1、1 第二章第二章 基因工程制药基因工程制药-22 第二章第二章 基因工程制药基因工程制药-23本部分主要学习目标本部分主要学习目标:第四节第四节 基因表达基因表达5第四节第四节 基因表达基因表达一、宿主菌的选择一、宿主菌的选择二、大肠杆菌体系中的基因表达二、大肠杆菌体系中的基因表达三、酵母体系中的基因表达三、酵母体系中的基因表达（一）宿主细胞应满足的条件（一）宿主细胞应满足的条件一、宿主细胞的选择一、宿主细胞的选择7（一）宿主细胞应满足的条件（一）宿主细胞应满足的条件（二）宿主细胞的类型（二）宿主细胞的类型9n大肠杆菌表达的生物技术药物现状大肠杆菌表达的生物技术药物现状:nFDA批准情况：大肠
2、杆菌表达的基因重组生物技批准情况：大肠杆菌表达的基因重组生物技术药物有术药物有18种，分别是甲状旁腺激素种，分别是甲状旁腺激素(1-34)、利尿、利尿钠肽、胰岛素及其两种突变体、生长激素、干扰钠肽、胰岛素及其两种突变体、生长激素、干扰素、素、G-CSF、白介素、白介素-1Ra、白介素、白介素-2、白介素、白介素-11、白喉毒素白喉毒素-IL 2融合蛋白、融合蛋白、OspA脂蛋白等。脂蛋白等。1、大肠杆菌、大肠杆菌10产品特点：产品特点：n结构相对简单、分子量较小的蛋白质，主要为细结构相对简单、分子量较小的蛋白质，主要为细胞因子类药物，并且胞因子类药物，并且FDA在在2000年年1月月-2004
3、年年2月月只批准了只批准了4种大肠杆菌表达的产品，并且都是多肽种大肠杆菌表达的产品，并且都是多肽类、分子量为几类、分子量为几kD的产品，表明细胞因子类药物的产品，表明细胞因子类药物的开发空间越来越小，而且的开发空间越来越小，而且E.coli表达系统的应用表达系统的应用空间也极其有限。空间也极其有限。1、大肠杆菌、大肠杆菌11大肠杆菌为表达系统的特点：大肠杆菌为表达系统的特点：1、大肠杆菌、大肠杆菌1、大肠杆菌、大肠杆菌2、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌3、链霉菌、链霉菌15发展现状发展现状:n美国美国FDA批准的酵母表达的基因重组生物技术药批准的酵母表达的基因重组生物技术药物有物有8种，分别是：尿
4、酸水解酶种，分别是：尿酸水解酶rasburicase、胰高、胰高血糖素血糖素GlucaGen、GM-CSF、血小板衍生生长因、血小板衍生生长因子子(rhPDGF-BB)、乙肝疫苗、乙肝疫苗(小小S)、胰岛素、胰岛素Novolin及其突变体及其突变体NovoLog、水蛭素。、水蛭素。4、酵母菌、酵母菌4、酵母菌、酵母菌、丝状真菌、丝状真菌、动物细胞、动物细胞二、大肠杆菌体系中的基因表达二、大肠杆菌体系中的基因表达（一）表达载体（一）表达载体表达载体必须具备的条件表达载体必须具备的条件表达载体必须具备的条件表达载体必须具备的条件表达载体必须具备的条件表达载体必须具备的条件24大肠杆菌表达载体的构成
5、：大肠杆菌表达载体的构成：n复制及选择系统复制及选择系统 （载体）（载体）n转录系统转录系统（目的基因）（目的基因）n蛋白质翻译系统蛋白质翻译系统 （目的蛋白）（目的蛋白）25外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理：n启动子启动子n终止子终止子n核糖体结合位点核糖体结合位点n密码子密码子n质粒拷贝数质粒拷贝数转录转录翻译翻译（一）表达载体（一）表达载体1.pBV220A、结构、结构质粒质粒pBV220的结构框：（图的结构框：（图23）BB、优点、优点2.pET2.pET（二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素（二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素（二）影响真核
6、基因在大肠杆菌中表达的因素（二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素（二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素（二）影响真核基因在大肠杆菌中表达的因素（三）真核基因在大肠杆菌中表达的形式（三）真核基因在大肠杆菌中表达的形式1、融合蛋白形式、融合蛋白形式A、定义、定义B、优缺点、优缺点C、改进措施、改进措施D、融合蛋白的具体表达方式、融合蛋白的具体表达方式2、非融合蛋白形式、非融合蛋白形式A、定义、定义B、优缺点、优缺点（C）非融合基因具体表达形式）非融合基因具体表达形式3、分泌型表达蛋白形式、分泌型表达蛋白形式A、定义、定义B、分泌蛋白表达的原理图示、分泌蛋白表达的原理图示C、常用的大肠杆菌信号肽
7、、常用的大肠杆菌信号肽D、优缺点、优缺点三、酵母菌体系中的基因表达三、酵母菌体系中的基因表达52n载体组成载体组成:n1、细菌中克隆、复制、扩增重组载体的原核质粒序、细菌中克隆、复制、扩增重组载体的原核质粒序 列，包括复制子、抗生素抗性基因、单一限制酶切列，包括复制子、抗生素抗性基因、单一限制酶切位点位点.n2、真核细胞中表达的真核表达组件：启动子元件、真核细胞中表达的真核表达组件：启动子元件、增强子元件、加增强子元件、加poly(A)信号、剪接信号、用于复制信号、剪接信号、用于复制和选择的元件和选择的元件.n宿主宿主:n宿主的选择必须根据载体的特异性宿主的选择必须根据载体的特异性(启动子、终
8、止子）启动子、终止子）常用宿主有酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母常用宿主有酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母.（一）载体（一）载体53真核基因的一般构造示意图真核基因的一般构造示意图54（一）载体（一）载体n1、真核细胞表达载体的功能元件、真核细胞表达载体的功能元件酵母载体组成元件酵母载体组成元件酵母载体酵母载体551、真核细胞表达载体的功能元件、真核细胞表达载体的功能元件n（1）启动子元件）启动子元件n（2）增强子元件）增强子元件n（3）加）加poly(A)信号信号n（4）剪接信号）剪接信号n（5）与翻译相关的元）与翻译相关的元 件件56（1）真核启动子真核启动子nA.定义定义n启动子：小段启动子：小段DNA
9、序列，能特异地与转录有关的序列，能特异地与转录有关的蛋白质相互作蛋白质相互作 用。其转录的活性在不同型用。其转录的活性在不同型 细胞中细胞中相差悬殊相差悬殊.n酵母表达系统：酵母表达系统：AOX1（乙醇氧化酶）（乙醇氧化酶）启启 动子动子1、真核细胞表达载体的功能元件、真核细胞表达载体的功能元件57（1）真核启动子真核启动子nB.组成：多数真核启动子由组成：多数真核启动子由TATA框和上游启动子元框和上游启动子元件组成。件组成。nTATA box:-25-30bp 参与确定位点上参与确定位点上RNA的合成的合成n上游启动子上游启动子 决定转录起始速率决定转录起始速率CAAT box:-70-8
10、0GC box:-80-1101、真核细胞表达载体的功能元件、真核细胞表达载体的功能元件58（1）真核启动子）真核启动子nC.类型：真核启动子根据对应的类型：真核启动子根据对应的RNA聚合酶分为聚合酶分为型、型、型、型、型型1、真核细胞表达载体的功能元件、真核细胞表达载体的功能元件59（2）增强子元件）增强子元件n增强子是能够增强启动子转录活性的增强子是能够增强启动子转录活性的DNA序列，序列，由多个元件组成，与转录调控因子结合由多个元件组成，与转录调控因子结合1、真核细胞表达载体的功能元件、真核细胞表达载体的功能元件60（3）加）加poly(A)信号信号npoly(A)：成熟的：成熟的mRN
11、A3端是经过位点特异性切端是经过位点特异性切割并加上割并加上poly(A)而形成的。而形成的。n相关元件：相关元件：GU或或U丰富区：位于丰富区：位于poly(A)下游下游 AAUAAA：位于：位于poly(A)上游上游1130bpn作用：减少作用：减少DNA反向转录产生反义反向转录产生反义mRNA结合转结合转录模板；录模板；抑制外源基因表达。抑制外源基因表达。1、真核细胞表达载体的功能元件、真核细胞表达载体的功能元件61（4）剪接信号）剪接信号n剪切信号：剪切信号：mRNA剪接必须的最短序列是位于内剪接必须的最短序列是位于内含子的含子的5和和3边界上，内含子最前面的边界上，内含子最前面的(G
12、U)和最和最后面的（后面的（AG)。nAG：GU（A）AGU 内含子内含子(U/）：n剪接点之间的距离，剪接点周围的剪接点之间的距离，剪接点周围的DNA序列，及序列，及剪接点侧翼外显子序列的改变都会影响剪接点侧翼外显子序列的改变都会影响mRNA前前体的剪接历程和剪接点的使用效率。体的剪接历程和剪接点的使用效率。1、真核细胞表达载体的功能元件、真核细胞表达载体的功能元件62（5）翻译相关元件）翻译相关元件n起始：绝大多数起始：绝大多数mRNA的起始序列都含有共同的的起始序列都含有共同的序列序列 5-CCA(G)CCATGG-3 如果改变，翻译的起如果改变，翻译的起始效率下降。始效率下降。n起始密
13、码子：若起始密码子上游存在一个不被随起始密码子：若起始密码子上游存在一个不被随 后的符合阅读框的终止密码子终止，则该密码影后的符合阅读框的终止密码子终止，则该密码影 响响mRNA的翻译起始。的翻译起始。n终止：在基因表达中终止效率最高。终止：在基因表达中终止效率最高。1、真核细胞表达载体的功能元件、真核细胞表达载体的功能元件2、酵母载体定义、酵母载体定义643、酵母载体组成元件、酵母载体组成元件n（1）DNA复制起始序列复制起始序列n（2）选择标记）选择标记n（3）启动子）启动子n（4）分泌信号序列）分泌信号序列n（5）终止子和有丝分裂稳定区）终止子和有丝分裂稳定区65（1）DNA 复制起始序
14、列复制起始序列n穿梭质粒：酵母穿梭质粒：酵母表达载体一般是表达载体一般是穿梭质粒，能在穿梭质粒，能在酵母和大肠杆菌酵母和大肠杆菌中复制中复制.3、酵母载体组成元件、酵母载体组成元件66（2）选择（筛选）标记）选择（筛选）标记n选择（筛选）标记：选择（筛选）标记：营养缺陷型标记营养缺陷型标记 与宿主的基因型有关与宿主的基因型有关 显性选择标记显性选择标记 用于各种类型宿主用于各种类型宿主nHIS4 来自酿酒酵母毕赤酵来自酿酒酵母毕赤酵nARG4 来自酿酒酵母来自酿酒酵母nshble基因来自印度斯坦链异壁菌基因来自印度斯坦链异壁菌 对对Zeocin抗性抗性3、酵母载体组成元件、酵母载体组成元件67
15、（3）启动子）启动子n启动子：启动子：n磷酸甘油脂激酶（磷酸甘油脂激酶（PGK）基因启动子）基因启动子n甘油醛磷酸脱氢酶（甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）基因启动子基因启动子n乙醇氧化酶（乙醇氧化酶（AOX1)、3-磷酸甘油醛脱氢酶磷酸甘油醛脱氢酶（GAP）启动子）启动子n谷胱甘肽依赖的脚醛脱氢酶（谷胱甘肽依赖的脚醛脱氢酶（FLD1)强启动子强启动子n过氧化物酶体基质蛋白过氧化物酶体基质蛋白(PEX8)与分泌相关的与分泌相关的GTPase(YPT1)中等强度启动子中等强度启动子3、酵母载体组成元件、酵母载体组成元件68（4）分泌信号序列）分泌信号序列n分泌信号序列：前体蛋白分泌信号序列：前体蛋白
16、N端一段长为端一段长为1730个氨个氨基酸残基分泌的信号肽编码区，引导分泌蛋白从基酸残基分泌的信号肽编码区，引导分泌蛋白从细胞内转移到胞外，对蛋白细胞内转移到胞外，对蛋白 质翻译后的加工业起质翻译后的加工业起重要作用。重要作用。n因子前导肽序列因子前导肽序列n蔗糖酶信号肽序列蔗糖酶信号肽序列n酸性磷酸酯酶信号肽序列酸性磷酸酯酶信号肽序列n因子因子prepro 序列由序列由19个氨基酸的个氨基酸的pre序列和序列和66个氨个氨基酸的基酸的pro序列组成应用最广泛。序列组成应用最广泛。3、酵母载体组成元件、酵母载体组成元件69（5）终止子和）终止子和 有丝分裂稳定有丝分裂稳定 区区n终止子：相对较
17、短，决定终止子：相对较短，决定3端的稳定性，端的稳定性，mRNA的的3端需经过前提端需经过前提mRNA加工和多聚腺苷化反应加工和多聚腺苷化反应;n有丝分裂稳定区：决定载体在宿主细胞分裂是能平有丝分裂稳定区：决定载体在宿主细胞分裂是能平均地分配到子细胞中去，来源于酵母的染色体着丝均地分配到子细胞中去，来源于酵母的染色体着丝粒片断粒片断.3、酵母载体组成元件、酵母载体组成元件4、酵母载体类型、酵母载体类型5、克隆载体、克隆载体6、表达载体、表达载体（二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素（二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素1.外源基因的拷贝数量（剂量）外源基因的拷贝数量（剂量）2.启动子的类型启动
18、子的类型 启动子类型启动子类型 所用的基因所用的基因 基因符号基因符号 组成型组成型 磷酸甘油酸激酶磷酸甘油酸激酶 PGK 烯醇酶烯醇酶 ENOL 3-磷酸甘油醛脱氢酶磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH 乙醇脱氢酶乙醇脱氢酶1 ADH1 磷酸三糖异构酶磷酸三糖异构酶 TRI 信息素信息素-因子因子 MF 1诱导型诱导型 细胞色素细胞色素C CYC1 酸性磷酸脂酶酸性磷酸脂酶 PHO5 半乳糖激酶半乳糖激酶 GAL1 UDP-D-半乳糖半乳糖-4-差向酶差向酶 GAL102.启动子的类型启动子的类型3.分泌信号的表达效率分泌信号的表达效率4.终止序列对表达效率也有影响终止序列对表达效率也有影响 保证转
19、录产物保证转录产物mRNA在适当部位终止或加上在适当部位终止或加上polyA尾部，这样形成的尾部，这样形成的mRNA比较稳定并能被有效的翻译。比较稳定并能被有效的翻译。5.外源蛋白质的糖基化外源蛋白质的糖基化6.宿主酵母菌株性能宿主酵母菌株性能四、动物中的基因表达四、动物中的基因表达第五节第五节 基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点一、菌体的生长和能量的关系一、菌体的生长和能量的关系二、菌体生长与前体供应的关系二、菌体生长与前体供应的关系一、基因工程菌质粒的不稳定性一、基因工程菌质粒的不稳定性第六节第六节 基因工程菌的不稳定性基因工程菌的不稳定性（一）质粒不稳定的原因（一）质粒不稳定的原因（二）质粒稳定性的分析方法（二）质粒稳定性的分析方法二、提高质粒稳定性的方法二、提高质粒稳定性的方法3、培养基中加入抗生素，形成选择性压力、培养基中加入抗生素，形成选择性压力4、分阶段培养法、分阶段培养法 通过温度、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施。调节措施。5、控制培养条件、控制培养条件93第七节第七节 基因工程菌中试基因工程菌中试94本部分小节本部分小节95本部分作业本部分作业:
