤细胞培养杂交细胞单一抗体阳性细胞单克隆抗体细胞融合B淋巴细胞骨髓瘤细胞融合 脾脏中获取脾脏中获取单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程诱导融合诱导融合选择培养基
11、选择培养基克隆化培养克隆化培养，专一专一抗体检验抗体检验体外培养或体外培养或小鼠腹腔内增殖小鼠腹腔内增殖动物细胞融合动物细胞融合动物细胞培养动物细胞培养给小鼠注射特定的抗原蛋白给小鼠注射特定的抗原蛋白B B淋巴细胞（免疫）淋巴细胞（免疫）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交细胞杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞单克隆抗体单克隆抗体能分泌所需抗体能分泌所需抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞补充资料：第一次筛选获得杂交瘤细胞 筛选出杂交瘤细胞方法？培养基中加入氨基嘌呤B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长将杂交瘤细胞群稀释，约将杂交瘤细胞群稀释，约每
12、孔每孔1 1个细个细胞胞进行培养进行培养 （克隆化培养克隆化培养）一段时间后，一段时间后，检测各孔上清液中细检测各孔上清液中细胞分泌的抗体胞分泌的抗体上清液可与特定抗原结合的培养孔上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔为阳性孔多孔细胞培养板多孔细胞培养板抗体检测板抗体检测板分泌抗体分泌抗体能跟能跟特定抗原特定抗原结合的细胞结合的细胞即为即为所需杂交瘤细胞所需杂交瘤细胞单克隆抗体单克隆抗体筛选二筛选二杂交细胞杂交细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞体外或体外或体内培养体内培养筛选一筛选一骨髓瘤骨髓瘤细胞细胞诱导融合诱导融合分泌特异抗体分泌特异抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞杂交瘤细胞群杂交瘤细胞群提取提取已免疫
13、的已免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞注射注射抗原抗原1、提取细胞并培养2、细胞融合B淋巴细胞的融合细胞B淋巴细胞和瘤细胞融合的细胞3、获得杂交细胞 （继承双亲的特点）筛选产生特异抗体的杂交瘤细胞4、杂交细胞进行细胞培养5、得到化学性质单一的，针对性强的抗体选择培养基筛选杂交细胞抗原-抗体杂交技术小结：-单克隆抗体的制备流程1、诊断诊断试剂试剂最广泛应用最广泛应用具有准确、高效、简易、快速特点.诊断优点：思考-讨论乙肝测定试剂乙肝测定试剂艾滋病检测试剂艾滋病检测试剂( (主要用于癌症治疗主要用于癌症治疗) )如：如：单克隆抗体单克隆抗体+ +药物药物 =“ =“生物导弹生物导弹”2 2、用于治疗疾病和运载药物、用于治疗疾病和运载药物优点：优点：位置位置准确、疗效高、副作用小准确、疗效高、副作用小结合同位素的单抗结合同位素的单抗
