1、蛹虫草菌丝体中蛹虫草菌丝体中 多糖提取方法的研究多糖提取方法的研究 目目 录录 研究意义研究意义 研究方法研究方法 结果与讨论结果与讨论 实验结论实验结论 致谢致谢一、研究意义一、研究意义图图1-1 蛹虫草菌丝体蛹虫草菌丝体 人工培育的蛹虫草与野生冬虫夏草人工培育的蛹虫草与野生冬虫夏草经严格的测试，他们在功能与功效上并经严格的测试，他们在功能与功效上并无区别，但其生产成本却大大降低。无区别，但其生产成本却大大降低。蛹虫草菌丝体是冬虫夏草的有效替蛹虫草菌丝体是冬虫夏草的有效替代品，根据科学家们分析检验，它具有代品，根据科学家们分析检验，它具有与冬虫夏草相同的功效。蛹虫草菌丝体与冬虫夏草相同的功效
2、。蛹虫草菌丝体多糖作为蛹虫草的主要有效成分具有抗多糖作为蛹虫草的主要有效成分具有抗氧化、抗衰老、调节免疫系统、抗炎、氧化、抗衰老、调节免疫系统、抗炎、抗肿瘤以及降血糖作用。抗肿瘤以及降血糖作用。蛹虫草菌丝体蛹虫草菌丝体多糖的应用主要是保健食品和医药制剂。多糖的应用主要是保健食品和医药制剂。但现阶段，蛹虫草菌丝体多糖产品的但现阶段，蛹虫草菌丝体多糖产品的开发仍然极少，其远远比不上其他的药用开发仍然极少，其远远比不上其他的药用真菌例如灵芝、冬虫夏草等。最主要的原真菌例如灵芝、冬虫夏草等。最主要的原因是针对蛹虫草菌丝体多糖提取技术研究因是针对蛹虫草菌丝体多糖提取技术研究开发还较少，无法进行工业化生产
3、应用。开发还较少，无法进行工业化生产应用。因此，本实验开展对蛹虫草菌丝体多糖提因此，本实验开展对蛹虫草菌丝体多糖提取工艺的研究和优化，为工业化规模性生取工艺的研究和优化，为工业化规模性生产蛹虫草菌丝体多糖提供理论依据。产蛹虫草菌丝体多糖提供理论依据。图图1-2 蛹虫草菌丝体多糖蛹虫草菌丝体多糖菌丝体多糖检测方法菌丝体多糖检测方法菌丝体多糖提取方法菌丝体多糖提取方法二、研究方法二、研究方法热水浸提法热水浸提法超声波提取法超声波提取法微波提取法微波提取法超滤膜分离法超滤膜分离法分级沉淀法分级沉淀法蒽酮法蒽酮法离子色谱法离子色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法气相色谱法气相色谱法苯酚苯酚-硫酸法硫酸法
4、图图2-1 蛹虫草菌丝体多糖提取工艺流程图蛹虫草菌丝体多糖提取工艺流程图 优化优化 （1）工艺流程）工艺流程图图2-2 葡萄糖标准曲线葡萄糖标准曲线（2）葡萄糖标准曲线的绘制）葡萄糖标准曲线的绘制 标准曲线的回归方程为标准曲线的回归方程为Y=0.008X+0.0324Y=0.008X+0.0324，R R2 2=0.9958=0.9958。说明葡萄。说明葡萄糖在糖在0 0900g/ml900g/ml有良好的线性关系。此方法简单、快速、灵敏有良好的线性关系。此方法简单、快速、灵敏。（3）蛹虫草菌丝体多糖的检测）蛹虫草菌丝体多糖的检测-苯酚硫酸法苯酚硫酸法空白空白1号号2号号3号号4号号样品溶液样
5、品溶液mL01.01.01.01.0蒸馏水蒸馏水mL1.01.01.01.01.06%苯酚溶液苯酚溶液mL1.01.01.01.01.0浓硫酸浓硫酸mL5.05.05.05.05.0 按照上表准确加入待测液后沸水浴按照上表准确加入待测液后沸水浴15min，再冷水浴，再冷水浴30min，以空白调零点后于，以空白调零点后于490nm下测定吸光度值。下测定吸光度值。表表 1 待测液的处理待测液的处理 （4 4）多糖提取率计算公式）多糖提取率计算公式多糖含量（多糖含量（ug/gug/g）=多糖提取率（多糖提取率（%）=100)(/uggmL多糖粗品总量稀释倍数）度（吸光度值对应的多糖浓)()/()(g
6、mLugg菌丝体干重多糖含量多糖粗品总量准确称取蛹虫草菌丝体准确称取蛹虫草菌丝体50.0g50.0g于四个培养皿中，编号。于四个培养皿中，编号。平铺以利于烘干，放入电热恒温鼓风干燥箱中数天，直至平铺以利于烘干，放入电热恒温鼓风干燥箱中数天，直至烘干（烘干（4545），再测其干重，结果如下表：），再测其干重，结果如下表：由烘干后的质量知，湿重为干重的由烘干后的质量知，湿重为干重的1010倍倍。（5）蛹虫草菌丝体的预处理）蛹虫草菌丝体的预处理蛹虫草菌丝体蛹虫草菌丝体湿重湿重50.0g50.0g50.0g50.0g干重干重4.98g5.01g5.01g4.97g表表2 蛹虫草菌丝体干湿重比较蛹虫草菌
7、丝体干湿重比较（6）蛹虫草菌丝体多糖提取方法的比较）蛹虫草菌丝体多糖提取方法的比较菌丝体重菌丝体重 (g)蒸馏水蒸馏水 (mL)提取温度提取温度（）提取时间提取时间 (h)提取次数提取次数（次）（次）乙醇浓度乙醇浓度（%）功率功率 （W）热水浸提法热水浸提法 10.0 100 80 3 3 90 100 超声波法超声波法 10.0 100 60 1 3 90 100 微波提取法微波提取法 10.0 100 1/6 3 90 表表3 提取方法的比较提取方法的比较图图2-4 蛹虫草菌丝体的多糖浓度蛹虫草菌丝体的多糖浓度图图2-3 培养的蛹虫草菌丝体培养的蛹虫草菌丝体液料比对蛹虫草菌丝体多糖提取率的
8、影响液料比对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响 按照上述提取工艺，分别按液料比按照上述提取工艺，分别按液料比4141、7171、101101、131131、151151热水浸提蛹虫草菌丝体多糖，并于热水浸提蛹虫草菌丝体多糖，并于490nm490nm下测定吸光度值以确定下测定吸光度值以确定最佳液料比。最佳液料比。提取时间对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响提取时间对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响 按照上述提取工艺，分别热水浸提蛹虫草菌丝体多糖按照上述提取工艺，分别热水浸提蛹虫草菌丝体多糖1h1h，2h2h、3h3h、4h4h、5h5h ，并于，并于490nm490nm下测定吸光度值以确定最佳提取时间。下测定吸
9、光度值以确定最佳提取时间。乙醇浓度对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响乙醇浓度对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响 按照上述提取工艺，热水浸提后抽滤，下清液中分别加入浓度按照上述提取工艺，热水浸提后抽滤，下清液中分别加入浓度为为70%70%，8080，90 90，100%100%的乙醇，醇沉得多糖，并于的乙醇，醇沉得多糖，并于490nm490nm下测定下测定吸光度值以确定最佳乙醇浓度。吸光度值以确定最佳乙醇浓度。（7）热水浸提法提取蛹虫草菌丝体多糖的单因素分析）热水浸提法提取蛹虫草菌丝体多糖的单因素分析提取温度对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响提取温度对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响 按照上述提取工艺，并分别于
10、温度按照上述提取工艺，并分别于温度6060，7070，8080，9090，100100热水中浸提蛹虫草菌丝体多糖热水中浸提蛹虫草菌丝体多糖 ，并于，并于490nm490nm下测定吸光度值以确定最佳提取温度。下测定吸光度值以确定最佳提取温度。提取次数对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响提取次数对蛹虫草菌丝体多糖提取率的影响 按照上述提取工艺，分别热水浸提蛹虫草菌丝体多糖按照上述提取工艺，分别热水浸提蛹虫草菌丝体多糖1 1次，次，2 2次，次，3 3次，次，4 4次，次，5 5次，并于次，并于490nm490nm下测定吸光度值以确下测定吸光度值以确定最佳提取温度。定最佳提取温度。水平水平因因 素素提取温
11、度提取温度（）提取时间提取时间（h）液料比液料比（V/m）提起次数提起次数（次）（次）16024:1128037:123100410:13在单因素实验的基础上，选取四个主要影响在单因素实验的基础上，选取四个主要影响因素：乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温因素：乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度，进行度，进行L L9 9(3(34 4)正交实验，因素水平见表正交实验，因素水平见表1 1，以菌丝体多糖提取率为指标，确定最佳提取工以菌丝体多糖提取率为指标，确定最佳提取工艺。艺。（8）正交试验法优化热水浸提法提取蛹虫草菌丝体多糖）正交试验法优化热水浸提法提取蛹虫草菌丝体多糖提取方法提取方法 粗多糖质
12、量（粗多糖质量（g）吸光度值吸光度值A提取率提取率(%)热水浸提法法热水浸提法法0.20000.1110.983超声波提取法超声波提取法0.17650.0810.608微波提取法微波提取法0.16500.0720.495 通过表通过表1 1对提取率的比较，得出热水浸提法的效率最高，对提取率的比较，得出热水浸提法的效率最高，所以本实验对热水浸提法进行优化。所以本实验对热水浸提法进行优化。表表4 三种提取方法对菌丝体多糖提取率的影响三种提取方法对菌丝体多糖提取率的影响三、结果与讨论三、结果与讨论CDW图3-1 蛹虫草菌丝体多糖提取方法的比较CDW（1）液料比对多糖提取）液料比对多糖提取 率的影响率
13、的影响由图可知，当液料比为由图可知，当液料比为10:1时，多糖的提取率达时，多糖的提取率达到最高，此时多糖的已趋到最高，此时多糖的已趋于饱和，再大的提取液不于饱和，再大的提取液不能提高蛹虫草菌丝体多糖能提高蛹虫草菌丝体多糖的提取率。的提取率。热水浸提法提取蛹虫草菌丝体多糖的单因素分析热水浸提法提取蛹虫草菌丝体多糖的单因素分析CDW（2）提取时间对多糖提取）提取时间对多糖提取率的影响率的影响由图可知，提取时间对多由图可知，提取时间对多糖提取率的影响较为明显，糖提取率的影响较为明显，随着提取时间的增加，多随着提取时间的增加，多糖的提取率也增加，糖的提取率也增加，3h为为最佳提取时间。最佳提取时间。
14、CDW（3）乙醇浓度对多糖提取率）乙醇浓度对多糖提取率 的影响的影响实验结果表明，随着乙醇浓度实验结果表明，随着乙醇浓度的提高，菌丝体多糖的提取率的提高，菌丝体多糖的提取率变化不大，可能是低浓度的乙变化不大，可能是低浓度的乙醇已使多糖大量析出。有图可醇已使多糖大量析出。有图可知，确定知，确定90%的乙醇对多糖提的乙醇对多糖提取效果最佳。取效果最佳。CDW（4）提取温度对多糖提取率）提取温度对多糖提取率的影响的影响实验结果表明，提取温度对多实验结果表明，提取温度对多糖提取率的影响最为明显，当糖提取率的影响最为明显，当提取温度为提取温度为80 时，菌丝体时，菌丝体多糖的提取率最大。过低或过多糖的提
15、取率最大。过低或过高的温度都会降低多糖的提取高的温度都会降低多糖的提取率。率。CDW（5）提取次数对多糖提取）提取次数对多糖提取率的影响率的影响由图可知，提取由图可知，提取3次为最佳次为最佳提取次数少于提取次数少于3次多糖不能次多糖不能够完全提取出来，若多于够完全提取出来，若多于3次只会造成更多的浪费。次只会造成更多的浪费。试验号试验号因素因素多糖提取率多糖提取率（%）A AB BC CD D温度温度提取时间提取时间液料比液料比提取次数提取次数1 11 11 11 11 10.9550.9552 21 12 22 22 21.0341.0343 31 13 33 33 30.9820.9824
16、 42 21 12 23 30.9950.9955 52 22 23 31 11.0341.0346 62 23 31 12 21.0611.0617 73 31 13 32 21.0211.0218 83 32 21 13 30.9820.9829 93 33 32 21 10.9680.968均值均值1 10.990.990.990.991.001.000.9860.986均值均值2 21.031.031.021.020.990.991.021.02均值均值3 30.990.991.001.001.011.010.9860.986R R0.040.040.030.030.020.020.0
17、340.034正交试验法优化热水浸提法提取蛹虫草菌丝体多糖正交试验法优化热水浸提法提取蛹虫草菌丝体多糖最佳提取条件最佳提取条件 提取温度：提取温度：80 提取时间：提取时间：3h 液液 料料 比：比：10：1 提取次数：提取次数：3次次 蛹虫草菌丝体多糖提取条件的主次因素顺序为：蛹虫草菌丝体多糖提取条件的主次因素顺序为：四、实验结论四、实验结论超声波提取法提取时间短，温度低可保护有效成分，杂质超声波提取法提取时间短，温度低可保护有效成分，杂质 少，操作简单易行，但提取效率略低于热水浸提法。少，操作简单易行，但提取效率略低于热水浸提法。微波助提取法提取时间短，杂质少，操作简单易行，无污微波助提取
18、法提取时间短，杂质少，操作简单易行，无污染，但提取率略低于热水浸提法和超声波法。染，但提取率略低于热水浸提法和超声波法。热水浸提法操作简易热水浸提法操作简易,条件易控制条件易控制,结果精准结果精准,提取率最高，适合提取率最高，适合蛹虫草菌丝体中多糖的提取、分离纯化。在单因素试验的基础上蛹虫草菌丝体中多糖的提取、分离纯化。在单因素试验的基础上，经正交试验确定了提取菌丝体多糖的最佳工艺条件：提取温度，经正交试验确定了提取菌丝体多糖的最佳工艺条件：提取温度80，提取次数为，提取次数为3次，提取时间为次，提取时间为3h，液料比为，液料比为10:1。所得菌。所得菌丝体多糖的提取率为丝体多糖的提取率为1.06%。
