1、第七章第七章 色谱色谱色谱部分色谱部分第一节第一节 色谱法概述色谱法概述7.1.1 色谱法的特点、分类和作用色谱法的特点、分类和作用俄国植物学家茨维特在俄国植物学家茨维特在19061906年使用的装置：年使用的装置：色谱原型装置，如图。色谱原型装置，如图。 1、概述、概述n色谱法色谱法(chromatography)：以试样：以试样组分组分在固定相和流动相间的在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据离子交换或其他亲和作用的差异为依据而而建立起来的各种建立起来的各种分离分析方法分离分析方法称色谱法。称色谱法。有关名词：有关名词：色谱法的共同特点：
2、色谱法的共同特点： 任何色谱法都存在两个相，即流动相和固定任何色谱法都存在两个相，即流动相和固定相；流动相；流动 相可以是气体或液体，固定相为固体或涂渍相可以是气体或液体，固定相为固体或涂渍在固体表在固体表 面的高沸点液体；面的高沸点液体； 流动相对固定相作相对运动，它携带样品通过固定相；流动相对固定相作相对运动，它携带样品通过固定相； 被分离样品中各组分与色谱两相间具有不同的作用力，被分离样品中各组分与色谱两相间具有不同的作用力， 这种作用力一般表现为吸附力或溶解能力，正是这种这种作用力一般表现为吸附力或溶解能力，正是这种 作用力的差异导致通过各组分通过固定相时达到彼此作用力的差异导致通过各
3、组分通过固定相时达到彼此 分离。分离。2、色谱法分类、色谱法分类 （1 1）气相色谱）气相色谱：流动相为气体（称为载气）。流动相为气体（称为载气）。 按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱 按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱（2 2）液相色谱）液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。流动相为液体（也称为淋洗液）。 按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。 (3)其他色谱方法：其他色谱方法：薄层色谱和纸色谱、凝胶色谱法、薄层色谱和纸色谱、凝胶色谱法、 高效毛细管
4、电泳法等。高效毛细管电泳法等。 第二节第二节 气相色谱法气相色谱法(GC)Gas Chromatography（1）分离效率高：分离效率高： 复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2 2） 灵敏度高：灵敏度高： 可以检测出可以检测出g.gg.g-1-1(10(10-6-6) )级甚至级甚至ng.gng.g-1-1(10(10-9-9) )级的物质量级的物质量. .（3 3） 分析速度快：分析速度快： 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4 4） 应用范围广：应用范围广： 适用于沸点
5、低于适用于沸点低于400400的各种有机或无机试样的分析。的各种有机或无机试样的分析。 不足之处：不足之处： 不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。不适用于高沸点、难挥发、热不稳定物质的分析。 被分离组分的被分离组分的定性定性较为困难。较为困难。1、气相色谱法的特点、气相色谱法的特点7.2.1 概述概述当试样由载气携带进入色谱柱与固当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附定相接触时，被固定相溶解或吸附。随着载气的不断通入，被溶解或吸随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附附的组分又从固定相中挥发或脱附，挥发或脱附下的组分随着载气向前挥发或脱附下的组
6、分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附移动时又再次被固定相溶解或吸附。随着载气的流动，溶解、挥发，或随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。吸附、脱附的过程反复地进行。 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，）比，称为分配系数，用用K 表示，即：表示，即： 组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K 一定温度下，组分的分配系数一
7、定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；越大，出峰越慢；试样一定时，试样一定时，K主要取决于固定相性质；主要取决于固定相性质；每个组份在各种固定相上的分配系数每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；值是分离的基础；某组分的某组分的K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。时，即不被固定相保留，最先流出。 组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K7.2.2 气相色谱仪气相色谱仪包括进样装置和气化室包括进样装置和气化室气相色谱的分离系统是气相色谱的分离系统是色
8、谱柱色谱柱，常，常用的色谱柱有用的色谱柱有填充柱填充柱和和毛细管柱毛细管柱两两种：种：填充柱填充柱是以固体吸附剂或涂渍是以固体吸附剂或涂渍了固定液的载体颗粒填充到柱管内形成的柱子；了固定液的载体颗粒填充到柱管内形成的柱子；毛细毛细管柱管柱内没有填充颗粒，是将固定相涂渍或者以化学键内没有填充颗粒，是将固定相涂渍或者以化学键合方式附着到管内壁上。由于混合物各组分的分离在合方式附着到管内壁上。由于混合物各组分的分离在这里完成，所以它是色谱仪中最重要的部件之一。这里完成，所以它是色谱仪中最重要的部件之一。气液色谱填充柱的固定相通常由一种惰性多孔固体（称为气液色谱填充柱的固定相通常由一种惰性多孔固体（称
9、为担担体体）及在其表面上涂渍一层较薄的高沸点有机物（称为）及在其表面上涂渍一层较薄的高沸点有机物（称为固定固定液液）液膜构成。）液膜构成。1、担体、担体提供一个大的惰性表面，以便使涂渍的固定液膜有足够的容量。担体应提供一个大的惰性表面，以便使涂渍的固定液膜有足够的容量。担体应具有化学稳定性好、热稳定性好、有一定的机械强度、合适的颗粒及均具有化学稳定性好、热稳定性好、有一定的机械强度、合适的颗粒及均匀的粒径。常用的有硅藻土类。匀的粒径。常用的有硅藻土类。2、固定液、固定液对色谱分离起着决定性作用。应具有化学稳定性、热稳定性好、蒸汽压对色谱分离起着决定性作用。应具有化学稳定性、热稳定性好、蒸汽压低
10、、对分析样品有适合的溶解能力，并有高的选择性。固定液在操作温低、对分析样品有适合的溶解能力，并有高的选择性。固定液在操作温度下是一种液体，柱温不能超过固定液的最高使用温度，否则会使它大度下是一种液体，柱温不能超过固定液的最高使用温度，否则会使它大量随载气流失。量随载气流失。温控系统是用来设定，控制，测量色谱柱炉、气化温控系统是用来设定，控制，测量色谱柱炉、气化室、检测室三处的温度。室、检测室三处的温度。气化室的温度应使试样瞬时气化而又不分解。在一气化室的温度应使试样瞬时气化而又不分解。在一般情况下，气化室的温度一般应比试样中最高组分般情况下，气化室的温度一般应比试样中最高组分沸点高沸点高20-
11、30 C左右，左右，比柱温高比柱温高10 50 C。u火焰光度检测器火焰光度检测器flame photometric detector, FPD工作原理：工作原理：被分离的组分具有与被分离的组分具有与载气不同的热导系数，当检测器载气不同的热导系数，当检测器的金属丝被加热并温度达到恒定的金属丝被加热并温度达到恒定后，通过热导池的载气组成若发后，通过热导池的载气组成若发生变化就会带走与载气不同的热量，生变化就会带走与载气不同的热量，从而引起热敏元件阻值的变化。从而引起热敏元件阻值的变化。工作原理：工作原理：以氢气和空气的混合物燃烧火焰为能源，将进入检测以氢气和空气的混合物燃烧火焰为能源，将进入检测
12、器的有机物离子化，生成许多离子对，带电离子被安装在检测器器的有机物离子化，生成许多离子对，带电离子被安装在检测器上的电极吸引产生微弱的电流，经放大被记录仪记录。对含碳物上的电极吸引产生微弱的电流，经放大被记录仪记录。对含碳物质检测灵敏度高，而对不含碳物质无响应。质检测灵敏度高，而对不含碳物质无响应。7.2.3 色谱理论基础色谱理论基础无试样通过检测器时，检测到的信无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线号即为基线。基线基线基线漂移基线漂移2、色谱术语、色谱术语保留值保留值 A、时间表示的保留值、时间表示的保留值 保留时间（保留时间（tR）：）：组分从进样到柱后出现浓度极大值时组分从进样到柱后出
13、现浓度极大值时所需的时间所需的时间 死时间（死时间（tM）：）：不与固定相作用的气体（如空气）的保不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。留时间。 调整保留时间（调整保留时间（tR ）：）：tR= tRtM B、用体积表示的保留值、用体积表示的保留值 保留体积（保留体积（VR）：VR = tRF0 （ F0为色谱柱出口处的载气流量，为色谱柱出口处的载气流量， 单位：单位：m L / min。）。） 死体积（死体积（VM）： VM = tM F0 调整保留体积（调整保留体积（VR）： V R = VR VM 组分组分2与组分与组分1调整保留值之比：调整保留值之比： r21 = tR2 / tR
14、1= VR2 / V R1 相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。的选择性。C. 相对保留值相对保留值r213、色谱分析的基本理论、色谱分析的基本理论4、色谱操作条件的选择、色谱操作条件的选择(1)、 固定相的选择固定相的选择 气液色谱，应根据“相似相溶”的原则分离非极性组分时，通常选用非极性固定相。各组分按沸点顺序出峰，低沸点组分先出峰。 分离极性组分时，一般选用极性固定液。各组分按极性大小顺序流出色谱柱，极性小的先出峰。分离非极性和极性的（或易被极
15、化的）混合物，一般选用极性固定液。此时，非极性组分先出峰，极性的（或易被极化的）组分后出峰。醇、胺、水等强极性和能形成氢键的化合物的分离，通常选择极性或氢键性的固定液。组成复杂、较难分离的试样，通常使用特殊固定液，或混合固定相。(2)、柱长和柱内径的选择、柱长和柱内径的选择 增加柱长对提高分离度有利，但组分的保留时间tR ，且柱阻力，不便操作。 柱长的选用原则是在能满足分离目的的前提下，柱长的选用原则是在能满足分离目的的前提下，尽可能选用较短的柱，有利于缩短分析时间。尽可能选用较短的柱，有利于缩短分析时间。填充色谱柱的柱长通常为13米，内径34厘米。 首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度（超
16、过该温度固定液易流失）和最低使用温度（低于此温度固定液以固体形式存在）范围之内。 柱温升高，分离度下降，色谱峰变窄变高。柱温，被测组分的挥发度，即被测组分在气相中的浓度，K，tR，低沸点组份峰易产生重叠。 柱温，分离度，分析时间。对于难分离物质对，降低柱温虽然可在一定程度内使分离得到改善，但是不可能使之完全分离，这是由于两组分的相对保留值增大的同时，两组分的峰宽也在增加，当后者的增加速度大于前者时，两峰的交叠更为严重。 柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。 组分复杂，沸程宽的试样，采用程序升温。A.A.利用纯物质定性的方法利用纯物质定性的方法 利用保留值定性利用保留值定性：通过对比
17、试样中具有与纯物质相同保通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。 利用加入法定性利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。色谱峰的相对变化。 B.B.利用文献保留值定性利用文献保留值定性 相对保留值相对保留值r r2121：相对保留值相对保留值r r2121仅与柱温和固定液性质有仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留关
18、。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。数据，可以用来进行定性鉴定。5、色谱定性、定量分析方法、色谱定性、定量分析方法小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定将待测组分的纯物质配成将待测组分的纯物质配成不同浓度不同浓度的标准溶液，使浓度与待的标准溶液，使浓度与待测组分接近，然后取固定量的上述溶液进行色谱分析，得到测组分接近，然后取固定量的上述溶液进行色谱分析，得到各标准样品的对应色谱图。各标准样品的对应色谱图。图图 某组分的标准物质的色谱图某组分的标准物质的色谱图图图 某样品的色谱图某样品的色谱图图图 标准（工作）曲线图标
19、准（工作）曲线图内标物要满足以下要求：内标物要满足以下要求：（1）试样中不含有该物质；）试样中不含有该物质；（2）与被测组分性质比较接近；）与被测组分性质比较接近；（3）不与试样发生化学反应；）不与试样发生化学反应；（4）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。）出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。试样配制：试样配制：准确称取一定量的试样准确称取一定量的试样W，加入一定量内标物，加入一定量内标物mS计算式：计算式：SsiisiSsiisiAfAfmmAfAfmm;100100100SsiiiSsiiiiiAfAfWmWAfAfmWmc%1. 内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍
20、许变内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。动对定量结果的影响不大。2. 每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。的快速分析。3. 若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定，则：常数SiiAAc %第三节第三节 高效液相色谱（高效液相色谱（HPLC） 特点：高压、高效、高速特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。1.1.流程流程(1) 高压输液泵高压输液泵主要部件
21、之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性外梯度外梯度: 利用两台高压输液泵，将两种利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱梯度混合室，混合后进入色谱柱。内
22、梯度内梯度: 一台高压泵一台高压泵, 通过比例调节阀通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。一定的比例抽入高压泵中混合。 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示： 柱体为直型不锈钢管，内径柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 紫外光度检测器（紫外光度检测器（UV）：）：最小检测量最小检测量10-9gmL-1，对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最常用的对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最
23、常用的检测器。检测器。4 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。合物。 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。选用原则与气相色谱一样。 选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。高的工作，一般很少自行制备。 选择短柱、细内径提高分析速度；选择短柱、细内径提高分析速度； 研制高效柱填料是一活跃领
24、域。研制高效柱填料是一活跃领域。 （1）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱）可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要。中显得特别重要。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。剂。 （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。相柱。 （3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型
25、分离柱上液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。的出峰顺序相反。 （1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。淀并在柱中沉积。（4）流动相同
26、时还应满足检测器的要求。当使用紫外）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。检测器时，流动相不应有紫外吸收。介绍介绍GPC以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、以凝胶为固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；聚合物在分离柱上按聚合物在分离柱上按分子流体力学体积大小被分离开分子流体力学体积大小被分离开.浓度检测器浓度检测器solventsolution体积大的
27、分子先体积大的分子先被淋洗出来被淋洗出来体积小的分子后体积小的分子后被淋洗出来被淋洗出来分子量越小，分子的体积越小，在流动过程中，不仅会从载体分子量越小，分子的体积越小，在流动过程中，不仅会从载体间较大空隙通过，还会从载体内部的小孔通过，经过的路程长；间较大空隙通过，还会从载体内部的小孔通过，经过的路程长；而体积大的大分子量的分子只能从载体间的空隙通过，经过的而体积大的大分子量的分子只能从载体间的空隙通过，经过的路程短，所以最大的分子会最先被淋洗出来。路程短，所以最大的分子会最先被淋洗出来。淋出体积代表了分子量的大小淋出体积代表了分子量的大小-M；浓度响应代表了含量浓度响应代表了含量-W(M)GPC曲线就是聚合物的分子量分布曲线曲线就是聚合物的分子量分布曲线浓度响应浓度响应淋出体积或淋出时间淋出体积或淋出时间W(M)M大大小小VelogMABCDV0logMalogMblogeMABV一般而言，分子量与淋出一般而言，分子量与淋出体积间具有如下关系体积间具有如下关系:当分子量大于当分子量大于Ma时时, 曲线如何曲线如何?当分子量小于当分子量小于Mb时时, 曲线如何曲线如何?色谱柱的分离范围色谱柱的分离范围: MbMaM1M2M3M4M5VeV1V2V3V4V5
