1、 免疫组织化学技术免疫组织化学技术(immunohistochemistry technique ) v 免疫组织化学免疫组织化学是根据抗原与抗体特异性是根据抗原与抗体特异性结合的原理，以细胞中特异成分为抗原，用结合的原理，以细胞中特异成分为抗原，用标记的抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反标记的抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原及其应和组织化学的呈色反应，对相应抗原及其抗体进行定性、定位、定量测定的一种免疫抗体进行定性、定位、定量测定的一种免疫检测技术方法。检测技术方法。v基本原理：基本原理：v 抗原抗体反应抗原抗体反应标记化学反应标记化学反应呈色化学反应呈色化学
2、反应概概 述述v与与IHCT相关的免疫学基础：相关的免疫学基础：v 抗原：抗原：v 抗体：抗体：第一节第一节 抗原抗原 刺激机体免疫系统刺激机体免疫系统特异性反应特异性反应特异性反应特异性反应 抗原（图示）抗原（图示）免疫原性免疫原性抗原抗原 免疫反应性免疫反应性Fujian Blood Centerhttp:/www.fjxyzx.org/抗原的免疫原性抗原的免疫原性（一）（一）异物性异物性（二）理化特性（二）理化特性 1.1.分子量分子量 2.2.化学组成和结构化学组成和结构 3.3.物理性状物理性状异物性异物性返回返回概念：概念：指该抗原与自身正常组织成分的差异指该抗原与自身正常组织成分
3、的差异 程度。程度。异物性分类异物性分类 异种物质异种物质 同种异体物质同种异体物质自身物质自身物质完完理化特性理化特性 1.抗原的分子大小抗原的分子大小分子量越大，免疫原性越强：分子量越大，免疫原性越强：1.1.表面的抗原决定簇多，对淋巴表面的抗原决定簇多，对淋巴 细胞的活化作用强。细胞的活化作用强。2.2.大分子物质溶于水中呈胶体状，大分子物质溶于水中呈胶体状，化学结构较稳定，不易被机体破化学结构较稳定，不易被机体破坏或排除，体内存留时间长。坏或排除，体内存留时间长。 2.抗原分子的化学组成和结构抗原分子的化学组成和结构氨基酸残基的位置和间距与免疫原性关系氨基酸残基的位置和间距与免疫原性关
4、系 抗原的特异性抗原的特异性 1.1.即专一性能；即专一性能； 2.2.是免疫应答的基本特点；是免疫应答的基本特点； 3.3.是免疫学诊断与防治的理论依据；是免疫学诊断与防治的理论依据；免疫反应特异性的物质基础免疫反应特异性的物质基础-抗原决定簇抗原决定簇(antigenic determinant)或或表位表位(epitope)： 是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊是指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。化学基团。 抗原结合价：抗原结合价：一个抗原分子上能与相应抗体一个抗原分子上能与相应抗体 分子结合的抗原决定簇总数。分子结合的抗原决定簇总数。共同抗原表位与交叉反应共同抗原表位与交叉反应
5、*共同抗原（共同抗原（common antigen): 两种不同抗原具有相同或相似的抗原决定簇，两种不同抗原具有相同或相似的抗原决定簇， 互称共同抗原。互称共同抗原。*交叉反应：交叉反应：由共同抗原决定簇刺激机体产生由共同抗原决定簇刺激机体产生 的抗体可以和两种共同抗原结合发生反应。的抗体可以和两种共同抗原结合发生反应。天然抗原有多个抗原决定簇，故为多价抗原。天然抗原有多个抗原决定簇，故为多价抗原。半抗原仅有一个抗原决定簇，故为单价抗原。半抗原仅有一个抗原决定簇，故为单价抗原。抗原的种类抗原的种类完完 全全 抗抗 原原不不 完完 全全 抗抗 原原按按 性性 能能 分分外外源源 性性 抗抗 原原
6、内内源源 性性 抗抗 原原按按来来 源源 分分T TD D- -A Ag gT TI I- -A Ag g超超抗抗 原原按按免免 疫疫 应应 答答 分分异异 种种 抗抗 原原异异 嗜嗜 性性 抗抗 原原同同 种种 异异 型型 抗抗 原原自自 身身 抗抗 原原按按 亲亲 缘缘 关关 系系 分分返回返回有关概念有关概念v免疫球蛋白免疫球蛋白: :是浆细胞产生的球蛋白。是浆细胞产生的球蛋白。、抗体、抗体（antibodies, Abantibodies, Ab）：是机体免疫）：是机体免疫细胞受抗原物质刺激后产生的，能与相应细胞受抗原物质刺激后产生的，能与相应抗原特异性结合，并具有多种免疫学、生抗原特
7、异性结合，并具有多种免疫学、生物学活性的球蛋白。物学活性的球蛋白。2 2、免疫球蛋白、免疫球蛋白（immunoglobulins,Igimmunoglobulins,Ig）：）：指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。球蛋白。v v可变区可变区（variable regions,V区）区）v位于免疫球蛋白多肽链的位于免疫球蛋白多肽链的N N端，占轻链的端，占轻链的1/21/2与与重链的重链的1/41/4。v该区的氨基酸组成及排列顺序随抗体特异性不该区的氨基酸组成及排列顺序随抗体特异性不同而发生变化。同而发生变化。v 它赋予抗体以特异性。它赋予抗体以特异性
8、。v恒定区恒定区（constant regions,C区）区）v位于免疫球蛋白多肽链的位于免疫球蛋白多肽链的N N端，占轻链的端，占轻链的1/21/2与重链的与重链的3/43/4。v 其氨基酸组成及排列顺序都比较恒定。其氨基酸组成及排列顺序都比较恒定。 血清型血清型同种异型同种异型 同一物种不同个体间的同一物种不同个体间的Ig分子所具有分子所具有 (allotype) 特异性不同的抗原决定簇，遗传标志。特异性不同的抗原决定簇，遗传标志。 Ig具有与具有与Ag特异性结合的特性，又有免疫原性。特异性结合的特性，又有免疫原性。 同种型同种型 同一物种所有个体间的同一物种所有个体间的Ig分子所共有分子
9、所共有(isotype) 的抗原特异性。的抗原特异性。独特型独特型 不同不同B细胞产生的细胞产生的Ig分子分子V区所具有区所具有(idiotype) 抗原特异性标志抗原特异性标志 免疫球蛋白免疫球蛋白水解片段水解片段 1. 1.木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶（Papain） IgG Fab段段(fragment of antigen- binding,抗原结合抗原结合 片段片段) ) Fc段（段（fragment crystalizable, ,可结晶片段）可结晶片段） 2 2. .胃蛋白酶胃蛋白酶（Pepsin） IgG F( ab)2 pFc 3. 3.意义：阐明意义：阐明Ig分子生物学作用；分子生
10、物学作用； 构建基因工程抗体。构建基因工程抗体。酶水解免疫球蛋白示意图酶水解免疫球蛋白示意图FabFab段段(fragment antigen binding)F(ab)F(ab)2 2段：段：大片段，功大片段，功能同能同FabFab段段木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶（papainpapain) )胃蛋白酶胃蛋白酶(pepsin)(pepsin)FcFc段段(fragment crystallizable)pFcpFc：小分：小分子多肽碎片，子多肽碎片，无生物学活性无生物学活性v 抗体是免疫组织化学技术的最关键试剂与抗体是免疫组织化学技术的最关键试剂与v 示踪工具。示踪工具。v 按制备方法分类：按制备方
11、法分类：v 1 1、多克隆抗体、多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb(polyclonal antibody, PcAb) ) v 2 2、单克隆抗体、单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb(monoclonal antibody, McAb) ) v 3 3、基因工程抗体、基因工程抗体(genetic engineering antibody)(genetic engineering antibody)。 1、多克隆抗体、多克隆抗体：是多个：是多个B淋巴细胞克隆所产生淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。的抗体混合物。 是将纯化后的抗原直接免疫动物
12、后，从动物血中是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清。所获得的免疫血清。 特异性低，会产生抗体的交特异性低，会产生抗体的交叉反应。叉反应。 2 2、单克隆抗体：单克隆抗体：是一个是一个B淋巴细胞克隆分泌的淋巴细胞克隆分泌的针对单一抗原决定簇的抗体。针对单一抗原决定簇的抗体。 特异性强、抗体产特异性强、抗体产量高。量高。McAb and PcAbv3、基因工程抗体又称重组抗体、基因工程抗体又称重组抗体 v 是指应用是指应用NDA重组及蛋白工程技术对编重组及蛋白工程技术对编码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，码抗体的基因按不同的需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新
13、表达的抗体。经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。抗体的类型技术应用类型： 1、特异性抗体（一级抗体） 2、抗抗体 （二级抗体） 3、标记抗体 抗体的购置及注意事项抗体的购置及注意事项 1.1.抗体的购置抗体的购置 目前商品化抗体已有目前商品化抗体已有上千种，一种抗体可以有数家公司生产，上千种，一种抗体可以有数家公司生产，其质量的好坏也存在很大差异，首先应选其质量的好坏也存在很大差异，首先应选择一家好的生产公司，根据文献提供的信择一家好的生产公司，根据文献提供的信息，选择所需试剂的型号。息，选择所需试剂的型号。2.2.购置抗体的注意事项购置抗体的注意事项 (1)(1)种属：单克隆抗体，多克隆抗
14、体种属：单克隆抗体，多克隆抗体 (2)(2)能否用于石蜡切片能否用于石蜡切片 (3)(3)稀释度稀释度 (4)(4)特异性，交叉反应特异性，交叉反应 (5)(5)用何种组织前处理形式用何种组织前处理形式 (6)(6)包装单位，价格包装单位，价格第三节第三节 抗原抗体反应抗原抗体反应 抗原与相应抗体之间的特异性结合反应。抗原与相应抗体之间的特异性结合反应。基本原理基本原理抗原抗体反应原理抗原抗体反应原理 AgAg决定簇和决定簇和AbAb分子超变区相互分子超变区相互 作用作用( (具有互补性与亲和性具有互补性与亲和性) )分子表面特异的可逆的弱结合力分子表面特异的可逆的弱结合力在极短距离内才能发生
15、在极短距离内才能发生基本条件：基本条件：结合力结合力亲和性亲和性亲水胶体转亲水胶体转化为疏水胶体化为疏水胶体抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合抗原和抗体的结合是互补性的特异性结合不形成牢固的共价键，通过非共价键结合不形成牢固的共价键，通过非共价键结合这种弱的结合力涉及几种分子间的作用力这种弱的结合力涉及几种分子间的作用力 一、抗原抗体结合力一、抗原抗体结合力 * *1 1静电引力静电引力 * *2 2范德华引力范德华引力 * *3 3氢键结合力氢键结合力 * *4 4疏水作用力疏水作用力 抗原抗体结合力示意图抗原抗体结合力示意图抗原抗原抗体抗体氢键结合力氢键结合力 O ON NO ON NH
16、 HH H静电引力静电引力- - -+ + +范得华力范得华力- -+ + +- -+ +- - -+ +疏水作用力疏水作用力排斥的水排斥的水抗原抗体反应的特点抗原抗体反应的特点* *1.1.特异性特异性 * *2.2.比例性比例性 * *3.3.可逆可逆性性 特异性特异性（specificityspecificity）* *概念：某种概念：某种抗原分子，只能与由它刺激所产生抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体结合而起反应的专一性能。的抗体结合而起反应的专一性能。* *决定因素：决定因素：由抗原决定簇和抗体分子超变区之由抗原决定簇和抗体分子超变区之 间空间结构的互补性决定的。间空间结构的互补性
17、决定的。* *交叉反应交叉反应(cross reaction) (cross reaction) 两种不同的抗原两种不同的抗原 物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇， 则可与彼此相应的抗体反应。则可与彼此相应的抗体反应。 特异性示意图特异性示意图 * *最适比最适比(optimal ratio)(optimal ratio)或等价点或等价点(equivzlence(equivzlence point) point) 最迅速出现沉淀时的抗原抗体的浓度最迅速出现沉淀时的抗原抗体的浓度 比或量比。比或量比。 比例比例性性（proportionalitypro
18、portionality） 等价带等价带(zone of equivalence)(zone of equivalence)抗原与抗体分子抗原与抗体分子比例合适的范围。比例合适的范围。带现象：带现象：AgAg与与AbAb比例不适而不出现可见反应。比例不适而不出现可见反应。* * 前带前带(prezone(prezone) ) 抗体过量时。抗体过量时。* * 后带后带(postzone(postzone) ) 抗原过量时。抗原过量时。 比例性示意图比例性示意图抗体过量抗体过量比例合适比例合适抗原的量抗原的量抗原过量抗原过量免疫复合物沉淀的量免疫复合物沉淀的量前带前带等价带等价带后带后带可逆性（可
19、逆性（reversibility)reversibility)概念：概念：是指抗原与抗体结合成复合物后，在是指抗原与抗体结合成复合物后，在 一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性。一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性。 后抗原抗体仍保持原有特性。后抗原抗体仍保持原有特性。解离条件：低解离条件：低pHpH、高浓度盐等。、高浓度盐等。 常用于解离抗原抗体复合物的物质有：常用于解离抗原抗体复合物的物质有： 3mol/L3mol/L硫氰化钾、硫氰化钾、pH2.4 0.1mol/LpH2.4 0.1mol/L甘氨酸、甘氨酸、 7mol/L7mol/L尿素等。尿素等。抗原抗体反应影响因素抗原抗体反应影响
20、因素一、反应物自身因素一、反应物自身因素 * *抗原：抗原：1.1.理化特性理化特性 2.Ag2.Ag决定簇数量决定簇数量 3.Ag3.Ag决定簇种类决定簇种类 * *抗体：抗体：1.1.来源来源 2.2.特异性与亲和力特异性与亲和力 3.3.浓度浓度二、环境条件：二、环境条件：* *电解质：电解质：0.85%NaCl0.85%NaCl* *酸碱度：酸碱度：pH6pH69 9* *温度：温度：15154040v受体受体( receptor) v受体在细胞生物学中是一个很泛的概念,意指任何能够同激素、神经递质、药物或细胞内的信号分子结合并能引起细胞功能变化的生物大分子,存在于细胞膜、胞浆或细胞核
21、内。v 不同的受体有特异的结构和构型。v 受体与配体结合的特异性是受体的最基本特点，保证了信号传导的正确性。v 配体和受体的结合是一种分子识别过程，它依靠氢键、离子键与范德华力的作用使两者结合，配体和受体分子空间结构的互补性是特异性结合的主要因素。 考查题：考查题：v 根据课题写出应用免疫组化技术部分实根据课题写出应用免疫组化技术部分实验计划（验计划（20002000字）。字）。v具体内容包括：具体内容包括：1-51-5部分部分v1 1、题目：、题目：应突出实验目的和对象（应突出实验目的和对象（2020字）。字）。v2 2、前言、前言：简要介绍研究的背景资料，提出需要：简要介绍研究的背景资料，
22、提出需要解决的问题，说明实验目的和技术路线，在宏观解决的问题，说明实验目的和技术路线，在宏观上阐述免疫组化技术部分的设计方案。上阐述免疫组化技术部分的设计方案。v3 3、材料与方法：、材料与方法：重点说明实验对象，标本来重点说明实验对象，标本来源，选用何种免疫染色方法，抗体及标记物的源，选用何种免疫染色方法，抗体及标记物的类型，对照的设计等。类型，对照的设计等。v4 4、结果和讨论：、结果和讨论：对实验可能出现的结果进行对实验可能出现的结果进行预测并进行相关分析和讨论，阐述需要解决的预测并进行相关分析和讨论，阐述需要解决的关键问题等。关键问题等。v5 5、参考文献：、参考文献：具体列出文中引用的文献，包具体列出文中引用的文献，包括作者、题目及出处。括作者、题目及出处。v要求：要求：v 重点说明免疫组化技术部分的设计方重点说明免疫组化技术部分的设计方案和技术流程，包括一抗的类型、来源、案和技术流程，包括一抗的类型、来源、标记物的类型、选择哪一种免疫染色方标记物的类型、选择哪一种免疫染色方法，采取何种对照等。法，采取何种对照等。v 阐述需要解决的关键问题和可能出现阐述需要解决的关键问题和可能出现的结果，并对实验的可行性进行分析。的结果，并对实验的可行性进行分析。
