亲和萃取、沉淀和分离技术课件.ppt

1、亲和萃取、沉淀和分离技术6.1 亲和萃取6.2 亲和沉淀6.3 亲和膜技术6.4 分子印迹分离技术6.5 亲和反胶团萃取技术6.1 亲和萃取亲和萃取 亲和萃取简介 亲和配基高聚物的合成 亲和分配的影响因素和亲和模型 亲和分配的应用6.1.1 亲和萃取简介 萃取是一种常见的生化分离技术，生化分离萃取是一种常见的生化分离技术，生化分离技术的萃取技术包括双水相萃取、反胶团萃取等。技术的萃取技术包括双水相萃取、反胶团萃取等。亲和萃取就是将亲和层析的亲和配基用于萃取分亲和萃取就是将亲和层析的亲和配基用于萃取分离中，包括亲和双水相和亲和反胶团等。离中，包括亲和双水相和亲和反胶团等。分离蛋白亲和配基体系白蛋

2、白脂肪酸脂肪酸PEG/dextran碱性磷酸化酶Procion red HE-3GPEG/dextran, PEG/ 盐盐共脂肪酶（Colipase）卵磷脂卵磷脂LecithinPEG/dextran脱氢酶，激酶活性染料活性染料PEG/dextran, PEG/ 盐盐-2-巨球细胞Cu2+PEG/dextranS-23 骨髓瘤蛋白二硝基酚二硝基酚PEG/dextran3-氧代类固醇异构酶雌甾二醇雌甾二醇l lPEG/ dextran胰蛋白酶对氨基苯咪对氨基苯咪PEG/dextran亲和萃取简介常用的亲和配基、双水相体系和它们所对应分离的物质6.1.2 亲和配基高聚物的合成 亲和双水相中亲和配基

3、可固定在上相高聚物或下亲和双水相中亲和配基可固定在上相高聚物或下相高聚物上，甚至亲和配既可以以游离状态分配在体相高聚物上，甚至亲和配既可以以游离状态分配在体系中。系中。 一般配基固定在上相高聚物上，即将亲和配基通一般配基固定在上相高聚物上，即将亲和配基通过化学方法结合在过化学方法结合在PEGPEG上。上。主要包括以下两种主要包括以下两种: : PEG PEG 的活化的活化 亲和配基直接反应亲和配基直接反应6.1.3 亲和分配的影响因素和亲和模型影响亲和分配的影响因素包括普通双水相的影响因素如PEG浓度，还有: 配基浓度配基浓度 配基载体配基载体 染料配基染料配基 pH: pH: 增加，效率降低

4、增加，效率降低 温度温度: : 升高，效率降低升高，效率降低 盐浓度盐浓度 盐的种类添加盐时的添加盐时的log Klog K占不添加盐时的百分数（）占不添加盐时的百分数（）25mM63mM250mM磷酸钠（添加）100103甲酸钠，pH788醋酸钠，pH71059781丙酸钠，pH789Na2SO4988533KCl1048021Li2SO477Tris，pH776KI97691NaSCN67临苯二甲酸钾48NaClO442亲和分配的影响因素和亲和模型盐对分配系数的影响亲和分配的影响因素和亲和模型体系中的目标蛋白质被配基分子饱和时11)ln(dkRTG24)ln(dkRTG LKRTGln2p

5、KRTGln3cKRTGln5亲和分配的影响因素和亲和模型整个过程的自由能变可以列成如下算式G5G1G2G3G1 PdLdcKkKkK12)()(有N个结合位点的蛋白质而言 PNdLdCKkKkK12)()(LPCKNKKKlog)log(logmax亲和分配的影响因素和亲和模型 推导得目标蛋白质的结合位点不被配基聚合物饱和时NdLNdLPCkCkCKK21)(1)(16.1.4 亲和分配的应用 乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LHDLHD）的亲和分配）的亲和分配 6.1.4 亲和分配的应用 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸化脱氢酶（磷酸化脱氢酶（G6PDHG6PDH）的纯化）的纯化6.1.4 亲和分配的应

6、用 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸化脱氢酶（磷酸化脱氢酶（G6PDHG6PDH）的纯化）的纯化6.2 亲和沉淀分离技术亲和沉淀分离技术 亲和沉淀的原理 亲和沉淀聚合物和亲和配基 亲和沉淀可逆性聚合物亲和沉淀可逆性聚合物 亲和沉淀亲和配基亲和沉淀亲和配基 亲和沉淀的展望6.2.1 亲和沉淀的原理亲和沉淀的机理：亲和沉淀的机理： 加到含有目标分子得溶液中配体的连接 特异性结合 目标分子 形成亲和沉淀目标分子解离亲和沉淀原理图亲和沉淀(Affinity precipitation)是将生物专一性识别与沉淀分离相结合的纯化技术。亲和沉淀的优点 溶液中进行，无扩散传质阻力和结合时的空间位阻，溶液中进行，无扩

7、散传质阻力和结合时的空间位阻，亲和结合速度快，结合充分；亲和结合速度快，结合充分； 亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高；亲和配基裸露在溶液中，配基利用率高； 利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大大 亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒的料液中目标产物物 的纯化，可在分离操作的初期进行，这对目标分子是的纯化，可在分离操作的初期进行，这对目标分子是 极其有利的：因为粗料液中通常含有对目标产物有害极其有利的：因为粗料液中通常含有对目标产物有害 的杂质（如蛋白酶）。快速、有效地将目标产物分离的杂质（如蛋白酶）。

8、快速、有效地将目标产物分离 出来，有利于提高产品的质量和收率出来，有利于提高产品的质量和收率亲和沉淀机理 一次作用亲和沉淀一次作用亲和沉淀 (primary-effect precipitation) 二次作用亲和沉淀二次作用亲和沉淀 (secondary-effect precipitation) 亲和沉淀的机理分为两种 一次作用亲和沉淀 水溶性化合物分子偶联有两个或两个以上的亲和配基，水溶性化合物分子偶联有两个或两个以上的亲和配基，即双配基即双配基( (bis-ligand)bis-ligand)和多配基和多配基( (polyligand)polyligand) 通过与多价蛋白质通过与多价

9、蛋白质( (multivalent protein)multivalent protein)支联，在适支联，在适当的条件下，形成较大的支联网络而沉淀。当的条件下，形成较大的支联网络而沉淀。 一次作用亲和沉淀作用机理与抗原抗体的沉淀作用相一次作用亲和沉淀作用机理与抗原抗体的沉淀作用相似。存在着配基与蛋白质的结合部位的最优化使沉淀率似。存在着配基与蛋白质的结合部位的最优化使沉淀率最高。最高。 一次作用亲和沉淀虽然简单，但仅适用于多价、特别一次作用亲和沉淀虽然简单，但仅适用于多价、特别是是4 4价以上的蛋白质价以上的蛋白质 要求配基与目标分子的亲和结合常数较高要求配基与目标分子的亲和结合常数较高 沉

10、淀条件难于掌握，并且沉淀的目标分子与配基的分沉淀条件难于掌握，并且沉淀的目标分子与配基的分离需要凝胶过滤等难于大规模应用的附加工具，实用离需要凝胶过滤等难于大规模应用的附加工具，实用上存在较大难度。上存在较大难度。 另外，在一次作用亲和沉淀这常用的多配基染料有配另外，在一次作用亲和沉淀这常用的多配基染料有配基自交联基自交联( (ligandself-assoliation)ligandself-assoliation)的现象，成为交的现象，成为交联网络形成的竞争机制，从而阻碍了沉淀的生成。所联网络形成的竞争机制，从而阻碍了沉淀的生成。所以人们更多是采用二次作用亲和沉淀。以人们更多是采用二次作用

11、亲和沉淀。 一次作用亲和沉淀 二次作用亲和沉淀 制备亲和沉淀介质制备亲和沉淀介质: :利用在利用在物理场物理场如如pHpH、离子强度、离子强度、温度等温度等改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的改变时溶解度下降、发生可逆性沉淀的水溶水溶性聚合物性聚合物为载体为载体固定亲和配基。固定亲和配基。亲和介质结合目标分子后，通过亲和介质结合目标分子后，通过改变物理场改变物理场使使介质介质与目标分子共同沉淀与目标分子共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。的方法称为二次作用亲和沉淀。 离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白。沉淀清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。沉淀

12、清洗后加入洗脱剂即可纯化目标产物。二次亲和沉淀分离蛋白质示意图6.2.2 亲和沉淀聚合物和亲和配基 典型的亲和沉淀有以下步骤： 亲和沉淀介质的制备亲和沉淀介质的制备 将亲和沉淀介质加入含有目标蛋白质或酶的粗液中将亲和沉淀介质加入含有目标蛋白质或酶的粗液中 聚合物亲和配基目标蛋白的沉淀聚合物亲和配基目标蛋白的沉淀: : 通过降低聚合物的通过降低聚合物的 溶解度来实现溶解度来实现聚合物发生可逆性沉淀的方法： pHpH、温度、离子强度的改变温度、离子强度的改变 金属离子的添加金属离子的添加 水溶性有机溶剂的添加等水溶性有机溶剂的添加等选用何种方法取决于使用的配基载体，有时几种方法联合使用典型的亲和沉

13、淀有以下步骤（续）： 离心或过滤使沉淀分离，使目标蛋白就从杂蛋白中分离心或过滤使沉淀分离，使目标蛋白就从杂蛋白中分 离出来离出来 目标分子的解离：目前所采用的洗脱方式于亲和层析所目标分子的解离：目前所采用的洗脱方式于亲和层析所 使用的方法大致相同，如改变使用的方法大致相同，如改变pHpH值或离子强度来降低目值或离子强度来降低目 标成为与配基的亲和作用力。标成为与配基的亲和作用力。 配基的回收：如果目标蛋白的洗脱是在介质与目标蛋白配基的回收：如果目标蛋白的洗脱是在介质与目标蛋白 复合物不溶的状态下进行，配基可重新使用；否则，需复合物不溶的状态下进行，配基可重新使用；否则，需 要采取凝胶过滤等方法

14、分离要采取凝胶过滤等方法分离 亲和沉淀的有机聚合物，主要是亲和沉淀的有机聚合物，主要是可逆性沉淀聚合物可逆性沉淀聚合物即亲和即亲和载体载体( (affinity carrier)affinity carrier)或或可逆性溶解聚合物可逆性溶解聚合物 可逆性溶解聚合物可逆性溶解聚合物SISSIS（ Soluble and Insoluble Soluble and Insoluble PolymersPolymers）溶解和非溶解状态可随环境参数如溶解和非溶解状态可随环境参数如pHpH、温度等温度等的变化发生可逆变化，因此可用于酶或蛋白质的亲和沉淀。的变化发生可逆变化，因此可用于酶或蛋白质的亲和

15、沉淀。 可逆性溶解聚合物可逆性溶解聚合物可以直接和蛋白质结合发生亲和沉淀，可以直接和蛋白质结合发生亲和沉淀，但有时需要将亲和配基结在可逆性溶解聚合物上。但有时需要将亲和配基结在可逆性溶解聚合物上。亲和沉淀可逆性聚合物二次亲和沉淀选择可逆性聚合物的原则： 包含包含活性基团活性基团，以便亲和配基能够结合；，以便亲和配基能够结合； 不能和亲和配基强烈结合，不能和亲和配基强烈结合，以免配基不能和目标分子作用；以免配基不能和目标分子作用； 在一定条件下可以发生在一定条件下可以发生明显的可逆性的沉淀和溶解；明显的可逆性的沉淀和溶解； 分子量分子量分布窄；分布窄； 可形成可形成紧密的沉淀；紧密的沉淀； 易回

16、收易回收，有一定循环操作次数；，有一定循环操作次数； 廉价易得廉价易得亲和沉淀可逆性聚合物 (1) 天然的可逆性溶解聚合物 目前所使用的天然亲和配基载体主要是脱乙酰壳聚糖(chitosan)和藻酸盐(alginate): Chitosan Chitosan在在pHpH低于低于6 6时是可溶性的时是可溶性的，升高，升高pHpH值则会发生值则会发生 沉淀沉淀 藻酸盐是藻酸盐是D D甘露糖醛酸和甘露糖醛酸和L L葡萄糖醛酸的线性多聚葡萄糖醛酸的线性多聚 物，在物，在二价阳离子如二价阳离子如CuCu2+2+的存在下或的存在下或pHpH低于低于2 2的条件下的条件下 形成沉淀形成沉淀 SenstadSe

17、nstad和和MattiassonMattiasson将将大豆胰蛋白酶抑制剂大豆胰蛋白酶抑制剂( (soy soy bean trypsin inhibitor,STI)bean trypsin inhibitor,STI)共价偶联到亲和配基共价偶联到亲和配基载体载体ChitosanChitosan上，制成亲和沉淀介质上，制成亲和沉淀介质 结合胰蛋白酶结合胰蛋白酶( (trypsin)trypsin) 用用0.10.1M M的的NaOHNaOH调节溶液调节溶液PHPH值至值至8.58.5，介质与胰蛋白酶介质与胰蛋白酶一起沉淀，离心一起沉淀，离心 用用0.10.1M M的的glycine-gly

18、cine-盐酸缓冲液清洗，盐酸缓冲液清洗，胰蛋白酶与配基胰蛋白酶与配基STISTI解离（此时解离（此时PHPH约约2.52.5），胰蛋白酶收率为），胰蛋白酶收率为8686。 研究表明，为了使沉淀更完全，应适当延长时间，因研究表明，为了使沉淀更完全，应适当延长时间，因为亲和作用进行很快，但为亲和作用进行很快，但沉淀步骤相对来说要缓慢得沉淀步骤相对来说要缓慢得多。多。 (1) 天然的可逆性溶解聚合物(应用pH 敏感性) 孙彦等人研制了孙彦等人研制了含有共轭二炔结构单元的磷脂酰乙醇胺型含有共轭二炔结构单元的磷脂酰乙醇胺型聚合脂质体聚合脂质体( (Polymerized Liposome, PLS)P

19、olymerized Liposome, PLS)。磷脂酰乙醇胺的水悬浮液磷脂酰乙醇胺的水悬浮液在超声波处理下形成在超声波处理下形成0.1-0.20.1-0.2mmmm的球形液泡状磷脂双分子膜，的球形液泡状磷脂双分子膜，即脂质体即脂质体( (liposome)liposome)，表面表面为亲水性乙醇胺基团。为亲水性乙醇胺基团。该脂质体溶液在紫外线照射下可发生聚合反应，该脂质体溶液在紫外线照射下可发生聚合反应，形成聚合形成聚合脂质体，即脂质体，即PLSPLS。 向向PLSPLS溶液加入溶液加入NaClNaCl，当当NaClNaCl浓度超过浓度超过0.170.17mol/Lmol/L时时，在渗，在

20、渗透压作用下透压作用下PLSPLS发生快速完全的沉淀。发生快速完全的沉淀。 离心回收沉淀后向其中离心回收沉淀后向其中加入水或低浓度盐溶液加入水或低浓度盐溶液，沉淀重新，沉淀重新溶解。溶解。(2) 合成可逆性溶解聚合物(应用离子强度敏感性) 可逆沉淀性聚合物可逆沉淀性聚合物聚合脂质体（聚合脂质体（polymerized liposome,PLS） n PLSPLS具有在具有在盐的作用盐的作用下发生可逆性沉淀的性质。下发生可逆性沉淀的性质。 将将大豆胰蛋白酶抑制剂（大豆胰蛋白酶抑制剂（STISTI共价偶联共价偶联PLSPLS的表面，制成的表面，制成亲和沉淀介质亲和沉淀介质STISTIPLSPLS。

21、 加入猪胰提取液中，加入猪胰提取液中，用用0.10.1M M的的NaClNaCl沉淀，离心沉淀，离心，并用，并用0.010.01M M的的NaOHNaOH洗脱胰蛋白酶。洗脱胰蛋白酶。 结果表明，此法亲和沉淀的胰蛋白酶收率在结果表明，此法亲和沉淀的胰蛋白酶收率在8080以上，纯以上，纯化倍数达到化倍数达到8 8，比活达到，比活达到1300013000U/mgU/mg，接近纯酶的水平。接近纯酶的水平。 PLSPLS的优点是，在的优点是，在很宽的很宽的PHPH值范围内和有机溶解值范围内和有机溶解中均表现中均表现出良好的稳定性，经配基修饰后具有很好的蛋白质亲和沉出良好的稳定性，经配基修饰后具有很好的蛋

22、白质亲和沉淀特性：淀特性：蛋白质吸附容量大，无非特异性吸附。蛋白质吸附容量大，无非特异性吸附。 (2) 合成可逆性溶解聚合物(应用离子强度敏感性) 可逆沉淀性聚合物可逆沉淀性聚合物 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 亲和配基载体亲和配基载体Eudragit S-100Eudragit S-100，它是甲基丙烯酸它是甲基丙烯酸( (methacrylic acid)methacrylic acid)和甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯( (methyl methyl methacrylate)methacrylate)的聚合物。的聚合物。 Eudragit S-100Eudragit S-100在在PHPH低于

23、低于5 5时发生可逆性沉淀；时发生可逆性沉淀；在在( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 4或或PEG8000PEG8000存在的情况下，沉淀发生的存在的情况下，沉淀发生的PHPH值相值相对高一些。对高一些。 EudragitEudragit与与亲和配基染料亲和配基染料Cibucron BlueCibucron Blue的复合物的复合物Eudragit-Cibacron BlueEudragit-Cibacron Blue在在CaCa2+2+存在的条件下，温度达存在的条件下，温度达到到4040，在任何在任何PHPH值范围内都会发生可逆性沉淀。值范围内都会发生可逆性沉淀。 这就扩大了这就扩大

24、了EudragitEudragit的应用范围，的应用范围，尤其是对那些在酸尤其是对那些在酸性条件容易变性的酶类。性条件容易变性的酶类。 (2) 合成可逆性溶解聚合物 亲和沉淀的亲和配基 在很多情况下，亲和沉淀时将亲和配基固定在可逆性溶在很多情况下，亲和沉淀时将亲和配基固定在可逆性溶解聚合物上，亲和沉淀的亲和配基和亲和层析的配基没解聚合物上，亲和沉淀的亲和配基和亲和层析的配基没有太大差异，有太大差异，包括生物专一性配基如辅酶、蛋白质包括生物专一性配基如辅酶、蛋白质A A及及非专一性亲和配基如染料、金属离子等。非专一性亲和配基如染料、金属离子等。 采用双金属离子螯和的双功能试剂，将金属离子固定在采

25、用双金属离子螯和的双功能试剂，将金属离子固定在一些可以固定金属离子的二聚物如一些可以固定金属离子的二聚物如poly-VI-VCLpoly-VI-VCL和和poly-poly-VI-PIPAMVI-PIPAM。这些聚合物上有多个咪唑基，可以结合金属这些聚合物上有多个咪唑基，可以结合金属离子离子CuCu2+2+。CuCu2+2+-poly-VI-NIPAM-poly-VI-NIPAM已成功地用来沉淀分离已成功地用来沉淀分离大豆蛋白酶抑制剂；大豆蛋白酶抑制剂；CuCu2+2+-poly-VI-VCL-poly-VI-VCL可用于分离纯化可用于分离纯化乙酸脱氢酶。乙酸脱氢酶。 NH(CH2CH)n(C

26、H2CH)mHNOH(CH2CH)n(CH2CH)mHNCONHCHH3CCH3poly-VI-NIPAM poly VI-VCL 亲和沉淀的亲和配基 6.2.3 亲和沉淀的展望亲和沉淀是一种简单、高效的分离纯化技术，已在多种蛋白的分离纯化中应用。 pH敏感性亲和沉淀敏感性亲和沉淀 热诱导亲和沉淀热诱导亲和沉淀 离子强度敏感性的亲和沉淀离子强度敏感性的亲和沉淀 亲和沉淀和其他技术的集成亲和沉淀和其他技术的集成 制备规模的亲和沉淀制备规模的亲和沉淀 (1) pH敏感性亲和沉淀 pHpH敏感性聚合物本身带有电荷，当它的净电荷减少时，溶敏感性聚合物本身带有电荷，当它的净电荷减少时，溶解度降低而发生沉

27、淀，通过改变解度降低而发生沉淀，通过改变pHpH值改变其溶解状态，以值改变其溶解状态，以此类聚合物作为载体结合亲和配基用于亲和沉淀。此类聚合物作为载体结合亲和配基用于亲和沉淀。pHpH敏感敏感性聚合物包括：性聚合物包括： 天然可逆性聚合物：脱乙酰壳聚糖天然可逆性聚合物：脱乙酰壳聚糖( (chitosan)chitosan)、藻酸盐藻酸盐 ( (alginate)alginate)、纤维素衍生物（纤维素衍生物（cellulosecellulose）；）； 合成可逆性聚合物：丙烯酰胺、合成可逆性聚合物：丙烯酰胺、N-N-丙烯酰丙烯酰- -p-p-氨基苯酸、氨基苯酸、N-N- 丙烯酰丙烯酰- -m-

28、m-氨基苯酰胺的共聚物，甲基丙烯酸氨基苯酰胺的共聚物，甲基丙烯酸( (methacrylic methacrylic acid) acid)和甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸甲酯( (methyl methacrylate)methyl methacrylate)的聚合的聚合 物，异丁烯酸物，异丁烯酸- -异丁烯酸甲酯共聚物等异丁烯酸甲酯共聚物等 对某些可逆溶解性聚合物，对某些可逆溶解性聚合物，通过改变温通过改变温度可改变溶解度。度可改变溶解度。在亲和沉淀中使用的热聚在亲和沉淀中使用的热聚合物用于蛋白质的分离纯化时，能够进行特合物用于蛋白质的分离纯化时，能够进行特异性沉淀，称为热诱导亲和沉淀。其原理

29、是异性沉淀，称为热诱导亲和沉淀。其原理是利用双官能团试剂，利用双官能团试剂，其中一部分功能基团与其中一部分功能基团与被分离的生物分子特异性结合，另一部分功被分离的生物分子特异性结合，另一部分功能基团在介质性质尤其是温度变化后能形成能基团在介质性质尤其是温度变化后能形成沉淀。沉淀。(2) 热诱导亲和沉淀 对氨基苯甲眯结合到异丙基酰胺的共聚物上就得到已蛋对氨基苯甲眯结合到异丙基酰胺的共聚物上就得到已蛋白酶的热亲和沉淀聚合物，白酶的热亲和沉淀聚合物，将这种沉淀剂加入胰蛋白酶将这种沉淀剂加入胰蛋白酶提取液中形成以蛋白酶提取液中形成以蛋白酶- -聚合物复合体聚合物复合体。 滤液中剩余的酶活仅为原酶活的滤

30、液中剩余的酶活仅为原酶活的7%7%。过滤得到沉淀复合。过滤得到沉淀复合物，物，加入缓冲液中加热，使胰蛋白酶和聚合物脱离加入缓冲液中加热，使胰蛋白酶和聚合物脱离，得，得到分离纯化的酶。到分离纯化的酶。 热诱导亲和沉淀可以和亲和配基如金属离子结合起来，热诱导亲和沉淀可以和亲和配基如金属离子结合起来，如如Cu-IDA-PVCLCu-IDA-PVCL是一种人诱导聚合物，可用于乙酸脱氢是一种人诱导聚合物，可用于乙酸脱氢酶的分离纯化。酶的分离纯化。(2) 热诱导亲和沉淀（应用）(3) 离子强度敏感性的亲和沉淀 此类聚合物在很宽的此类聚合物在很宽的pHpH范围内对有机溶剂表现出良范围内对有机溶剂表现出良好的

31、稳定性，好的稳定性，当添加或除去盐是发生可逆性沉淀。当添加或除去盐是发生可逆性沉淀。 孙彦等人研制了含有共轭二炔结构单元的磷脂酰乙孙彦等人研制了含有共轭二炔结构单元的磷脂酰乙醇胺型聚合脂质体醇胺型聚合脂质体( (Polymerized Liposome,PLS)Polymerized Liposome,PLS)具有这具有这种性质，这在前面已经叙述过。种性质，这在前面已经叙述过。 (4) 亲和沉淀和其他技术的集成 双水相萃取技术双水相萃取技术易于直接处理含细胞碎片的体系，可以易于直接处理含细胞碎片的体系，可以和亲和沉淀技术结合起来，提高分离效率。和亲和沉淀技术结合起来，提高分离效率。 Kamih

32、iraKamihira等人将亲和沉淀和双水相技术结合等人将亲和沉淀和双水相技术结合分离纯化蛋分离纯化蛋白质白质A A 亲和沉淀的可逆溶解聚合物亲和沉淀的可逆溶解聚合物Eudragit S-100Eudragit S-100，以以免疫球免疫球蛋白蛋白IgGIgG为配基为配基 EudragitEudragit主要分配在上相，因此和蛋白主要分配在上相，因此和蛋白A A 结合的结合的EudragitEudragit分配在上相，分出上相后，分配在上相，分出上相后，调节调节pHpH使使EudragitEudragit沉淀，再将沉淀复合物解离便可得到蛋白沉淀，再将沉淀复合物解离便可得到蛋白A A，同时上相的

33、同时上相的聚合物可以重复使用。具体过程如图所示。聚合物可以重复使用。具体过程如图所示。 制备规模的亲和沉淀(1) (1) T1T1中加入料液中加入料液(2) (2) 调节温度至调节温度至44(3) (3) 加入加入AMLAML和助滤剂和助滤剂(4) (4) 调节温度至调节温度至3030进行沉淀进行沉淀(5) 30(5) 30下，在下，在F1F1中进行混合物的过中进行混合物的过滤，在滤，在T2T2中收集滤液中收集滤液(6) 30(6) 30下，用硫酸铵溶液洗涤滤饼，下，用硫酸铵溶液洗涤滤饼，在在T2T2中收集滤液中收集滤液(7) 30(7) 30下，用洗脱液洗涤滤饼，在下，用洗脱液洗涤滤饼，在T

34、3T3中收集含有目标分子的洗脱液中收集含有目标分子的洗脱液(8) (8) 洗涤并回收洗涤并回收AMLAML和过滤助剂，重复利和过滤助剂，重复利用用6.3 亲和膜分离技术亲和膜分离技术 亲和膜的原理及特点 亲和膜的制备 膜材料和（基质）配基的选择膜材料和（基质）配基的选择 亲和膜的制备亲和膜的制备 亲和膜分离的理论模型 吸附模型吸附模型 亲和膜过程传质模型亲和膜过程传质模型 亲和膜分离技术的影响因素 亲和膜分离技术的应用6.3.1 亲和膜的原理和特点 亲和膜分离是将亲和分离技术和膜分离技术结合，它将亲和膜分离是将亲和分离技术和膜分离技术结合，它将亲和配基结合在分离膜上，利用膜作为基质，对膜进行改

35、性，亲和配基结合在分离膜上，利用膜作为基质，对膜进行改性，再按照吸附、清洗、洗脱和再生的过程，对生物产品进行分再按照吸附、清洗、洗脱和再生的过程，对生物产品进行分离纯化。离纯化。 亲和膜分离亲和色谱原理利用膜固定亲和配基利用膜固定亲和配基利用层析介质利用层析介质固定亲和配基固定亲和配基过程一般为低压，可连续操作一般为低压，可连续操作低、中、高都有，低、中、高都有，一般为间歇式操作一般为间歇式操作设备板式、卷式、中空纤维式板式、卷式、中空纤维式超滤或微滤膜超滤或微滤膜填料一般在柱中进行填料一般在柱中进行速度快，扩散阻力小快，扩散阻力小较慢，扩散阻力较大较慢，扩散阻力较大产物纯度相对较低纯度相对较

36、低纯度很高纯度很高亲和膜和普通的亲和层析的比较 具有相同传质效率的亲和膜与亲和色谱装置参数 中空纤维亲和膜装填100m凝胶粒子的亲和色谱装置流体停留时间0.014min34.7min装置体积0.773dm31070dm3平均流速1.4dm3/min1. 4dm3/min配基装填量1.9g1950g 膜多孔床上的配基和液流之间的扩散路径极短，膜多孔床上的配基和液流之间的扩散路径极短，传质速率很高，可更有效的利用配基，所以大大加快传质速率很高，可更有效的利用配基，所以大大加快了分离时间，提高了分离效率。了分离时间，提高了分离效率。 膜床的厚度一般较小，液流通过膜时的阻力也较膜床的厚度一般较小，液流

37、通过膜时的阻力也较小，因此压降也较小，便于实现大规模的分离和连续、小，因此压降也较小，便于实现大规模的分离和连续、自动操作。自动操作。 亲和膜的操作模式死端过滤模式死端过滤模式Dead-end mode错流过滤模式错流过滤模式Cross-flow mode 微孔亲和过滤膜 亲和超滤膜 亲和膜的形状 板式 圆盘式 中空纤维式 前两种较为简单，成本低，容量小，中空前两种较为简单，成本低，容量小，中空纤维式便于实现连续、自动、规模化操作纤维式便于实现连续、自动、规模化操作膜材料（基质）和配基的选择 亲和膜对基质材料的要求 (1) (1) 惰性；惰性； (2) (2) 具有亲水性；具有亲水性； (3)

38、 (3) 物理、化学性质稳定，同时机械稳定性也好；物理、化学性质稳定，同时机械稳定性也好； (4) (4) 多孔性，内外表面积大；多孔性，内外表面积大； (5) (5) 具有足够多的可利用的化学基团；具有足够多的可利用的化学基团； (6) (6) 非特异性吸附低；非特异性吸附低； (7) (7) 适于成膜适于成膜6.3.2 亲和膜的制备 亲和膜的制备常用亲和膜基质材料 脂族烃类（聚乙烯，聚丙烯，聚丙烯氢） 芳香族共聚物（聚碳酸酯，聚砜，聚醚砜） 脂族聚酰胺（尼龙6，尼龙66） 一些特殊的聚合物，如聚乙烯醇，纤维素和纤维素一些特殊的聚合物，如聚乙烯醇，纤维素和纤维素的衍生物等的衍生物等 膜材料制

39、造商膜特性应用NalgeneMemtek Corp.圆形圆形, ,2.5cm,4.7cm,2.5cm,4.7cm,孔径孔径0.20.2,0.5,0.5, ,交联、结合交联、结合酶及血清白蛋白的酶及血清白蛋白的纯化纯化ActidickFMC Corp.圆形圆形, , 孔径孔径1 1, ,交联、包埋交联、包埋肽、蛋白质及酶的肽、蛋白质及酶的固载化固载化MemSep 1010Millipore圆形圆形, ,床体积床体积1.41.4ml,ml,孔径孔径1.21.2，结合蛋白结合蛋白A 6mgA 6mg单抗和多抗的分离单抗和多抗的分离MemSep 1010Millipore床体积床体积4.94.9ml,

40、 ml, 蛋白蛋白A 28mgA 28mg单抗和多抗的分离单抗和多抗的分离NugelSeparation Corp.平板式平板式1010cmcm20cm, 20cm, 包埋、涂包埋、涂层、结合层、结合抗原、抗体、重组抗原、抗体、重组蛋白及酶的纯化蛋白及酶的纯化聚合物、硅胶聚合物、硅胶Biotechnology Inst. of Canada板式亲和超滤，结合型板式亲和超滤，结合型胰蛋白酶和胰凝乳胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的纯化蛋白酶的纯化PolymerBiochemic板式板式1515cmcmcm,cm,结合孔径结合孔径0.20.22 2细胞生长剂，细胞生长剂，IgGIgG、干扰素纯化干扰素纯化（

41、氨基苯甲醚）（氨基苯甲醚）Fiuka卷式（卷式（0.30.3cmcm3cm3cm），），结合孔结合孔径径0.20.2RNARNA、DNADNA转录，中转录，中性蛋白纯化性蛋白纯化Protrans大连化物所大连化物所板式板式1010cmcm10cm,10cm,结合孔径结合孔径0.20.20.50.5cmcm胰蛋白酶胰蛋白酶抑制剂的分离抑制剂的分离 亲和膜的制备亲和配基 特异性配基：只与其对应的分子特异性结合，如抗原、 抗体、激素、激素受体等 常见的特异性配基：常见的特异性配基： 肝素、伴刀豆蛋白肝素、伴刀豆蛋白A A、单克隆抗体、胰蛋白酶等单克隆抗体、胰蛋白酶等 通用型配基：与某一类物质结合 常

42、见的通用型配基：常见的通用型配基： NAD+ NAD+、NADP+NADP+等辅酶；等辅酶； Cibacron Blue F3G-ACibacron Blue F3G-A、Procion Red H-3BProcion Red H-3B、Procion Procion Blue MX-3GBlue MX-3G等活性染料等活性染料 金属离子（金属离子（CuCu2+2+、NiNi2+2+、FeFe2+2+、ZnZn2+2+）亲和膜的亲和配基一般可分为两类： 特异性配基和通用型配基配基应用的膜生物特异性配基Protein AProtein A中空纤维膜，平板膜中空纤维膜，平板膜白细胞间介素白细胞间介

43、素2 2受体受体中空纤维膜中空纤维膜肝素肝素聚合物聚合物/ /共聚物膜共聚物膜sartobindsartobind单克隆抗体单克隆抗体中空纤维中空纤维胰蛋白酶胰蛋白酶改性聚砜膜改性聚砜膜通用性配基Cibraon BlueCibraon Blue聚合物聚合物/ /共聚物膜共聚物膜sartobindsartobind，尼龙膜，壳聚糖膜尼龙膜，壳聚糖膜IDA-CuIDA-Cu2+2+改性改性PEPE膜，聚合物膜，聚合物/ /共聚物膜共聚物膜sartobindsartobind，改性聚砜膜改性聚砜膜苯丙氨酸苯丙氨酸改性改性PEPE膜膜组氨酸或糖多菌素组氨酸或糖多菌素尼龙尼龙6666平板膜平板膜常见亲和

44、膜配基间隔臂 在分离生物大分子时，若将亲和配基直接在分离生物大分子时，若将亲和配基直接结合到基质上，由于欲分离生物大分子的立体结合到基质上，由于欲分离生物大分子的立体构型使它很难接近介质上的配基产生亲和相互构型使它很难接近介质上的配基产生亲和相互作用，此即色谱分离中的作用，此即色谱分离中的“空间位阻空间位阻”效应。效应。这种情况在配基是小分子时表现尤为明显，为这种情况在配基是小分子时表现尤为明显，为了克服这种障碍，往往在介质和配基之间插入了克服这种障碍，往往在介质和配基之间插入一个具有一定几何长度的有机基团，即间隔臂，一个具有一定几何长度的有机基团，即间隔臂，以使欲分离的物质方便的接近亲和配基

45、上的作以使欲分离的物质方便的接近亲和配基上的作用位点。用位点。 对于一个理想的间隔臂，不仅要具有一定的长对于一个理想的间隔臂，不仅要具有一定的长度（至少要含度（至少要含3 3个以上原子），而且要求其自身不个以上原子），而且要求其自身不带任何电荷，疏水性也不能太强，不带任何附加的带任何电荷，疏水性也不能太强，不带任何附加的活性中心，以避免对分离物产生非特异性相互作用。活性中心，以避免对分离物产生非特异性相互作用。由于间隔臂既要与亲和介质相连，又要与配基相接，由于间隔臂既要与亲和介质相连，又要与配基相接，因此要求其分子上含有双官能团反应基。间隔臂长因此要求其分子上含有双官能团反应基。间隔臂长度一般

46、以度一般以5-505-50nmnm较为适宜。较为适宜。常用的间隔臂是含2个活泼氨基的二胺类化合物，如乙二胺、丙二胺、己二胺、对苯二胺等。此外许多氨基酸和肽类化合物，由于其分子含有氨基、羧基、羟基、巯基等可反应的基团，也可用作间隔臂。间隔臂亲和膜的制备 很多膜材料不能直接应用于亲和膜的分离，必须改很多膜材料不能直接应用于亲和膜的分离，必须改性后才可以使用。改性的目的侧重于增加膜的亲水性、性后才可以使用。改性的目的侧重于增加膜的亲水性、生物相容性，降低非特异性吸附，同时膜应具有良好的生物相容性，降低非特异性吸附，同时膜应具有良好的机械强度、孔结构、渗透性和均匀的孔分布。改性的膜机械强度、孔结构、渗

47、透性和均匀的孔分布。改性的膜再接上亲和配基制备成亲和膜。再接上亲和配基制备成亲和膜。 亲和膜的制备主要分为三步亲和膜的制备主要分为三步: :成膜、功能化、活化按机械先后顺序不同可分为以下两种途径： 膜材料膜材料功能化的膜材料功能化的膜材料功能化的膜功能化的膜活化的膜活化的膜 膜材料膜材料包埋或结合亲和配基包埋或结合亲和配基功能化的膜功能化的膜 亲和膜的制备 功能化，通过引用适当的基团，使膜改性； 活化，引入基团使膜的活性增强、能与配基作用 具体采用哪一种途径更好，因材料而异，一具体采用哪一种途径更好，因材料而异，一般认为活化在成膜后机械更好一些，成膜方般认为活化在成膜后机械更好一些，成膜方法有

48、法有溶胶凝胶转化法，静电纺丝法溶胶凝胶转化法，静电纺丝法纤维素亲和膜的制备 由于纤维素膜分子上有许多羟基，因此可以用碳二胺由于纤维素膜分子上有许多羟基，因此可以用碳二胺法，氧化物法等羟基活化方法进行活化法，氧化物法等羟基活化方法进行活化, ,然后结合上亲和然后结合上亲和配基。配基。 商振华等用商振华等用3-3-氯氯- -1,2-1,2-环氧丙烷活化纤维素以对苯二环氧丙烷活化纤维素以对苯二胺作为间隔臂，然后偶合牛血清白蛋白活性染料作配基，胺作为间隔臂，然后偶合牛血清白蛋白活性染料作配基，制得一系列亲和膜，并用于制得一系列亲和膜，并用于 - -干扰素、白蛋白、碱性磷干扰素、白蛋白、碱性磷酸酯酶等的

49、分离纯化，效果良好。酸酯酶等的分离纯化，效果良好。 纤维素膜的交联和活性染料配基的固载化 聚酰胺膜可以先用酸水解改性，然后结合上羟乙基纤聚酰胺膜可以先用酸水解改性，然后结合上羟乙基纤维素以增强反应基团的活性，而且降低蛋白质的非特异性维素以增强反应基团的活性，而且降低蛋白质的非特异性吸附。在亲和分离中，以尼龙膜居多。吸附。在亲和分离中，以尼龙膜居多。 水解后的尼龙水解后的尼龙6666微孔膜用二溴丙烷活化，接上己二胺微孔膜用二溴丙烷活化，接上己二胺做间隔臂，再用戊二醛法固载上组氨酸，制得的亲和膜可做间隔臂，再用戊二醛法固载上组氨酸，制得的亲和膜可成功地去除氨基酸注射液、牛血清蛋白、溶菌酶等医药制成

50、功地去除氨基酸注射液、牛血清蛋白、溶菌酶等医药制剂中的内毒素，去除率在剂中的内毒素，去除率在90%90%以上。以上。 聚酰胺亲和膜的制备膜亲和介质MAC-His-NL66的制备过程聚丙烯亲和膜的制备 聚丙烯膜多用辐射诱导接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯聚丙烯膜多用辐射诱导接枝甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMAGMA）的方法进行活化，接枝的的方法进行活化，接枝的GMAGMA环氧基可用以键合配基，环氧基可用以键合配基，剩余环氧基要转变为二醇基，或采用其他试剂封闭，降低非剩余环氧基要转变为二醇基，或采用其他试剂封闭，降低非特异性吸附。同时特异性吸附。同时GMAGMA还起到了间隔臂的作用。还起到了间隔臂的作用。 K