1、酶联免疫技术的发展与进展2022-7-13YHLO专业培训2内 容一、免疫分析的发展历史二、免疫分析技术的种类三、酶联免疫分析技术的发展历史四、酶联免疫分析技术的应用五、酶免疫分析技术的类型六、酶联免疫分析技术的设备七、酶联免疫分析技术的材料及物品八、酶联免疫分析技术的未来发展九、科乐士全自动酶免疫分析系统的特点十、科乐士产品的市场推广视角与辩点2022-7-13YHLO专业培训3一、免疫分析的发展历史 免疫学发展简史免疫学发展简史开创阶段：开创阶段：公元1018世纪，天花痘痂预防开花。兴起阶段：兴起阶段：公元18世纪20世纪中叶，牛痘苗预防天花，发 现细菌，建立感染免疫，细胞免疫和体液免疫学
2、 说，变态反应，免疫化学。飞跃阶段：飞跃阶段：从1908年埃利希提出侧链学说开始，对免记忆、 免疫识别，免疫耐受、自身免疫、免疫移植等。现代阶段：现代阶段：从1957年开始，各种新型免疫分析技术、免疫学 说、理论、临床应用、疾病诊治等取得重大进展。 根据所用的技术和方法，免疫学的发展历史可分根据所用的技术和方法，免疫学的发展历史可分为三个时期：为三个时期： 一、免疫学的经验时期（一、免疫学的经验时期（1717世纪世纪-19-19世纪）世纪） 1.1.用人痘苗接种预防天花。（中国民间）用人痘苗接种预防天花。（中国民间） 2.2.接种牛痘苗预防天花。接种牛痘苗预防天花。 JennerJenner
3、免疫发展历史中的重要发现和发明及人物 二、经典免疫学时期（二、经典免疫学时期（1919世纪中叶世纪中叶-20-20世纪中叶）世纪中叶） 免疫学与微生物学互相促进、共同发展免疫学与微生物学互相促进、共同发展 * * 多种病原菌被发现；多种病原菌被发现； * * “病原菌致病病原菌致病”概念的提出；概念的提出； * * 疫苗的发明；疫苗的发明； * * 细胞吞噬作用的发现（细胞免疫）；细胞吞噬作用的发现（细胞免疫）； * * 免疫血清具有抵御病原菌的作用（体液免疫）；免疫血清具有抵御病原菌的作用（体液免疫）； * * 免疫化学研究取得重大进展；免疫化学研究取得重大进展； * * 初步认识多种免疫学
4、现象的本质。初步认识多种免疫学现象的本质。Eli Metchnikoff (1845-1916)Emil von Behring (1845-1917)Robert Koch (1843-1910)Paul Ehrilich (1854-1915)提出体液免提出体液免疫理论和抗疫理论和抗体生成的侧体生成的侧链学说链学说发现细胞吞发现细胞吞噬作用，提噬作用，提出细胞免疫出细胞免疫理论理论发现结核杆发现结核杆菌；提出病菌；提出病原菌致病的原菌致病的概念概念发现抗毒素发现抗毒素并治愈一名并治愈一名白喉患者白喉患者 三三. .近代免疫学和现代免疫学时期近代免疫学和现代免疫学时期（ 20 20 世纪中叶
5、世纪中叶现在）现在） 特异性细胞的免疫功能、天然和获得性免疫耐受现象、抗特异性细胞的免疫功能、天然和获得性免疫耐受现象、抗体生成克隆学说、细胞克隆选择学说（体生成克隆学说、细胞克隆选择学说（clonal selectionclonal selection）* * BurnetBurnet（19571957年）提出克隆选择学说；年）提出克隆选择学说；* * 从器官、细胞和分子水平探讨免疫系统结构与功能。从器官、细胞和分子水平探讨免疫系统结构与功能。MacFarlane Burnet（1899-1985） 克隆选择学说克隆选择学说(clonal selection hypothesis)(clon
6、al selection hypothesis)的基本观点：的基本观点： 1. 1.机体内存在有能识别多种抗原的细胞系（机体内存在有能识别多种抗原的细胞系（cloneclone），其细胞），其细胞表面有识别抗原的特异性受体（表面有识别抗原的特异性受体（recepter)recepter)。 2.2.抗原进入机体后，选择具有相应受体的免疫细胞与之结抗原进入机体后，选择具有相应受体的免疫细胞与之结合合，使该细胞系活化、增殖，并成为抗体产生细胞和记忆细胞。，使该细胞系活化、增殖，并成为抗体产生细胞和记忆细胞。 3 3. .若在胚胎期，某抗原选择相应克隆接触后，该细胞系就被若在胚胎期，某抗原选择相应克
7、隆接触后，该细胞系就被排除或失去活性，处于抑制状态，称此为禁忌克隆（排除或失去活性，处于抑制状态，称此为禁忌克隆（forbidden forbidden cloneclone），使机体失去针对该抗原的反应性，形成免疫耐受。解），使机体失去针对该抗原的反应性，形成免疫耐受。解释了天然免疫耐受现象。释了天然免疫耐受现象。 4.4.某些克隆可发生突变，而与自身组织发生反应，形成自身某些克隆可发生突变，而与自身组织发生反应，形成自身免疫应答。免疫应答。 1960年，年，Burnet和和Medawar获诺贝尔奖。获诺贝尔奖。 鸡法氏囊及哺乳动物胸腺的免疫功能的认识鸡法氏囊及哺乳动物胸腺的免疫功能的认识淋
8、巴细胞免疫功能的确认淋巴细胞免疫功能的确认巨噬细胞抗原提呈作用的揭示巨噬细胞抗原提呈作用的揭示细胞因子细胞因子的研究的研究免疫学技术的发展（单克隆抗体标记技术、免疫转印技术、免疫学技术的发展（单克隆抗体标记技术、免疫转印技术、分子杂交技术、转基因技术、细胞融合技术等）。分子杂交技术、转基因技术、细胞融合技术等）。 20 20世纪获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家世纪获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家 年代年代 学者姓名学者姓名 国家国家 获奖成就获奖成就 19011901BehringBehring德国德国发现抗毒素，开创免疫血清疗法发现抗毒素，开创免疫血清疗法 19051905KochKoch德
9、国德国发现结核杆菌，发明诊断结核病的结核菌素发现结核杆菌，发明诊断结核病的结核菌素 19081908EhrlichEhrlich德国德国提出抗体生成侧链学说和体液免疫学说提出抗体生成侧链学说和体液免疫学说Metchnikoff Metchnikoff 俄国俄国发现细胞吞噬作用，提出细胞免疫学说发现细胞吞噬作用，提出细胞免疫学说 19121912CarrelCarrel法国法国器官移植器官移植 19131913RichetRichet法国法国发现过敏现象发现过敏现象 19191919BordetBordet比利时比利时发现补体发现补体, , 建立补体结合试验建立补体结合试验 19301930La
10、ndsteinerLandsteiner奥地利奥地利发现人红细胞血型发现人红细胞血型 19511951ThelerTheler 南非南非发明黄热病疫苗发明黄热病疫苗 19571957BovetBovet意大利意大利抗组胺药治疗超敏反应抗组胺药治疗超敏反应 19601960BurnetBurnet 澳大利亚澳大利亚提出抗体生成的克隆选择学说提出抗体生成的克隆选择学说MedawarMedawar英国英国发现获得性移植免疫耐受性发现获得性移植免疫耐受性 19721972EdelmanEdelman美国美国阐明抗体的化学结构阐明抗体的化学结构PorterPorter英国英国阐明抗体的化学结构阐明抗体的
11、化学结构 2022-7-13YHLO专业培训15 2020世纪获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家世纪获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家 19771977YalowYalow美国美国创立放射免疫测定法创立放射免疫测定法 19801980DaussetDausset法国法国发现人白细胞抗原发现人白细胞抗原SnellSnell 美国美国发现小鼠发现小鼠H-2H-2系统系统BenacerrafBenacerraf 美国美国发现免疫应答的遗传控制发现免疫应答的遗传控制JerneJerne丹麦丹麦提出天然抗体选择学说和免疫网络学说提出天然抗体选择学说和免疫网络学说 KohlerKohler德国德国杂交瘤技术制
12、备单克隆抗体杂交瘤技术制备单克隆抗体MilsteinMilstein阿根廷阿根廷 单克隆抗体技术及单克隆抗体技术及IgIg基因表达的遗传控制基因表达的遗传控制TonegawaTonegawa日本日本抗体多样性的遗传基础抗体多样性的遗传基础MurrayMurray美国美国第一例肾移植成功第一例肾移植成功ThomasThomas美国美国第一例骨髓移植成功第一例骨髓移植成功 19961996DohertyDoherty澳大利亚澳大利亚 提出提出MHCMHC限制性，即限制性，即T T细胞的双识别模式细胞的双识别模式ZinkernagelZinkernagel瑞士瑞士提出提出MHCMHC限制性，即限制性
13、，即T T细胞的双识别模式细胞的双识别模式2022-7-13YHLO专业培训17免疫分析技术的发展历史18961896年，年，Herbert发明特异性凝集现象,Widal发明Widal试验诊断 伤寒;18971897年，年，Kmus发现鼠疫杆菌的培养滤液能与相应抗血清发生沉淀 反应；18981898年年, , Kraus 发明沉淀试验18991899年，年，Bordet发现免疫溶血反应19001900年，年，Landsteiner在特异血凝现象的基础上发现了人类ABO血 型，1930 年获得诺贝尔生理学和医学奖。19021902年，年，Ascoli 建立了环状沉淀试验19051905年，年，B
14、echhold 建立了明胶沉淀试验19061906年，年，Wassermann发明梅毒补体结合反应2022-7-13YHLO专业培训18免疫分析技术的发展历史19351935年，年，Heidelberger，纯化抗体技术，定量沉淀反应19421942年，年，Coons建立了荧光素标记技术19461946年，年，Oudin建立了试管单向免疫扩散试验19511951年，年，Ouchterlony建立了双向平板法双向免疫扩散试验19531953年，年，Grabar建立了免疫电泳19531953年，年，Crabar与Williams建立补体结合技术19591959年，年，Singer首创免疫电镜技术1
15、9601960年，年，Yalow建立了放射免疫标记测定技术2022-7-13YHLO专业培训19免疫分析技术的发展历史19651965年，年，Mancini建立了平板单向免疫扩散试验19711971年，年，Engvall 和 Perlmann，Van Weeman 和 Schuurs 建立了酶标记的固相免疫测定技术 （ELISA）19711971年，年，Rubenstein等建立了均相酶免疫测定技术19751975年，年，Koher和 Milstein，杂交瘤技术制备单克隆抗 体19801980年，年，Tonegawa，免疫球蛋白基因结构 自然的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应）自然
16、的肉眼观察的抗原抗体反应（沉淀反应、凝集反应）加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）加速的肉眼观察的抗原抗体反应（电泳技术、分离技术）标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性标记性免疫技术提高抗原抗体反应的特异性、敏感性半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了半自动、自动化检验仪器与免疫反应原理结合，加快了反应过程反应过程标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合标记技术、单克隆技术、高智能自动化技术的最佳组合 免疫技术发展的发展进程2022-7-13YHLO专业培训21二、免疫分析技术的种类 分为两大类别：细胞免疫测定技术细胞免疫测定技术和体液免疫测定技术体液
17、免疫测定技术。 体液免疫技术体液免疫技术又可分为体内法体内法和体外体外法法。体外法即体外抗原抗体反应，包括抗原、抗体、补体以及其他有关因素的定量、半定量或定性测定方法，旧称血清学反应；体内法则利用皮肤试验进行检测。 细胞免疫测定细胞免疫测定也可以分为体外法体外法和体体内法内法两类。2022-7-13YHLO专业培训221 1、免疫沉淀技术免疫沉淀技术 包括液体内沉淀试验、凝胶内沉淀试验、免疫电泳、免疫比浊等。其中在经典的免疫电泳技术基础上，又衍生出对流免疫电泳、火箭免疫电泳、交叉免疫电泳、免疫固定电泳等许多新技术和新方法出现。免疫浊度法则可以分为免疫透射浊度、免疫乳胶浊度和免疫速率浊度测定法等
18、。2022-7-13YHLO专业培训232、免疫凝集技术 括血凝、胶凝、菌凝、碳凝等微粒技术。其中磁性微粒(magnetic microspheres, MMS) 是80年代初，用高分子材料和金属离子为原料，聚合而成的一种以金属离子为核心，外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒。在液相中，受外加磁场的吸引作用，MMS可快速沉降而自行分离，无需进行离心沉淀。因此，将MMS应用于免疫检测，可使操作过程大为简化。2022-7-13YHLO专业培训243、放射免疫技术 放射免疫测定法是以放射性同位素作为标记物的标记免疫测定方法，一般可以分为三种类型： 1、以同位素标记抗原和受检测标本中的抗原与抗体竞争结
19、合的经典放射免疫测定法，RIA。 2、以同位素标记的抗体与受检标本中的抗原结合，然后用固相抗原分离游离的标记抗体的免疫放射测定，IRMA。 3、以同位素标记的抗原或抗体及固相的抗原或抗体作为试剂，按固相酶免疫疫测定相似的方式检测受检标本中的抗原或抗体的固相放射测定，SPRIA。2022-7-13YHLO专业培训254、免疫荧光技术 分为免疫组织化学技术与免疫测定两大类。免疫荧光测定分均相与非均相。非均相荧光免疫测定与ELISA极为相似，差别仅为标记物和测定方式不同。而均相荧光免疫测定则有其特点，常用方式为时间分辨荧光法和均相荧光免疫测定。 荧光免疫组织化学技术则与组织化学染色技术相似，最后用荧
20、光显微镜判断结果。 2022-7-13YHLO专业培训265、酶联免疫技术 是以酶标记抗体或抗原作为主要试剂的免疫测定方法。是标记免疫技术应用于最广泛的一种，也是应用最多的一种标记免疫技术。 有关该类方法原理、分类、应用、特点、局限性等，将在后续介绍。2022-7-13YHLO专业培训276、免疫胶体金技术 是以胶体金标记物标记抗原或抗体，对样本中相应抗体或抗原进行检测。 检测方法包括组织细胞染色、层析、斑点，均为非均相检测法。未来可能发展均相检测法。2022-7-13YHLO专业培训287、补体结合试验 利用特异性抗体对红细胞的溶血作用需要补体参与而建立起来的一类检测方法。主要包括补体结合反
21、应和细胞溶解反应。 这类检测参与的反应物质有5种成分：已知抗原或抗体，待测抗体或抗原，溶血素、补体、红细胞。其中后起3种成份又称为指示系统。发生溶血反应为试验阴性，不发生溶血反应为试验阳性。2022-7-13YHLO专业培训298、中和试验 是用以测定抗体的中和能力的试验，即中某种抗原或中和携带该抗原的微生物的如病毒感染性或细菌毒素的生物学效应能力的试验。其可以中和该抗原的生物学效应之外，也可以用于疾病诊断或病毒鉴定。 该试验检测的是中和指数，目前较少应用。2022-7-13YHLO专业培训309、免疫组织化学 又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织
22、化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。2022-7-13YHLO专业培训3110、免疫电镜技术 是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。 特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。2022-7-1
23、3YHLO专业培训3211、流式细胞技术 能快速、精确地测量通过检测区液流中的各种粒子。这些粒子可以是细胞、大分子、乳胶滴或其他粒子。流式细胞术是对单细胞定量分析和分选的新技术。 通常是应用一个激光和有关的光学检测系统来收集这些信号以供分析。其检测速度之快，统计学精度之高，是其他方法无法比拟的。它可以研究一个细胞从新生到死亡，从细胞膜到脑浆和核内物质及染色体，还可以探讨不同物质之间的关系。同时它还可以从一个细胞中测得多种参数(如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等)，进行多信息分析，为细胞生物学和生物医学研究提供强而有力的手段。2022-7-13YHLO专业培训3312、免疫印迹技术 又称蛋白质
24、印迹（Western blotting），是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白（抗原）的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）或非变性电泳（Native -PAGE）等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。2022-7-13YHLO专业培训34三、酶联免疫分析技术的发展 对酶联免疫分析技术的文献分析对酶联免疫分析技术的文献分析 Fifa在Pub-Med检索系统中输入“enzyme-immunoassay”，“enzy
25、me-linked immunoasay”，“RIA”三个单词，从1965日至2005年，以每五年为一个阶段，检索了期间发表的论文，结果令人惊异。RIA法的高峰处在80年到90年之间，90年之后到2000年论文数量逐渐减少。而以EIA或者ELISA为关键词的文章，在80年以后迅速增长，90年代以后稳定在每5年4万篇左右，目前还未见有下降的趋势。2022-7-13YHLO专业培训35四、酶联免疫分析技术的应用 均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。 非均相免疫测定中的ELISA应用更为广泛，ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗体、“乙肝三对”、丙肝抗体、丁肝抗体、戊肝
26、抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。2022-7-13YHLO专业培训36主要试剂主要试剂: : 酶标记的抗体或抗原酶标记的抗体或抗原酶标物特点：酶标物特点： 免疫学活性免疫学活性 酶对底物的催化活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性+酶高效催化反应的专一性酶高效催化反应的专一性原理及特点原理及特点2022-7-13YHLO专业培训37邻苯二胺邻苯二胺 OPDOPD四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸5-AS
27、A 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 ABTSABTS常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物2022-7-13YHLO专业培训38酶联免疫分析技术的特点特异性高灵敏度高稳定性好操作简便对环境污染小成本较低2022-7-13YHLO专业培训39特点：特点：灵敏度高、特异性强、灵敏度高、特异性强、 准确性好准确性好酶标记试剂能够较长时酶标记试剂能够较长时 间保持稳定间保持稳定操作简便、对环境没有操作简便、对环境没有 污染。污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广衍生出适用范围更广 的新方
28、法的新方法。原理：原理：酶标抗体（抗原）与抗原酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析定性或定量的测定分析 原理及特点原理及特点2022-7-13YHLO专业培训40酶联免疫分析技术的局限性洗涤损失影响因素较多定性试验的阴性、阳性判定值与均相方法比较，定量检测中的准确度、精密度及线性尚欠理想。2022-7-13YHLO专业培训41应用酶联免疫分析的产品 据不完全统计，目前用ELISA技术建立或开发的检测项目多达千余项，通过商业机构可购的检测试剂盒多达300种，其中常用的检测
29、试剂盒有近100余种。 概括起来，可以这样描述，凡是可以取得抗原物质的所有物品，几乎都可以建立ELISA检测方法。2022-7-13YHLO专业培训42五、酶免疫分析技术的分类2022-7-13YHLO专业培训43酶酶免免疫疫技技术术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均均 相相非均相非均相固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片或其它标组织切片或其它标本中抗原的定位本中抗原的定位 液体标本液体标本中抗原或中抗原或抗体的定抗体的定性和定量性和定量2022-7-13YHLO专业培训44用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 酶标记
30、物与相应的抗原或抗体结合后，酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变，不用分离结合标记酶的活性会发生改变，不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。的改变，而确定抗原或抗体的含量。原理原理（一）均相酶免疫测定（一）均相酶免疫测定2022-7-13YHLO专业培训45最具代表性的两种技术最具代表性的两种技术酶放大免疫测定技术酶放大免疫测定技术EMITEMITenzyme-mutiplied immunoassay technique克隆酶供体免疫分析克隆酶供体免疫分析 CEDIACEDIAcloned en
31、zyme donor immunoassay 均相酶免疫测定均相酶免疫测定2022-7-13YHLO专业培训46分类：分类：液相酶免疫测定液相酶免疫测定 固相酶免疫测定固相酶免疫测定 以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸以聚苯乙烯等材料作为固相载体的酶联免疫吸附试验（附试验（ELISAELISA） 是目前最为常用的固相酶免是目前最为常用的固相酶免疫测定疫测定与均相不同与均相不同之处之处需分离游离与结合的酶标记物需分离游离与结合的酶标记物（二）非均相酶免疫测定（二）非均相酶免疫测定2022-7-13YHLO专业培训47底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反应反应加
32、入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复合物的抗原抗体复合物与未结合的分离与未结合的分离1234ELISAELISA基本原理基本原理2022-7-13YHLO专业培训48固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体 酶标记物（酶结合物酶标记物（酶结合物） 酶反应的底物酶反应的底物 三个必要试剂三个必要试剂 方法类型及其反应原理方法类型及其反应原理2022-7-13YHLO专业培训49 （1 1）双抗体夹心法双抗体夹心法方法：方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶 标抗体，加底物显色标抗体，加底
33、物显色应用：应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定二价或二价以上的较大分子抗原测定 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCGHCG等等A A、ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法2022-7-13YHLO专业培训502022-7-13YHLO专业培训511、已知抗体包 被于载体表面3、加酶标抗体 与抗原结合4、加酶作用的底物产生颜色2、加待检物抗原与抗体结合4、加酶作用的底物 不产生颜色双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包 被于载体表面2、加待检物无抗 原与抗体结合3、加酶标抗体 无抗原结合+ +- -E EE EE EE EE EE EE E
34、E EE E2022-7-13YHLO专业培训52 （2 2）竞争法竞争法 方法：方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标标 抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合物结合 加底物显色加底物显色。 应用：应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（ 药物、激素等）药物、激素等）A A、ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法2022-7-13YHLO专业培训532022-7-13YHLO专业培训54竞争法测抗原竞争法测抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE E2 2
35、、加待检物、加待检物抗原与酶标抗抗原与酶标抗原竞争与抗体原竞争与抗体结合结合3 3、加酶作用、加酶作用的底物不显色的底物不显色或显色弱或显色弱3 3、加酶作用、加酶作用的底物显色的底物显色1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面1 1、已知抗体包、已知抗体包被于载体表面被于载体表面2 2、加待测物、加待测物和酶标抗原，和酶标抗原，酶标抗原与抗酶标抗原与抗体结合体结合E E2022-7-13YHLO专业培训55 （1 1）间接法间接法方法方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgGIgG （抗抗体或二抗）加底物显色。（抗抗体或
36、二抗）加底物显色。优点优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用应用 常用于常用于HCVHCV抗体、抗体、HIVHIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定B B、ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法2022-7-13YHLO专业培训562022-7-13YHLO专业培训571、已知抗原吸附于载体表面2、加待检物无抗体与抗原结合3、加酶标抗Ig与抗体结合4、加酶作用的底物产生颜色1、已知抗体吸附于载体表面2、加待检物有抗体与抗原结合3、加酶标的抗Ig抗体4、加酶作用的底物不产生颜色间接法测抗体间接法测抗体- -E EE
37、EE EE EE EE EE EE EE E2022-7-13YHLO专业培训58 （2 2）双抗原夹心法双抗原夹心法原理原理 类似双抗体夹心法类似双抗体夹心法操作步骤操作步骤 类似类似 应用应用 乙型肝炎表面抗体乙型肝炎表面抗体B B、ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法2022-7-13YHLO专业培训59 （3 3）竞争法竞争法原理原理 类似检测抗原的竞争法类似检测抗原的竞争法 应用应用 乙型肝炎病毒核心抗体乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)(HBcAb)和和 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒e e抗体抗体(HBeAb)(HBeAb)的检测的检测 B B、ELISAELISA检测抗体
38、的方法检测抗体的方法2022-7-13YHLO专业培训60 （4 4）捕获法捕获法 应用应用 病原体急性感染诊断中的病原体急性感染诊断中的IgMIgM型抗体型抗体 甲型肝炎甲型肝炎HAV-IgMHAV-IgM抗体抗体 乙型肝炎病毒核心乙型肝炎病毒核心HBc-IgMHBc-IgM抗体抗体B B、ELISAELISA检测抗体的方法检测抗体的方法2022-7-13YHLO专业培训61捕获法捕获法 原理：原理：抗人抗人IgMIgM链抗体包被链抗体包被捕获待测标本中捕获待测标本中IgMIgM类抗体类抗体加入特异性抗原和酶标记特加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体异性抗原的抗体 底物显色底物显色 202
39、2-7-13YHLO专业培训62捕获法原理捕获法原理+ +- -E EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待测物、加待测物特异性特异性IgMIgM与与非特异性非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性、加特异性抗原，与特异抗原，与特异性抗体结合性抗体结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体与特异性抗原结与特异性抗原结合，加底物显色合，加底物显色2 2、加待测物、加待测物只有非特异性只有非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性抗、加特异性抗原，不能与非原，不能与非特
40、异性特异性IgMIgM结合结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体无抗原结合，无抗原结合，加底物不显色加底物不显色2022-7-13YHLO专业培训63六、酶联免疫分析技术的设备 1、加样器 2、洗板机 3、孵育箱 4、加速仪 5、酶免分析仪 6、数据分析方法 7、结果报告系统2022-7-13YHLO专业培训64七、酶联分析所需使用的材料（ 1 1）抗原：纯化抗原、合成抗原、基因工程抗原。）抗原：纯化抗原、合成抗原、基因工程抗原。（ 2 2）抗体：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体。）抗体：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体。（ 3 3）酶标抗体或抗原：辣根过氧化物酶（）酶标抗体或抗原：辣根过
41、氧化物酶（HRPHRP）、碱性磷酸酶、）、碱性磷酸酶、 B-B-半乳糖苷半乳糖苷 酶等。酶等。（ 4 4）酶色原底物：邻苯二胺（）酶色原底物：邻苯二胺（OPDOPD）、）、ABTSABTS、四甲基联苯胺、四甲基联苯胺 （TMBTMB）；对硝基苯磷酸盐（）；对硝基苯磷酸盐（pNPPpNPP）, ,酶发光底物（鲁米诺、酶发光底物（鲁米诺、 AMPPDAMPPD）。）。（ 5 5）微孔反应板）微孔反应板（ 6 6）洗涤液、终止剂）洗涤液、终止剂（7 7）阳性质控品）阳性质控品（8 8）阴性质控品）阴性质控品2022-7-13YHLO专业培训65标记酶的要求：标记酶的要求： 活性高活性高 性质稳定性质
42、稳定 专一性强专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行方法敏感，重复性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉 （一）酶和酶作用底物（一）酶和酶作用底物2022-7-13YHLO专业培训66辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP） 糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心辅基是酶的活性中心RZRZ值：值：403nm 403nm （辅基）（辅基）与与275nm275nm（主酶）（主酶） ODOD值之比值之比
43、 RZRZ值与酶活性无关，值与酶活性无关，酶活性单位比酶活性单位比RZRZ值值更为重要更为重要 ELISAELISA中应用最为广中应用最为广泛的标记用酶泛的标记用酶 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物2022-7-13YHLO专业培训67碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP） 菌源性菌源性AP AP 肠粘膜肠粘膜APAP 半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-Gal-Gal） 用于均相酶用于均相酶免疫测定免疫测定 常用酶常用酶酶和酶作用底物酶和酶作用底物2022-7-13YHLO专业培训68HRPHRP的底物的底物 DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2H D+2H2 2O O HRPHRP供
44、氢体供氢体DHDH2 2习惯上被称为底物，底物有多种习惯上被称为底物，底物有多种 H H2 2O O2 2为受氢体，为受氢体，HRPHRP对受氢体的专一性很高对受氢体的专一性很高 常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶作用底物2022-7-13YHLO专业培训69OPDOPD反应后显橙黄反应后显橙黄色，加酸终止反色，加酸终止反应后呈棕黄色，应后呈棕黄色，测定波长测定波长492nm492nm。不稳定，致癌性。不稳定，致癌性。TMBTMB反应后显蓝色反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变加酸终止反应后变为黄色为黄色, ,测定波长测定波长450nm 450nm ，稳定，无，稳定，无致癌性，致癌性，ELISA
45、ELISA中应中应用最广泛的底物。用最广泛的底物。 HRPHRP的常见底物的常见底物 酶和酶作用底物酶和酶作用底物2022-7-13YHLO专业培训70APAP的的底物底物 -Gal-Gal的底物的底物 对对- -硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯（ pNPP pNPP ）4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基-D-D半半- -乳糖苷乳糖苷（ 4MUG 4MUG ）经经APAP作用后的产物为黄色对作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm405 nm。 酶作用后，生成高强度酶作用后，生成高强度荧光物荧光物 ，用荧光计，用荧光计 测测量。量。常用底物常用底物酶和酶作用底物酶和酶
46、作用底物2022-7-13YHLO专业培训71酶免疫技术的核心组成部分酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物酶结合物（conjugateconjugate）酶标记物酶标记物 通过化学反应或免通过化学反应或免疫学反应，让酶与疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的抗体或抗原形成的结合物结合物 （二）酶标记抗体或抗原（二）酶标记抗体或抗原2022-7-13YHLO专业培训72抗原要求纯度高，抗原性完整抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。产，易纯化。 制备方法要求制备方法要求酶标记抗体或抗原酶
47、标记抗体或抗原2022-7-13YHLO专业培训73制备方法要求制备方法要求技术方法简单、产率高，重复性好技术方法简单、产率高，重复性好标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性酶标记物稳定，不形成聚合物酶标记物稳定，不形成聚合物酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原2022-7-13YHLO专业培训74制备方法制备方法过碘酸钠法（直接法）过碘酸钠法（直接法）常用于常用于HRPHRP标记抗体或抗原标记抗体或抗原 戊二醛交联法戊二醛交联法酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原2022-7-13YHLO专业培训75戊二醛交联法戊二醛交联法戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别戊二醛分子
48、中有两个相同的醛基，可分别与与HRPHRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。步法高，酶标记物质量较均一。 酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原2022-7-13YHLO专业培训76纯化及鉴定纯化及鉴定标记完成后应除去反应液中的游离酶、标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染
49、色强度作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法：常用的纯化方法：葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-200/G-150G-200/G-150过柱层析纯化过柱层析纯化50%50%饱和硫酸铵沉淀提纯饱和硫酸铵沉淀提纯酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原2022-7-13YHLO专业培训77固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面到固相载体的表面 （三）固相载体（三）固相载体2022-7-13YHLO专业培训78要求要求 结
50、合抗体或抗原的容量大结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性不影响免疫反应性 利于反应充分进行利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济固相方法简便易行，快速经济种类种类塑料制品塑料制品 微颗粒微颗粒膜载体膜载体 固相载体固相载体2022-7-13YHLO专业培训79将抗原或抗体结合于固相载体将抗原或抗体结合于固相载体用用1%1%5%5%的牛血清白蛋白或的牛血清白蛋白或5%5%20%20%小牛血小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附特异性吸附包被包被coatingcoating封闭
