1、HPV分型检测分型检测在宫颈疾病检查中的应用及亚能在宫颈疾病检查中的应用及亚能HPV基因基因分型检测分型检测HPV发展进程发展进程70年代德国人哈拉尔德楚尔豪森提出人乳头瘤病毒与宫颈癌有关系2019年国际癌症学会确定：人乳头瘤病毒是宫颈癌的主要病因。2019年10月6号哈拉尔德楚尔豪森获得诺贝尔奖。宫颈癌生物学病因研究的进程子宫颈癌子宫颈癌 唯一病因明确 唯一可以早期发现和治疗 唯一可望消灭 HPV感染，特别是高危性、持续性感染引起子宫颈癌前病变，子宫颈上皮内瘤变，CIN和宫颈癌 预防HPV感染就可以预防宫颈癌 没有HPV感染就可以不罹患宫颈癌我国宫颈癌流行现状我国宫颈癌流行现状 我国妇女患宫
2、颈癌的比例15/10万，是仅次于智利的宫颈癌高发国家 目前患者约40万，每年新增15万，据女性生殖道肿瘤首位 我国的宫颈癌死亡率为11.34%，据女性癌症死亡率第二位，特别在西部地区，宫颈癌居女性癌症死亡率之首 我国已婚女性HPV感染率在10%左右。我国需惊醒宫颈癌相关筛查的适龄女性，不少于不少于1 1亿亿HPV 病毒学基础知识病毒学基础知识 1. 小环状双链 DNA 病毒 2. 直径 50-55nm 3. 癌基因E6E71466低危型HPV高危型HPVHPV16nL1: 主要衣壳蛋白，是疫苗的主要成分 L2: 次要衣壳蛋白，是市售抗体的主要识别位点E4：结合并破坏细胞角蛋白网，形成挖空细胞的
3、外观E2：负性调节E6和E7，维持凋亡和细胞周期的调控。通常在病毒发生整合（病毒整合时会破坏E2基因的结构）时失活HPV 的主要致癌基因n E6 通过抑制 p53而阻断凋亡n E7 通过抑制pRB使细胞周期失控X生殖道生殖道HPV 感染感染 高危型HPV感染通常没有症状，为一过性并可自愈。90%以上的病人两年内可痊愈。 常见其他亚型继发或并发感染 多重多重HPV亚型感染极为常见亚型感染极为常见 自然免疫力差 感染后只有50%-60%的女性产 生抗HPV抗体，因此对同种基因型的HPV可再度 感染！E6&E7E2良性湿疣在上皮分化的终末阶段L1&L2 开始表达，并组装形成病毒衣壳 最后完整的病毒颗
4、粒从细胞内释放出来大量E4 聚集溶解细胞骨架蛋白 呈现挖空细胞的外观低水平表达，以维持病毒基因组和细胞的生长 负性调节 E6&E7 保持细胞的分 化和成熟 确保能够产生 完整的病毒颗 粒一过性一过性 HPV 感染感染E6&E7 在细胞发生恶变时 丧失分化的能力 不同程度的 细胞不成熟性 DNA多倍体的出现 核的非典型性 持续的增生能力 分裂相增多高级别高级别 CIN 蛋白表达水平增高 凋亡被阻断、细胞周期失控 细胞开始发生恶变在病毒整合时被破坏持持 续续 性性 HPV 感感 染染E2 宫颈癌防治现状宫颈癌防治现状宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，也是严重影响妇女身心健康，威胁妇女生命的重要原因之一
5、。流行病学的调查显示，从50年代以来，由于子宫颈细胞学的广泛应用，全球子宫颈癌的发病率明显下降，但在发展中国家仍居妇科恶性肿瘤首位调查数字显示： 我国25岁以上的妇女中，有超过70的人 数从未做过宫颈防癌检查！筛筛 查查 的的 重重 要要 性性 宫颈癌筛查不只是医师行为，更是政府的职责，是艰难的宫颈癌筛查不只是医师行为，更是政府的职责，是艰难的系统工程系统工程我国目前不可能做到像美国、澳大利亚那样建立规范化的我国目前不可能做到像美国、澳大利亚那样建立规范化的筛查制度筛查制度可以根据各地情况做区域性筛查，定点筛查，机会性筛查可以根据各地情况做区域性筛查，定点筛查，机会性筛查 所有到妇产科门诊就诊
6、者和各种体检者，都应做子所有到妇产科门诊就诊者和各种体检者，都应做子 宫颈细胞学检查宫颈细胞学检查/HPV/HPV检查，这需要妇产科医生的工检查，这需要妇产科医生的工 作之一作之一 高危人群者更应行定期的检查和随诊高危人群者更应行定期的检查和随诊筛查的目的是筛查的目的是识别和检出子宫颈癌前病变，识别和检出子宫颈癌前病变， 而不是子宫颈癌而不是子宫颈癌；子宫颈癌多半有症状，是及时诊断问题子宫颈癌多半有症状，是及时诊断问题子宫颈癌在癌前病变未被诊断，是没有进行检查和筛查：子宫颈癌在癌前病变未被诊断，是没有进行检查和筛查： 1/4 1/4 患者从未进行细胞学检查患者从未进行细胞学检查 1/41/4患
7、者子宫颈癌前患者子宫颈癌前5 5年未进行细胞学检查年未进行细胞学检查筛查的准确性取决于：筛查的准确性取决于： 筛查方法的敏感性、特异性筛查方法的敏感性、特异性 细胞学和细胞学和HPVHPV检查质量检查质量 子宫颈癌合并妊娠，是非常棘手的妊娠合并症。准备怀孕时仍要按照规范进行定期的细胞学检查。如孕前有高危因素，建议孕期及产后定期做宫颈细胞学检查。怀孕过程中若出现异常症状至医院 就诊，由医生根据情况决定是 否进行细胞学检查以及如 何处理。筛筛 查查 应应 从从 何何 时时 开开 始？始？性生活开始后性生活开始后3 3年左右年左右不晚于不晚于2121岁岁Practice Guidelines in
8、Oncology, 2019, NCCN何何 时时 终终 止止 筛筛 查？查？年龄年龄 7070岁，在岁，在1010年内已有年内已有3 3次以上之满意的细胞学检查次以上之满意的细胞学检查正常者，可停止筛查。正常者，可停止筛查。 但若无上述筛查历史，或有不正常者，则建议继续筛但若无上述筛查历史，或有不正常者，则建议继续筛 查。有宫颈癌历史、雌激素暴露、免疫功能障碍查。有宫颈癌历史、雌激素暴露、免疫功能障碍 （HIVHIV），应继续长期筛查。），应继续长期筛查。Practice Guidelines in Oncology, 2019, NCCN筛筛 查查 的的 时时 间间 间间 隔隔 传统细胞涂
9、片检查传统细胞涂片检查 每年一次每年一次 TCT TCT每每2 2年一次年一次 30 30岁以后，连续岁以后，连续3 3次正常者，每次正常者，每2 2-3-3年一次年一次 FDA FDA批准批准HPV DNAHPV DNA检测用于检测用于3030岁以上的妇女联合细胞学检查岁以上的妇女联合细胞学检查 同时使用同时使用 细胞学和细胞学和HPV DNAHPV DNA检测同时为阴性，筛查间隔可以检测同时为阴性，筛查间隔可以 3 3年一次年一次注意对注意对HPVHPV感染的评估感染的评估Practice Guidelines in Oncology, 2019, NCCNHPV 检检 测测 应应 用用
10、于于 宫宫 颈颈 癌癌 筛筛 查查 HPVHPV病毒的发现病毒的发现明确高危型明确高危型HPVHPV病毒持续感染为宫病毒持续感染为宫颈癌治病因颈癌治病因p高危型HPV感染通常为一过性感染并可自行清除p但如自身免疫力较差，则会造成持续感染p不同地区人群的宫颈癌患者中感染的HPV型别不同p不同HPV型别致病类型及强弱不同HPV HPV 检检 测测 的的 临临 床床 应应 用用 细胞学结果为ASC的病例管理 宫颈病变手术的术后随访 与细胞学联合，应用于3030岁以上岁以上女性的宫颈癌筛查 指导HPV疫苗的使用（两种疫苗：4价、2价疫苗针对16/18） 现有的HPV疫苗只能对HPV16、18、6、11
11、型这四种型别的 感染进行预防，且都以国外的研究数据进行研发 对于中国女性的HPV感染型别的研究，有助于研发适合于 中国女性的 HPV疫苗美国ASCCP 2019年版HPV （+）及细胞学正常HPV 16/18 (+)HPV 16/18 (+)其他高危型阳性阴道镜阴道镜重复细胞学和HPV 检测（间隔12个月）两者均阴性细胞学阴性HPV （+）阴道镜细胞学异常HPV （）参照ASCCP指南常规筛查（3年后）美国美国ASCCP： 3030岁妇女的宫颈筛查中联合筛查更为重要岁妇女的宫颈筛查中联合筛查更为重要HPV(-)TCT(-)HPV(+)1年重复TCT和HPV检查都为(-)TCT(-) HPV(+
12、)TCT(+)不管HPV是否正常3年常规筛查阴道镜3年常规筛查TCT结果为ASCUS及其以上病变按ASCCP指南处理TCTTCT与与HPV HPV 检测的联合应用于宫颈癌筛查检测的联合应用于宫颈癌筛查TCT与HPV检测联合使用几乎可以100%防止漏诊，同时也可监测HPV感染的转归现有HPV疫苗仅针对四种型别HPV病毒的感染，更多的HPV型别感染仍需通过定期的联合筛查来防治临床处理仍需遵循TBS诊断结果和三阶梯诊治流程TCT联合HPV检测有助于宫颈病变的个体化处理 美国美国ACOGACOG 20092009年版年版 2009年年11月月20日日,美国美国妇产妇产科大学（科大学（ACOG） ）发发
13、表关于表关于宫颈宫颈癌癌筛查筛查的最的最新指南意新指南意见见对于30岁以上的妇女，最佳的筛查方式是同时进行细胞学筛查（TCT）和宫颈HPV DNA检测如果两项结果都正常，属于宫颈癌的低危人群，筛查的间隔最好在三年以上 HPV 分分 型型 检检 测测 分分型才能区分持续或型才能区分持续或反复感染反复感染 分分型才能区分单一和多重感染型才能区分单一和多重感染 后者危险更后者危险更大大 不不同型别不同的患病风险同型别不同的患病风险 致病性致病性差异差异 不不同型别不同的处理同型别不同的处理方案方案 相同细胞及组织学类型HPV阳性与阴性要区别对待 不同HPV感染型别要区别对待 根据ASCCP指南，细胞
14、学阳性，HPV16、18阳性可选择阴道镜检 不不同型别不同的致病同型别不同的致病类类 不不同型别转归和愈后不同同型别转归和愈后不同Pap阴性HPV 阳性HPV 阴性三年内复检双相检查16/18 基因分型阳性阴性阴道镜检查一年内复检双相检查* *美国美国ASCCP2019ASCCP2019版版HPV 分分型检测应用（型检测应用（1）- 筛查筛查 WHO建议HPV-DNA检测不能用于30岁以下的女性。 HPV DNA 检测虽然对HPV很敏感，但是并不能预测它的病程和发展，要预测高危HPV是否 可致癌，需要作基因分型测试基因分型测试 虽然复查显示同型HPV阳性，但不能预 料这个女性的宫颈疾病病程。
15、仅增 加了危险性 23 890(筛查人数)细胞学(-)HPV(-)21 409细胞学(+)HPV(-)488细胞学(-)HPV(+)370细胞学(+)HPV(+)523阴道镜检查533无病例发现发现3例发现59例发现114例HPV 分分型检测应用（型检测应用（1）- 筛查筛查北美和欧洲的筛查研究显示，在35岁的女性人群中，HPV试验检测CIN2病变的敏感性和特异性分别为95%和93%。 细胞学检查发现ASCUS的敏感性和特异性分别为60%和97% 联合使用HPV检测和细胞学检查的敏感性比单独使用任何一种都显著提高，阴性预 测值达99%-100% HPV分型检测应用（分型检测应用（1）- 筛查筛
16、查HPV分型检测应用（2）- 阴道镜适应征 30妇女，细胞学未见上皮内病变和恶性细胞，HPV16，18建议阴道镜。 2019 consensus guidelines for management of women with abnormal cervical cancer screening tests AJOG.ORGPap阴性HPV 阳性HPV 阴性三年内复检双相检查16/18 基因分型阳性阴性阴道镜检查一年内复检双相检查波特兰的一项研究表明，30岁细胞学阴性的女性中，HPV16或18阳性的女性在10年随访中出 现CIN3的比率分别为21%和18%。与此相比， 其他高危型HPV阳性的女性
17、中，CIN3的风 险性仅1.5%。 HPV分型检测应用（分型检测应用（2） 阴道镜阴道镜适应征适应征Plummer et al10058例宫颈癌，8550宫颈鳞癌，1508宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌HPV16 感染与宫颈癌的相关具有普遍意义 宫颈鳞癌：HPV16占46-63%； HPV18占10-14% 宫颈腺癌和宫颈腺鳞癌：HPV18占37- 41%； HPV16占26-36%。 HPV分型检测应用（分型检测应用（2） 阴道镜阴道镜适应征适应征 CIN23 HR-HPV: 94.0%常见亚型常见亚型：HPV16、 33、58、31和52型Logistic Regression分析：HPV16、33
18、和31与CIN23相关，是主要致病型 国家十五科研攻关项目 HPV分型检测应用（分型检测应用（2） 阴道镜适应征阴道镜适应征 四四种种HPV亚型在亚型在 30岁妇女宫颈癌筛查中的作用岁妇女宫颈癌筛查中的作用HPV16亚型在亚型在 30岁妇女宫颈癌筛查中的作用岁妇女宫颈癌筛查中的作用2009年（年（ASCCP）最新）最新HPV检测指南检测指南HPV 阳性及细胞学正常HPV 16/18 (+)其他高危型阳性阴道镜重复细胞学和HPV 检测（间隔12个月）两者均阴性细胞学阴性HPV （+）阴道镜细胞学异常HPV （）参照ASCCP指南常规筛查（3年后）HPV分型检测应用（分型检测应用（3）-ASCUS
19、分层分层ASC病例的管理(2019ASCCP) 2019 consensus guidelines for management of women with abnormal cervical cancer screening tests AJOG.ORGHPV分型检测应用（分型检测应用（3）-ASCUS分层分层 316例ASCUS患者中, CIN级以上的阳性检出率为18.99%（60316）,宫颈细胞学诊断为ASCUS中,HR-HPV阳性率为 68.99%（218316）， ASCUS 组中HR-HPV阳性患者CIN级以上 宫颈病变的检出率高于HPV阴性者，差 异有统计学意义（P0.001）
20、HPV分型检测应用（分型检测应用（4）-绝经期妇女绝经期妇女LSIL 2019 consensus guidelines for management of women with abnormal cervical cancer screening tests AJOG.ORG“reflex” HPV 检测 6和12个月时细胞学 阴道镜 HPV 阴性或阴道镜未发现CIN 12个月时细胞学是推荐的 HPV 阳性或细胞学ASC-US 阴道镜是推荐的HPV 阴性或连续2次细胞学“阴性” 常规细胞学筛查是推荐的 消融或切除治疗CIN失败的比率在1%25%之间。系统性的综述表明，不同方法的整体失败率为5
21、%15%，不同方法间无显著差异。大多数失败发生在治疗2年后。 一个系统性综述报道，在治疗后20年内女性浸润癌的罹患率约10万分之56，高于美国普通人群（5.6每10万人年）。 HPV分型检测应用（分型检测应用（5）-宫颈病变的随访宫颈病变的随访治疗后随访中应用HPV DNA检测的系统性综述表明，其性能优于细胞学随访方法 。治疗后6个月HPV检测鉴别复发/持续性CIN的敏感 性达90%，而且保持这种水平到24个月。与 此相比，细胞学的敏感性大约为70%。 一些研究（不是所有研究）中，联合使 用HPV检测和细胞学可以增加敏感性。HPV分型检测应用（分型检测应用（5）-宫颈病变的随访宫颈病变的随访
22、对细胞学ASC-US、ASC-H或LSIL的CIN1推荐的管理方案是，12个月时HPV DNA检测或6个月、12个月时重复细胞学检测 对CIN2、3女性治疗后的管理方法包括6-12个月时进 行HPV DNA检测、单独6个月采用细胞学或联合使用 细胞学和阴道镜 HPV分型检测应用（分型检测应用（5）-宫颈病变的随访宫颈病变的随访 AIS的管理方案 6个月时联合使用 细胞学 HPV检测 宫颈管采样 阴道镜 HPV分型检测应用（分型检测应用（5）-宫颈病变的随访宫颈病变的随访HPV分型检测应用（分型检测应用（6）-指导疫苗的使用指导疫苗的使用疫苗是模拟HPV16/18的L1蛋白衣壳 （一种病毒样颗粒
23、-病毒脂蛋白）给HPV阴性的女性接种这两种疫苗后，有90%以上的人不会产生由HPV16/18型引起的癌前病变 到目前为止，这种高浓度，长效抗HPV持续感染的预 防疫苗才开展了六年 如果接受预防者在接种时已经HPV16/18阳性， 是否有治疗作用尚未明了下生殖道下生殖道HPV感染的干预治疗感染的干预治疗 HPV的感染是非系统性感染，只局限于最初的感染的部位，感染部位的局部细胞因子和非特异性的效应细胞，如单核细胞、巨噬细胞和NK细胞是阻止感染的第一道防线。 宣讲相关知识，调动患者免疫功能 增强生殖道局部免疫力，可加速对HPV的清除 用避孕套控制HPV在性伴间传播是有效和必要的 HPV是人类癌瘤发病
24、中唯一可以完全确认的致癌病毒。现今的研究甚至可以证实： 预防预防HPV感染就可以预防宫颈癌，感染就可以预防宫颈癌， 没有没有HPV感染就可以不罹患宫颈癌。感染就可以不罹患宫颈癌。HPV DNA 检测常用技术 基因芯片技术 二代杂交捕获 荧光定量PCR (一一) 基因芯片技术基因芯片技术玻璃芯片膜芯片流式荧光杂交法（液态芯片）固相芯片玻璃芯片与膜芯片（固相芯片）玻璃芯片与膜芯片（固相芯片） 玻璃玻璃芯片芯片 应用应用领域领域： 主要用于科研领域，如基因表达谱分析、基因多态性分析、大 规模序列分析、药物筛选、基因诊断的研究等 目前仅极少数用于临床检验等领域 局限：制作工艺相对复杂 信号检测需专门的
25、仪器设备（激光扫描仪） 阅读设备的成本局限（费用高昂） 应用领域应用领域： 高密度芯片目前仍主要用于科研领域 低密度芯片已经用于临床检验领域低密度芯片的低密度芯片的特点：特点： 工艺相对简便 信号检测简便 投入费用较低 现状现状：目前临床检测中，往往还不需要使用到大规模探针阵列， 从实用性、使用成本、方便性等角度考虑，低密度芯片 （十几个至几十个探针）更易于被接受膜芯片膜芯片亚能亚能HPV基因芯片检测系统基因芯片检测系统 PCR扩增结合DNA反向点杂交技术灵敏度更高实验室设置及操作流程应当符和规范PCR的检测结果是可靠的 检测通量大，可同时检测15种HPV亚型，包括13种高危型 探针设计，特异
26、性强 膜条显示检测结果，读取更方便 采用dUTP-UNG防污染体系，有效避免假阳性结果 检测数量随需而变，单人份、多人份检测任选 有力的临床试验数据证明 WHO国际癌症研究所在中国的研究项目显示，亚能对于高度病变 的检测灵敏度达100%100%、阴性预测值达99.7%99.7%，特异性、准确性和阳性预测值和都很高。 对约3000人份的临床数据显示，普通人群的HPV高危型感染率 为11%11%左右，医院高危人群的HPV高危型感染率为20%20%左右，这 与文献报道相当。亚能亚能HPV 基因分型技术原理（基因分型技术原理（PCR-反向点杂交法）反向点杂交法）一次杂交反应可以检测多种靶序列一次杂交反
27、应可以检测多种靶序列 PCR技术技术 聚合酶链式反应（PCR）： 利用DNA碱基互补配对原则及半保留复制的特性， 将目的DNA在体外进行大量复制 美国PE Cetus公司的Kary Mullis于1983年创建 1989年美国Science杂志将PCR 列为 十余项重大科学发明之首Polymerase Chain Reaction PCR技术原理技术原理 高温高温变性变性 低温低温退火退火 中中温温延伸延伸PCR三步曲：三步曲：l PCR 产物的生成量 以指数方式增加 PCR技术特点技术特点-高度的灵敏性高度的灵敏性 PCR 产物的生成量是以指数方式增加的核酸分子杂交核酸分子杂交核酸分子杂交是
28、指具有一定同源性的两核酸分子杂交是指具有一定同源性的两条条核酸核酸单链在一定的条件下可按单链在一定的条件下可按碱基互补碱基互补原原则则退火形成双链的过程。分子杂交具有退火形成双链的过程。分子杂交具有高高度度的的特异性特异性。 探针杂交体亚能亚能HPV 基因分型检测流程基因分型检测流程结果判读结果判读HPV16HPV6,52阴性样本单一感染多重感染亚能亚能HPV产品卖点产品卖点详见F:英硕力（三）亚能HPV产品卖点.pptHPV检测耗材列表及示意图检测耗材列表及示意图详见F:英硕力HPV 基因分型检测常用耗材图示.doc实验室仪器设备清单实验室仪器设备清单详见F:英硕力实验室仪器设备清单-201
29、91227.xlsHPV主要竞争产品介绍主要竞争产品介绍 高灵敏度 - PCR 高特异性 - 核酸分子杂交 高通量 - 膜上固定多种探针 安全无毒 - 生物素标记如果PCR产物和探针配对，则微球上相应探针捕获到标有Biotin的PCR产物，加入荧光标记StrepAvidin-PE后，形成微球-探针-PCR产物-Biotin-StrepAvidin-PE复合物。在检测仪上即可检测到对应微球的荧光信号。 如果PCR产物与探针不配对， 则对应微球的荧光信号为背景 信号。 流式流式荧光杂交法操作流程荧光杂交法操作流程PCR 扩增DNA提取编码微球与探针混合向检测板中加入微球-探针杂交液，加入PCR产物
30、PCR产物变性杂交，48，30min加入链霉亲和素标记的藻红蛋白，15 minLuminex 100 多功能流式分析仪检测代表厂家代表厂家：上海透景人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒检测的检测的基因型：基因型：19种高危型： 16,18,31,33,35,39,45,51,52, 56,58, 59, 68,73,83，26, 55, 61,66种低危型： 6,11,40,42,44,53,54 认证：认证：国食药监械(准)字2009第3400020号进口专用仪器进口专用仪器(美国Luminex多功能流式点阵分析仪）HPV 61 型为低危型！参照：N Engl J M
31、ed 2019;348:518-27Luminex 100Luminex 100TMTM多功能流式点阵仪多功能流式点阵仪流式荧光流式荧光杂交法杂交法 - 不不定量定量流式荧光杂交法总结流式荧光杂交法总结 结合普通PCR技术，核酸分子杂交技术和荧光标记 技术尚不成熟，灵敏度和特异性有待提高 无洗涤步骤，无法去除非特异性杂交，且有背景荧 光信号干扰 技术难点为探针与微球的交联，产品性能上存在不 稳定性 只分型，不定量 需价格昂贵的流式荧光检测仪计算机判读15 min杂交60 min抗体捕获60 min第二抗体结合，化学发光30 minDNA变性45 min吸取变性剂于对照和样本管中旋涡振荡10秒6
32、5孵育45分钟，采用Microplate heater IHC2操作步骤操作步骤-DNA 变性变性将已变性的样本混匀，吸取75 ul 于“杂交微孔板”中20-25孵育10分钟加入25 ul 高危HPV探针于微孔板中65孵育60分钟置于Rotary Shaker I中，1100 rpm，32分钟准备HPV 探针混合物HC2操作步骤操作步骤-杂交杂交将杂交产物转移至“捕获微孔板”相应的小孔中20-25孵育30-45分钟20-25孵育60分钟， 1100 rpm加入75 ul Detection Reagent 1（碱性磷酸酶偶联的抗体）于“捕获”微孔板相应的小孔中HC2操作步骤操作步骤-抗体捕获及
33、酶标抗体捕获及酶标洗涤微孔板：采用Automated Plate Washer I或进行手动洗板，重复洗6次加入75 ul Detection Reagent 2 （化学显色底物）于“捕获”微孔板相应的小孔中20-25孵育15-30分钟采用Digene microplate luminometer (DML2000)读数 HC2操作步骤操作步骤-洗板及化学显色洗板及化学显色HC2如何进行结果判读如何进行结果判读?1 、阴性、阴性对照对照 每次实验必须同时做3份阴性对照份阴性对照。阴性对照的结果必须为10-250 RLU（相对光单位）。变异系数（变异系数（%CV）应该25%，如果25%，那么去掉
34、偏离平均值最远的一个阴性对照，用剩下的两个阴性对照计算平均值以及变异系数。 %CV必须25%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告2. 标准品标准品 每次实验必须同时做3份高危份高危HPV标准品标准品。 %CV应该15%，如果15%，那么去掉偏离平均值最远的一个标准品，用剩下的两个标准品计算平均值以及变异系数。 %CV必须15%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告3. 用标准品平均值（用标准品平均值（MHRC）以及阴性对照平均值）以及阴性对照平均值MNC计算计算MHRC/ MNC比值比值.2.0MHRC/ MNC 15。如果2.0 或15，本次实验结果无效，必须重
35、做。4. 如果符合以上的标准，检测结果是可靠的。如果符合以上的标准，检测结果是可靠的。此时的Cutoff值值（阳性标本评判的标准）就是MHRC阴性对照阴性对照 （NC）高危高危HPV标准品标准品(HRC)9731210133591307平均值平均值96318%CV4.94.7HRC/ NC3.31Cutoff 值=318，所有标本的相对光单位（RLU）应该转换为与Cutoff值的比值，比值大于1为阳性，比值小于1则为阴性 阳性阳性结果的判定结果的判定 质质 控控对照对照HPV 基因基因型型预期的结果预期的结果（RLU/Cutoff值）值）最小值最小值最大值最大值QC1-LRHPV 60.001
36、0.999QC2-HRHPV 1628HC2技术总结技术总结 技术上，采用核酸分子杂交，抗体捕获（吸附杂交体），化学显色 不分型 不能检测HPV多重感染 不定量 有交叉杂交反应 每次需要消耗8个参考品，试剂成本高 手动操作很多，步骤繁琐 需价格昂贵的基因杂交信号放大系统(三三) 荧光定量荧光定量PCR技术技术 原理： 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累,实时监控整个PCR过程,最后通过标准曲线对起始模板量进行定量分析. 定量，不分型荧光基团的分类荧光基团的分类化化 学学 原原 理理荧光定量荧光定量PCR-基于基于Taqman探针探针化化 学学 原原 理理荧光定量荧光定量PCR技
37、术总结技术总结 能定量检测HPV拷贝数 灵敏度高 不分型 不能检测HPV多重感染 检测通量有限，目前最多检测13种高危型 需价格昂贵的荧光定量PCR仪（四）原位杂交（四）原位杂交 采用荧光、生物素、地高辛等标记的探针，依据碱基互补配对原理，与组织切片、细胞涂片等标本中的靶序列特异杂交，经信号放大及显色后，显微镜下观察结果原位杂交试剂盒原位杂交试剂盒代表厂家：北京中杉金桥生物技术有限公司原位杂交实验步骤原位杂交实验步骤以地高辛标记以地高辛标记HPV DNA探针为例探针为例 4-6mm切片，用处理过的玻片捞片。 56-60烤片，2-16小时。 新鲜二甲苯脱蜡，10分钟2次。 100%乙醇5分钟2次
38、，空气干燥。 加入50ml胃酶工作液，37消化30分钟。 弃去胃酶工作液，逐级酒精脱水1分钟3次，空气干燥。 加10-20ml探针，加盖玻片。用橡胶水泥将盖片周围密封（目录编号ZLI-9601）。 变性95 5-7分钟。 杂交37 2-16小时。 揭去橡胶水泥，将切片插入PBS/TBS缓冲液中以便去掉盖玻片，约5-10分钟。 每张切片加入2-3滴杂交后洗液，37孵育15分钟。 PBS/TBS缓冲液洗，1分钟3次。 每张切片加入适量辣根酶标记抗地高辛抗体，37孵育30分钟。 PBS/TBS缓冲液洗，1分钟3次。 滴加适量DAB工作液，镜下观察显色结果，约3-10分钟。 弃去显色液，蒸馏水或自来水
39、冲洗。 选择：每张切片加入1滴复染剂，5-10秒钟。 蒸馏水或自来水冲洗。脱水、透明、封片。原位杂交技术总结原位杂交技术总结 灵敏度低（无PCR扩增） 特异性高 检测通量低 不能分型 不能定量 操作步骤繁琐 非常费时，需要两天 HPV 检测产品无注册证，仅仅用于科研93Surface Plasmon Resonance，SPR 入射光(单波长偏振光)在玻片-金膜界面全反射，激发金膜中的自由电子产生表面等离子体。 当光波激发频率与表面等离子体的振动频率相等时，二者发生谐振，光能被吸收,反射光几乎完全消失,此时入射光的角度被称作SPR角（谐振角角（谐振角）。 反应曲线Time(s)SPR角(m)S
40、SSS传感芯片寡核苷酸探针PCR 产物变性dsDNAssDNA杂交1）核酸提取试剂2）PCR反应试剂3）SPR检测试剂和芯片HPV基因检测芯片，共26个通道，一个阴性，一个IC，24个hpv探针通道通道14151617181920212223242526类型类型51816835611427044435440阴性阴性通道 217： 高危HPV;通道 1825：低危HPV通道通道12345678910111213类型类型IC161831335258565966455339SPR HPV 检测芯片样品制备PCR扩增产物线上检测输出报告成品芯片包被分型探针固定包被芯片芯片基片SPR SPR 设设 备备
41、 简简 介介W2600型生物传感芯片阅读仪型生物传感芯片阅读仪W2600工作流程开始检测后系统自动进行以下动作：清空机器内部样品匣更换样品匣更换芯片匣清洗采样针、buffer针扫描芯片注入系统buffer注入系统buffer扫描芯片采样等待30min（杂交）扫描芯片输出检测结果SPR技术检测技术检测HPV 总结总结同样需要DNA 提取采用普通PCR扩增，核酸分子杂交采用SPR技术（物理手段）检测杂交信号无临床应用文献无注册证（六）HPV DNA 序列测定 经典方法:Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-Gilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1
42、977)与与 PCRPCR反应类似反应类似反应体系中包含反应体系中包含：模板模板 DNA, TaqDNA, Taq酶酶, , dNTPsdNTPs, , ddNTPsddNTPs和和测序测序引物引物反应过程：反应过程： 变性变性复性延伸复性延伸终止终止Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）（双脱氧核苷酸） ddNTPs 是反应 终止剂 可以当作正常碱 基参与复制，一 旦掺入DNA中， 其后延伸反应就 不能继续。*少一个OH脱氧脱氧核甘核甘酸与酸与双脱双脱氧核氧核甘甘酸酸结构结构比较比较双脱氧链终止法双脱氧链终止法测序原理测序原理 反应体系中
43、含有ddNTPs, 因此，在复制的延伸过程中，在DNA任何碱基位置都可能出现终止反应，从而形成不同长度的寡核苷酸混合物。 所以，每条寡核苷酸都有固定的起点，但有不同的终点，长度由ddNTPs掺入的位置决定。 在高分辨率的电泳条件下（如毛细管电泳）， 能够将长度相差一个碱基的寡核苷酸分离开。 ddNTPs包含4中双脱氧核苷酸，分别带有不同的荧光标记，当带有不同荧光标记的寡核苷酸依据长度大小先后通过荧光检测仪时，检测仪可以自动读取DNA上的核苷酸顺序凝凝 胶胶 电电 泳泳DNA在电泳中的迁移率与其片段长度有关，片段小的跑得快，片段大的跑得慢，因而彼此分离开。双脱氧链终止法测序原理示意图双脱氧链终止
44、法测序原理示意图DNA全自动分析仪全自动分析仪ABI 3100遗传分析仪 3700型全自动遗传分析仪安玛西亚DNA序列分析系统 377型遗传分析仪DNA提取PCR扩增PCR产物纯化（电泳或专用试剂盒）读取序列及分析测序仪检测产物纯化测序反应HPV DNA 测序流程测序法检测测序法检测HPV的局限性的局限性首先必须对待测样本进行PCR扩增，由于事先不知道是哪一种HPV 基因型的感染，所以必须采用通用引物进行PCR扩增单一感染（如HPV 16）多重感染（如HPV 16，18，52，58）鉴定无法鉴定基因型！DNA 测序技术总结测序技术总结 测序之前必须做对待测样本进行PCR扩增或DNA克隆 测序技
45、术的准确性依赖于引物的特异性难以对HPV 多重感染进行测序鉴定操作复杂，耗时测序仪价格昂贵国内开展基因测序的机构或企业非常少无注册证，仅仅用于科研各种各种HPV DNA 检测技术总结检测技术总结膜芯片膜芯片流式荧光流式荧光杂交法杂交法杂交捕获杂交捕获二代二代荧光定量荧光定量PCR原位杂交原位杂交SPR测序测序原理原理PCR+反向点杂交+化学显色PCR+杂交+荧光标记杂交+抗体捕获+化学显色PCR+荧光标记杂交+化学显色PCR+杂交+光学检测PCR+双脱氧链终止法探针固定探针固定方式方式固定于膜芯片上固定于微球上不固定无不固定金膜无能否分型能否分型分型分型不分型不分型不分型分型分型能否鉴定能否鉴
46、定多重感染多重感染能能不能不能不能能难信号检测信号检测手段手段化学显色荧光扫描化学显色荧光扫描化学显色SPR角荧光扫描灵敏度灵敏度高低低高低无文献高特异度特异度高低交叉反应高高无文献高检测通量检测通量高高低低极低高低仪器设备仪器设备要求要求低很高很高高低高很高有无注册有无注册证证有有有有无无无基因芯片技术特点基因芯片技术特点n 高高灵敏度灵敏度- PCR- PCRn 高高特异性特异性- - 核酸核酸分子杂交分子杂交n 高高通量通量- - 膜膜上固定多种探针上固定多种探针n 安全安全无毒无毒- - 生物素生物素标记标记 二、二、HPV HPV 主要竞争主要竞争产品产品n 基因芯片技术 代表厂家：
47、亚能、凯普、达安n 二代杂交捕获 代表厂家： Qiagen（凯杰）n 荧光定量PCR 代表厂家：港龙，达安，凯普，复星， 匹基n 流式荧光杂交法 代表厂家：上海透景 三、亚三、亚能能HPVHPV与竞争产品的对比与竞争产品的对比1、亚能和凯普HPV基因分型产品对比2、亚能基因芯片技术与二代杂交捕获对比3、亚能基因芯片技术与荧光定量PCR对比4、亚能基因芯片技术与流式荧光杂交法对比 亚 能 凯 普技术原理PCR+反向点杂交PCR+导流杂交（实质也是反向点杂交）经典杂交方法导流杂交是通过外力抽吸加压，人为缩短杂交时间杂交操作时间1份 标本 70min15份 75min25份 80min 48份 90
48、min96份 100min样本量越多，时间优势越明显！1份 标本 40min15份 60min1630份 60min23145份 60min34660份 60min46175份 60min5 7690份 60min696份 60min7 基本设备离心机、PCR仪、普通杂交仪（价格低廉）离心机、PCR仪、专用杂交仪（价格较贵）样本来源宫颈脱落细胞，疣体组织，病理石蜡切片，液基细胞学样本宫颈脱落细胞、疣体组织（一）亚能和凯普（一）亚能和凯普HPV基因分型产品对比基因分型产品对比亚能凯普DNA提取提取l提取试剂通过国家认证l提取试剂只含裂解液一种成分l提取试剂盒未通过国家认证l提取试剂分溶液,PCR
49、PCR反应液已分装扩增体系未分装，人工配制反应液杂交杂交l杂交前准备工作简单l常规杂交，常态性碰撞接触，多次接触，反应充分l杂交仪中空气传导加热，温度均匀、准确，更高特异性l独立杂交管内杂交，无交叉污染l仪器运转中操作者可休息l杂交前准备工作复杂，要通过一系列步骤人工分隔反应室l导流杂交，人为外力作用，一过性接触，反应不充分l杂交反应室之间温度有差异，特异性较差l反应室分隔不严，交叉污染l仪器运转中操作者不可休息凯普导流杂交仪凯普导流杂交仪亚能凯普洗膜洗膜洗膜充分，无杂交背景或浅背景洗膜不充分，且容易造成很深的杂交背景孵育孵育在孵育前无封阻步骤排出封阻液过程缓慢，且封阻效果对显色背景影响很大结
50、果结果判读判读l显色斑点大l判读结果受背景颜色影响小l膜条小，显色斑点小l判读结果受背景颜色影响大, 易造成错误判读检测检测通量通量l23型l无CP8304（81型），低危型l21型l无HPV73，83，MM4（82）而73、82型为IARC认定的15种常见高危型之一导流杂交法杂交效率和灵敏度导流杂交法杂交效率和灵敏度膜条膜条目的目的DNAn基因型特异性探针固定在膜条的特定位置n探针只占据膜条面积的极小部分n目的DNA在膜条上均匀分布，定向流动，一过性接触！n杂交上的DNA只占目的DNA的极小部分n杂交效率低，灵敏度低！亚能和亚能和凯普膜凯普膜条显色对比条显色对比亚能亚能凯普凯普膜条尺寸：12
